PCSK9疫苗本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年8月23日的第201080049440.6號(hào)發(fā)明名稱為“PCSK9疫苗”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及提供新的免疫原，其包含優(yōu)選與免疫原性載體連接的抗原性PCSK9肽，用于預(yù)防、治療或者減輕PCSK9相關(guān)疾病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些藥物、其免疫原性組合物及藥物組合物的生產(chǎn)方法以及它們?cè)卺t(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用。背景前蛋白轉(zhuǎn)換酶(Proproteinconvertase)枯草桿菌蛋白酶-kexin9型(后文稱作PCSK9)，也稱作神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換酶1(neuralapoptosis-regulatedconvertase1，NARC-I)，其是一種蛋白酶K樣subtilase，被鑒別為哺乳動(dòng)物PCSK家族第9個(gè)成員，見Seidahetal,2003PNAS100:928-933所述。PCSK9基因位于人染色體1p33-p34.3。PCSK9在能增殖和分化的細(xì)胞中表達(dá)，包括例如肝細(xì)胞、腎間充質(zhì)細(xì)胞、回腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞以及胚胎端腦神經(jīng)元。PCSK9最初的合成是～72-kDa的無活性酶前體形式或者酶原形式，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中經(jīng)歷自身催化、分子內(nèi)加工以激活其功能性。人PCSK9的基因序列的長(zhǎng)度為～22-kb，具有12個(gè)外顯子，編碼692個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，所述基因序列可見于例如DepositNo.NP_777596.2。人、小鼠和大鼠PCSK9核酸序列已經(jīng)保藏，參見例如分別為GenBankAccessionNo:AX127530(也稱作AX207686)、AX207688和AX207690。人PCSK9是一種分泌蛋白，主要在腎、肝和腸中表達(dá)。其具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：抑制性前結(jié)構(gòu)域(pro-domain)(第1-152位氨基酸，包括在第1-30位氨基酸的信號(hào)序列)、催化結(jié)構(gòu)域(第153-448位氨基酸)以及長(zhǎng)度為210個(gè)殘基的富含半胱氨酸殘基的C末端結(jié)構(gòu)域(第449-692位氨基酸)。PCSK9作為酶原被合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)歷在前結(jié)構(gòu)域與催化結(jié)構(gòu)域之間的自身催化裂解。所述前結(jié)構(gòu)域在裂解后保持與成熟蛋白質(zhì)結(jié)合，分泌復(fù)合物。富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域可能發(fā)揮與其它弗林蛋白酶/Kexin/枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的P-(加工)結(jié)構(gòu)域相似的作用，其似乎是激活的蛋白酶的折疊和調(diào)節(jié)所必需的。PCSK9中的突變與血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)的異常水平相關(guān)(Hortonetal.,2006Trends.Biochem.Sci.32(2):71-77)。PCSK9在肝細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分化中起作用(Seidahetal,如前)，在胚胎肝中高表達(dá)，且明顯參與膽固醇穩(wěn)態(tài)。鑒別有效治療心血管疾病的化合物和/或藥劑是高度期望的。在臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)LDL膽固醇水平的降低與冠狀動(dòng)脈病癥的比率直接相關(guān)，見Lawetal,2003BMJ326:1423-1427。此外，近來已經(jīng)示出血漿LDL膽固醇水平中等程度終生降低與冠狀動(dòng)脈病癥發(fā)生率的實(shí)質(zhì)降低實(shí)質(zhì)相關(guān)，見Cohenetal,如前所述。甚至在具有非脂質(zhì)相關(guān)心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的高流行性群體中也見到如此狀況，見如前所述。因此，很重要的是鑒別可以控制LDL膽固醇水平的治療劑。因此，很重要的是產(chǎn)生抑制或者拮抗PCSK9活性及PCSK9在各種治療病癥中發(fā)揮的相應(yīng)作用的藥物。PCSK9的表達(dá)或上調(diào)與增高的血漿LDL膽固醇水平相關(guān)，PCSK9的抑制或者表達(dá)缺失與低LDL膽固醇血漿水平相關(guān)。顯然，與PCSK9中序列變異相關(guān)的較低水平的LDL膽固醇賦予針對(duì)冠心病的保護(hù)作用，見Cohen,2006N.Engl.J.Med.354:1264-1272。發(fā)明概述本發(fā)明涉及免疫原，其包含抗原性PCSK9肽及任選存在的免疫原性載體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生任選地與免疫原性載體連接的這種抗原性PCSK9肽的方法。本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含任選地與免疫原性載體連接的這種抗原性PCSK9肽，任選地包含一或多種佐劑，優(yōu)選一或兩種佐劑。本發(fā)明另一方面涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物，以及涉及這種組合物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物用作藥物，優(yōu)選用于治療、減輕或預(yù)防PCSK9相關(guān)疾病。本發(fā)明特別涉及本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物用作藥物，優(yōu)選用于治療、減輕或預(yù)防與膽固醇水平增高相關(guān)的疾病。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽特別適于治療患有增高的LDL-膽固醇或者與增高的LDL-膽固醇相關(guān)的病癥的病人或者處于增高的LDL-膽固醇或者與增高的LDL-膽固醇相關(guān)的病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的病人，所述病癥如脂質(zhì)失調(diào)(如高脂血癥，I型、II型、III型、IV型或者V型高脂血癥，繼發(fā)高甘油三酯血癥，高膽固醇血癥，家族性高膽固醇血癥，黃瘤病，膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽也適于治療患有動(dòng)脈硬化病癥(如動(dòng)脈硬化)、冠狀動(dòng)脈疾病、心血管疾病的病人，以及處于這些病癥風(fēng)險(xiǎn)中的病人，例如由于存在一或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子(如高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖或者高同型半胱氨酸血癥)所致。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物在制備治療阿爾茲海默病的藥物中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物與另一種藥劑一起施用。附圖簡(jiǎn)述圖1:與LDL-R(3BPS)的EGF-A結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人PCSK9的PDB結(jié)構(gòu)，示出PCSK9中的5個(gè)肽序列(肽1-5)，它們被選擇是因?yàn)閰⑴c這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。圖2:使用明礬加CpG作為佐劑，小鼠用綴合于VLP的肽VR_9.1至VR_9.9免疫，針對(duì)全長(zhǎng)重組人PCSK9的抗體應(yīng)答通過在ELISA測(cè)定中滴定血清而測(cè)量。結(jié)果顯示為每組6只小鼠每一個(gè)的效價(jià)倒數(shù)，效價(jià)倒數(shù)測(cè)量為給出0.5的光密度讀數(shù)的血清稀釋度。圖3:如圖2所述的針對(duì)全長(zhǎng)重組小鼠PCSK9蛋白的抗體應(yīng)答。圖4:在接種小鼠的血清中測(cè)量的血漿膽固醇水平(與用于圖2和圖3中抗體測(cè)定相同的樣品)。圖5:在不同稀釋度測(cè)試了圖2和圖4中使用的血漿樣品的抑制重組PCSK9和LDL受體的胞外結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的能力，由FRET測(cè)定測(cè)量。圖6:在FRET測(cè)定中來自肽VR_9.5和VR_9.6免疫接種的血漿樣品的稀釋度，顯示出對(duì)PCSK9和LDL受體之間的相互作用的劑量應(yīng)答性抑制。圖7:來自PDB:3BPS的PCSK9(條帶(ribbon))和EGF-A(空間填充)的復(fù)合物。PCSK9的可能與除EGF-A之外的LDLR結(jié)構(gòu)域相互作用的潛在區(qū)域由橢圓形示出。圖8:PCSK9(條帶)和EGF-A(空間填充)的復(fù)合物，顯示了相應(yīng)于肽VR_13/14(A)和VR_15/16(B)和VR_9.5(C)的氨基酸。圖9和圖10:用肽VR_9.5和VR_9.10至VR_9.16免疫接種的小鼠的血漿抗體應(yīng)答。針對(duì)小鼠PCSK9的抗體通過使用全長(zhǎng)小鼠PCSK9蛋白進(jìn)行的系列血漿稀釋液的ELISA測(cè)定而測(cè)量。顯示了每組8只小鼠的個(gè)體效價(jià)曲線，以來自用未綴合的VLP免疫接種小鼠血漿的ELISA應(yīng)答作為對(duì)照。圖11:在用綴合于VLP(使用明礬+/-CpG作為佐劑)或者CRM197(使用TiterMax作為佐劑)的肽VR_9.5或VR_9.10免疫接種的BALB/c和C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的針對(duì)全長(zhǎng)人PCSK9蛋白的血清抗體應(yīng)答。針對(duì)人PCSK9的抗體通過在ELISA測(cè)定中滴定血清而測(cè)量。結(jié)果顯示為對(duì)每組8只小鼠的每一個(gè)在1.0光密度確定的效價(jià)倒數(shù)的對(duì)數(shù)值。圖12:在如圖11所述免疫接種的BALB/c和C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的針對(duì)全長(zhǎng)小鼠PCSK9蛋白的血清抗體應(yīng)答。結(jié)果顯示為對(duì)每組8只小鼠的每一個(gè)在0.5光密度確定的效價(jià)倒數(shù)的對(duì)數(shù)值。圖13:在取自BALB/c免疫接種小鼠的血清樣品中測(cè)量的總膽固醇水平(與用于圖11和12中抗體測(cè)定相同的樣品)。圖14:在取自C57BL/6免疫接種小鼠的血清樣品中測(cè)量的總膽固醇水平(與用于圖11和12中抗體測(cè)定相同的樣品)。圖15:在用明礬加CpG作為佐劑用綴合于VLP的肽VR_9.5或VR_9.17至VR_9.35免疫接種的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的針對(duì)全長(zhǎng)人PCSK9的抗體應(yīng)答。針對(duì)人PCSK9的抗體通過在ELISA測(cè)定中滴定血清而測(cè)量。結(jié)果顯示為對(duì)每組8只小鼠的每一個(gè)在1.0光密度確定的效價(jià)倒數(shù)的對(duì)數(shù)值。圖16:在如圖15所述免疫接種的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的針對(duì)全長(zhǎng)小鼠PCSK9的抗體應(yīng)答。針對(duì)小鼠PCSK9的抗體通過在ELISA測(cè)定中滴定血清而測(cè)量。結(jié)果顯示為對(duì)每組8只小鼠的每一個(gè)在0.5光密度確定的效價(jià)倒數(shù)的對(duì)數(shù)值。圖17：在取自BALB/c免疫接種小鼠的血清樣品中測(cè)量的總膽固醇水平(與用于圖15和16中抗體測(cè)定相同的樣品)。圖18:PCSK9(條帶)和EGF-A(空間填充)的復(fù)合物，含有功能獲得或功能喪失性突變相關(guān)的氨基酸序列和/或蛋白質(zhì)表面暴露表位的PCSK9區(qū)域由橢圓形示出。圖19:附著有抗原性肽的多價(jià)模板的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的抗原性PCSK9肽本發(fā)明涉及免疫原，其包含任選地與免疫原性載體連接的抗原性PCSK9肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的包含4-20個(gè)氨基酸的一部分，當(dāng)將其施用給對(duì)象時(shí)能降低所述對(duì)象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的參與PCSK9與LDL受體相互作用的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的參與PCSK9與LDL受體相互作用的部分，其包含4-20個(gè)氨基酸，且當(dāng)施用給對(duì)象時(shí)能降低所述對(duì)象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587和588。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:1-312、330-398、421、423、424、426及428-588。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397和398。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能參與LDL受體的EGF-A結(jié)構(gòu)域的相互作用的部分。這部分的實(shí)例在圖1中示出。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能參與與LDL受體的結(jié)構(gòu)域EGF-A的相互作用的部分，包含4-20個(gè)氨基酸，且當(dāng)將其施用給對(duì)象時(shí)能降低所述對(duì)象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:1所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自：SEQIDNo:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:46所示PCSK9片段的5-15個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100和101。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:102所示PCSK9片段的5-14個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145和146。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:147所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180和181。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:182所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和226。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:330所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358和359。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:19、56、63、109、153、165、184、186、187、188、332和424。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:19、56、63、109、153和184。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:56、184、186、187、188和332。在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQIDNo:56所示序列的肽。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQIDNo:184或187所示序列的肽。在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQIDNo:184所示序列的肽。在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQIDNo:332所示序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽在PCSK9的可能參與與除了EGF-A結(jié)構(gòu)域之外的LDL受體區(qū)域相互作用的區(qū)域中選擇。這部分的實(shí)例在圖7和8中示出。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能參與與除了EGF-A結(jié)構(gòu)域之外的LDL受體區(qū)域相互作用的部分，包含4-20個(gè)氨基酸，且當(dāng)將其施用給對(duì)象時(shí)能降低所述對(duì)象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:227所示PCSK9片段的5-12個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261和262。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:263所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306和307。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:360所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397和398。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽在PCSK9前結(jié)構(gòu)域的區(qū)域(SEQIDNo:329)中選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9前結(jié)構(gòu)域的一部分，包含4-20個(gè)氨基酸，且當(dāng)將其施用給對(duì)象時(shí)能降低所述對(duì)象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:308、309、310、311和312。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:309所示PCSK9片段的5-12個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:309、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:508所示PCSK9片段的5-12個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542和543。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:310所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:310、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506和507。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQIDNo:544所示PCSK9片段的5-13個(gè)、優(yōu)選6-8個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587和588。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:312、421、422、423、426、427、428、445、482、525和563。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQIDNo:445、482、525和563。在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQIDNo:445所示序列的肽。這種抗原性PCSK9肽可以單獨(dú)使用或者組合使用，優(yōu)選當(dāng)與免疫原性載體結(jié)合時(shí)，以誘導(dǎo)對(duì)象體內(nèi)自身抗-PCSK9抗體，用以治療、預(yù)防或者減輕PCSK9-相關(guān)疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然已知哪種技術(shù)可用于證實(shí)某特定構(gòu)建體是否落入本發(fā)明范圍內(nèi)。這種技術(shù)包括但不限于在本申請(qǐng)實(shí)施例章節(jié)描述的技術(shù)及下文所述技術(shù)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽誘導(dǎo)自身抗-PCSK9抗體的能力可以使用本申請(qǐng)實(shí)施例3所述測(cè)試在小鼠中測(cè)量。由本發(fā)明抗原性PCSK9肽誘導(dǎo)的自身抗體降低循環(huán)血漿膽固醇水平的能力可以使用實(shí)施例3所述測(cè)試在小鼠中測(cè)量。本發(fā)明抗原性PCSK9肽誘導(dǎo)的自身抗體抑制PCSK9與LDL受體之間相互作用的能力可以通過使用實(shí)施例3所述測(cè)試(FRET測(cè)定)直接測(cè)量，或者通過測(cè)量細(xì)胞表面LDL受體的上調(diào)而間接測(cè)量(如相關(guān)文獻(xiàn)中所述，使用體外細(xì)胞系或者通過測(cè)量(例如通過Western印跡)抗體表達(dá)動(dòng)物的肝活檢組織中的LDL受體水平進(jìn)行)，所述細(xì)胞表面LDL受體的上調(diào)是阻斷PCSK9介導(dǎo)的下調(diào)的結(jié)果。術(shù)語“抗原性PCSK9肽生物學(xué)活性”當(dāng)在本文使用時(shí)是指本發(fā)明的抗原性PCSK9肽在患者體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗PCSK9抗體的能力。優(yōu)選地，當(dāng)將所述抗原性PCSK9肽施用給對(duì)象時(shí)，其能降低所述對(duì)象血液中的LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽是這樣的大小，由此其模擬選自其中發(fā)現(xiàn)天然表位的整個(gè)PCSK9結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽長(zhǎng)度少于100個(gè)氨基酸，優(yōu)選少于75個(gè)氨基酸，更優(yōu)選少于50個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選少于40個(gè)氨基酸。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的長(zhǎng)度典型為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個(gè)氨基酸，優(yōu)選4-20個(gè)氨基酸，例如6-12個(gè)、6-8個(gè)或者9-12個(gè)氨基酸。本發(fā)明抗原性PCSK9肽的具體實(shí)例在序列表中提供，包括長(zhǎng)度范圍為5-17個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的抗原性肽包括衍生自哺乳動(dòng)物PCSK9、優(yōu)選人PCSK9(SEQIDNo:399)或小鼠PCSK9(SEQIDNo:400)、更優(yōu)選人PCSK9的一部分的氨基酸序列，這種衍生的PCSK9部分相應(yīng)于天然發(fā)生的PCSK9的氨基酸序列或者相應(yīng)于變體PCSK9的氨基酸序列，即其中取代、添加或缺失少數(shù)氨基酸但基本保留相同免疫學(xué)性質(zhì)的天然發(fā)生的PCSK9的氨基酸序列。此外，這種衍生的PCSK9部分可以通過氨基酸、特別是N末端和C末端氨基酸進(jìn)一步修飾，以使得所述抗原性PCSK9肽是構(gòu)象限制的和/或使得所述抗原性PCSK9肽在進(jìn)行適當(dāng)化學(xué)處理后能偶聯(lián)免疫原性載體。本文揭示的抗原性PCSK9肽涵蓋了衍生自PCSK9氨基酸序列的功能活性變體肽，其中一些氨基酸被缺失、插入或者取代，同時(shí)基本上不降低其免疫學(xué)性質(zhì)，即這種功能活性變體肽保留實(shí)質(zhì)的抗原性PCSK9肽生物學(xué)活性。典型地，這種功能變體肽與選自SEQIDNo:1-312、330-398及420-588的氨基酸序列具有氨基酸序列同源性，優(yōu)選高度同源。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種功能活性變體肽與選自SEQIDNo:1-312、330-398及420-588的氨基酸序列呈現(xiàn)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者95％相同性。多肽序列相似性也稱作序列相同性典型是使用序列分析軟件測(cè)量的。蛋白質(zhì)分析軟件使用賦予各種取代、缺失及其它修飾包括保守氨基選取代的相似性測(cè)量而匹配相似序列。例如，GCG含有程序如“Gap”和“Bestfit”，其可以使用默認(rèn)參數(shù)確定密切相關(guān)多肽如來自不同物種生物體的同源多肽之間或者野生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白之間的序列同源性或者序列相同性。見例如GCGVersion6.1。多肽序列也可以使用利用默認(rèn)參數(shù)或者推薦參數(shù)的FASTA進(jìn)行對(duì)比，GCGVersion6.1.FASTA(如FASTA2和FASTA3)中的一個(gè)程序提供了查詢序列與搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的排列對(duì)比和序列相同性百分比(Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990)；Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000))。當(dāng)將本發(fā)明的序列與含有大量來自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比時(shí)，另一種算法是使用默認(rèn)參數(shù)的計(jì)算機(jī)程序BLAST，特別是blastp或tblastn。見例如Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)、Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-402(1997)所述。功能活性變體包含天然發(fā)生的功能活性變體，如等位基因變體和種變體以及可通過例如誘變技術(shù)或者通過直接合成方法產(chǎn)生的非天然發(fā)生的功能活性變體。功能活性變體與SEQIDNo:1-312、330-398和420-588所示任何肽具有大約如1、2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基不同，且仍保留抗原性PCSK9生物學(xué)活性。在這種對(duì)比需要排列對(duì)比時(shí)，以最大同源性排列對(duì)比所述序列。變異的位點(diǎn)可以發(fā)生在所述肽中的任何位置，只要所述生物學(xué)活性與SEQIDNo:1-312、330-398和420-588所示肽基本上相似即可。關(guān)于怎樣產(chǎn)生表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)在Bowieetal.,Science,247:1306-1310(1990)中提供，其教導(dǎo)有兩種主要策略研究氨基酸序列對(duì)改變的耐受性。第一種策略采用在進(jìn)化過程期間通過天然選擇的氨基酸取代的耐受性。通過在不同物種中對(duì)比氨基酸序列，可以鑒別在物種之間保守的氨基酸位置。這些保守的氨基酸對(duì)于蛋白質(zhì)功能可能是重要的。相反，其中取代已經(jīng)被天然選擇耐受的氨基酸位置表示對(duì)于蛋白質(zhì)功能不是關(guān)鍵的位置。因此，可以修飾耐受氨基酸取代的位置，同時(shí)仍保留所述修飾的肽的特異性免疫原性活性。第二種策略使用遺傳工程以在克隆的基因的特定位置導(dǎo)入氨基酸改變以鑒別對(duì)于蛋白質(zhì)功能關(guān)鍵的區(qū)域。例如，可以使用位點(diǎn)定向誘變或者丙氨酸掃描誘變技術(shù)(Cunninghametal.,Science,244:1081-1085(1989))。然后可以檢測(cè)所得變體肽的特異性抗原性PCSK9生物學(xué)活性。根據(jù)Bowieetal.所述，這兩種策略已經(jīng)揭示了蛋白質(zhì)對(duì)于氨基酸取代是令人驚奇地耐受。該作者進(jìn)一步指出哪些氨基酸改變?cè)谠摰鞍踪|(zhì)某些氨基酸位置可能是容許的。例如，最深藏或內(nèi)部(在蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi))的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而少數(shù)表面或外部側(cè)鏈的特征通常是保守的。在蛋白質(zhì)的氨基酸中導(dǎo)入突變的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。見例如Ausubel(ed.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.(1994)、T.Maniatis,E.F.FritschandJ.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborlaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))所述。突變也可以通過使用可商購(gòu)試劑盒如QuikChangeTM位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene)或者直接通過肽合成方法導(dǎo)入。通過置換不顯著影響抗原性PCSK9肽功能的氨基酸而產(chǎn)生所述抗原性PCSK9肽的功能活性變體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員完成?？梢栽诒景l(fā)明的肽之一中進(jìn)行的氨基酸取代的類型是保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲邪被釟埢删哂邢嗨苹瘜W(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基團(tuán)的另一氨基酸殘基取代。通常，保守氨基酸取代基本上不改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩或多個(gè)氨基酸序列由于保守取代而彼此不同的情況中，序列相同性百分比或者相似性程度可以向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。進(jìn)行這種調(diào)整的方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。見例如Pearson,MethodsMol.Biol.243:307-31(1994)。具有相似化學(xué)性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸組的實(shí)例包括：1)脂肪族側(cè)鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3)含有酰胺的側(cè)鏈：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈：賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈：天冬氨酸和谷氨酸；及7)含硫側(cè)鏈：半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘?，保守置換是在PAM250log似然矩陣(likelihoodmatrix)中具有正值的任何改變，見Gonnetetal.,Science256:1443-45(1992)揭示?！爸械缺Ｊ亍敝脫Q是在PAM250log似然矩陣中具有非負(fù)值的任何改變。功能活性變體肽也可以通過使用雜交技術(shù)分離。簡(jiǎn)而言之，使用與編碼感興趣肽如SEQIDNo:1-312、330-398和420-588的完整或部分核酸序列具有高度同源性的DNA制備功能活性肽。因此，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽還包括這樣的肽，其與SEQIDNo:1-312、330-398及420-588所示一或多個(gè)肽功能等價(jià)且由與編碼SEQIDNo:1-312、330-398及420-588任一的核酸或者其互補(bǔ)體雜交的核酸分子編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用易于獲得的密碼子表而容易地確定編碼本發(fā)明肽的核酸序列。如此，這些核酸序列在本文未示出。編碼是功能活性變體的肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸的雜交嚴(yán)格性是例如10％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart’s溶液和1×鮭精DNA(低嚴(yán)格條件)。更優(yōu)選的條件是25％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart’s溶液和1×鮭精DNA(中等嚴(yán)格條件)，更優(yōu)選的條件是50％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart’s溶液及1×鮭精DNA(高嚴(yán)格條件)。然而，除了上述甲酰胺濃度之外還有一些因素影響雜交嚴(yán)格性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x擇這些因素實(shí)現(xiàn)相似嚴(yán)格性。編碼功能活性變體的核酸分子也可以通過基因擴(kuò)增方法如PCR方法分離，使用編碼感興趣的肽、多肽或者蛋白質(zhì)如SEQIDNo:1-312、330-398和420-588所示任一肽的核酸分子的一部分作為探針。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽衍生自天然來源且分離自哺乳動(dòng)物如人、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、貓、狗、馬、小鼠或者大鼠，優(yōu)選分離自人來源。本發(fā)明的肽因此可通過使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離自細(xì)胞或組織來源?；蛘?，本發(fā)明的肽可以通過化學(xué)合成或者使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的肽可以通過本領(lǐng)域熟知的固相方法合成。合適的合成可以通過利用T-boc或F-moc程序進(jìn)行。環(huán)肽可以通過固相方法合成，使用本領(lǐng)域熟知的F-moc程序及在完全自動(dòng)化設(shè)備中的聚酰胺樹脂進(jìn)行?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能獲知手工進(jìn)行這些方法必需的實(shí)驗(yàn)室程序。關(guān)于固相合成方法的技術(shù)和程序在SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach’byE.AthertonandR.C.Sheppard,publishedbyIRLatOxfordUniversityPress(1989)及’MethodsinMolecularBiology,Vol.35:PeptideSynthesisProtocols(ed.M.W.PenningtonandB.M.Dunn),chapter7,pp91-171byD.Andreauetal中描述?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入可以在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的表達(dá)載體中，隨后分離或者純化感興趣的表達(dá)的肽、多肽或者蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域可獲得許多細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動(dòng)物和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，可以使用任何這種表達(dá)系統(tǒng)。任選地，編碼本發(fā)明肽的多核苷酸可以在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中翻譯。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽也可以包含由于存在多個(gè)基因、可變轉(zhuǎn)錄事件、選擇性RNA剪接事件及可變翻譯和翻譯后事件而產(chǎn)生的那些肽。肽可以在這樣的系統(tǒng)如培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)，所述系統(tǒng)導(dǎo)致與當(dāng)所述肽在天然細(xì)胞中表達(dá)時(shí)所存在的基本上相同的翻譯后修飾，或者在這樣的系統(tǒng)中表達(dá)，所述系統(tǒng)導(dǎo)致當(dāng)在天然細(xì)胞中表達(dá)時(shí)存在的翻譯后修飾如糖基化或裂解的改變或喪失。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以作為融合蛋白產(chǎn)生，其含有其它非-PCSK9或非-PCSK9-衍生氨基酸序列，如本文定義的氨基酸接頭或者信號(hào)序列或者免疫原性載體，以及可用于蛋白質(zhì)純化的配體，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)簽和葡萄球菌A蛋白。在融合蛋白中可存在一種以上本發(fā)明的抗原性PCSK9肽。所述異源多肽可以融合于例如本發(fā)明肽的N末端或C末端。本發(fā)明的肽也可以作為包含同源氨基酸序列即其它PCSK9或PCSK9-衍生序列的融合蛋白而產(chǎn)生。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以是線性的或者是構(gòu)象限制的。如本文在提及肽時(shí)所用，術(shù)語“構(gòu)象限制的(conformationallyconstrained)”是指這樣的肽，其中三維結(jié)構(gòu)在一個(gè)空間排列中隨著時(shí)間而基本上得以保持。構(gòu)象限制的分子可具有改良的性質(zhì)，如增加的親和性、代謝穩(wěn)定性、膜通透性或者溶解性。此外，預(yù)期這種構(gòu)象限制的肽以與其天然環(huán)狀構(gòu)象相似的構(gòu)象呈遞抗原性PCSK9表位，從而誘導(dǎo)抗-PCSK9抗體更易于識(shí)別完整的天然自身PCSK9分子或者具有識(shí)別自身PCSK9分子的增加的親和性。構(gòu)象限制的方法為本領(lǐng)域熟知，包括但不限于橋連和環(huán)化?，F(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域已知在線性肽中導(dǎo)入構(gòu)象限制的一些方法。例如，在肽的兩個(gè)相鄰氨基酸之間的橋連導(dǎo)致局部構(gòu)象修飾，其柔性與常規(guī)肽相比受限。形成這種橋連的一些可能性包括摻入內(nèi)酰胺和piperazinones(綜述參見Giannisand.Kolter,Angew.Chem.Int.Ed.,1993,32:1244)。如本文在提及肽時(shí)所用，術(shù)語“環(huán)狀”是指包括兩個(gè)非相鄰氨基酸或氨基酸類似物之間的分子內(nèi)鍵的結(jié)構(gòu)。所述環(huán)化可以通過共價(jià)或非共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)。分子內(nèi)鍵包括但不限于主鏈-主鏈，側(cè)鏈-主鏈，側(cè)鏈-側(cè)鏈，側(cè)鏈-末端基團(tuán)，末端-末端鍵。環(huán)化方法包括但不限于在肽的N末端殘基與C末端殘基之間形成酰胺鍵，在非相鄰氨基酸或氨基酸類似物之間形成二硫鍵，在Lys和Asp/Glu殘基側(cè)鏈之間形成酰胺鍵，在絲氨酸殘基與Asp/Glu殘基之間形成酯鍵，在例如一個(gè)氨基酸或其類似物的側(cè)鏈基團(tuán)與氨基末端殘基的N末端胺之間形成內(nèi)酰胺鍵，以及形成賴氨酸正亮氨酸和二酪氨酸鍵。也可以使用二硫鍵的碳形式，如乙烯基或乙基鍵(J.PeptideSc.,2008,14,898-902)以及與適當(dāng)多取代的親電子試劑如二-、三-或四鹵代烷進(jìn)行烷化反應(yīng)(PNAS,2008,105(40),15293-15298；ChemBioChem,2005,6,821-824)。各種修飾的脯氨酸類似物也可用于在肽中摻入構(gòu)象限制(Zhangetal.,J.MedChem.,1996,39:2738-2744；PfeiferandRobinson,Chem.Comm.,1998,1977-1978)?？捎糜诃h(huán)化本發(fā)明肽的化學(xué)方法獲得用包括但不限于內(nèi)酰胺鍵、腙鍵、肟鍵、噻唑烷鍵、硫醚鍵或锍鍵環(huán)化的肽。設(shè)計(jì)構(gòu)象限制肽的另一方法在US10/114918中描述，該方法是將感興趣的短氨基酸序列附著于模板，產(chǎn)生環(huán)狀限制的肽。這種環(huán)狀肽不僅通過其模板而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化，并從而呈現(xiàn)出可以模擬天然蛋白質(zhì)如病毒和寄生蟲上或者其自身蛋白質(zhì)(自體同源哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)如PCSK9)上構(gòu)象表位的三維構(gòu)象，而且其與線性肽相比對(duì)于在血清中的蛋白酶降解更具抗性。US10/114918進(jìn)一步揭示了構(gòu)象限制的交聯(lián)肽的合成方法，通過制備合成氨基酸用于主鏈偶聯(lián)至適當(dāng)位置的氨基酸以穩(wěn)定肽的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)可以通過正交保護(hù)的(2S,3R)-3-氨基脯氨酸殘基的伯胺基團(tuán)與適當(dāng)位置的谷氨酸側(cè)鏈羧基基團(tuán)的酰胺偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)。這種方法已被用于CS蛋白質(zhì)的構(gòu)象限制的四肽重復(fù)序列的制備，其中至少一個(gè)脯氨酸被(2S,3R)-3-氨基脯氨酸置換，以導(dǎo)入側(cè)鏈羧基，谷氨酸已經(jīng)摻入以置換丙氨酸。交聯(lián)策略還包括應(yīng)用Grubbs閉環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，以形成設(shè)計(jì)為模擬α-螺旋構(gòu)象的stapled肽(Angew.Int.Ed.Engl.,1998,37,3281；JACS,2000,122,5891)；使用多功能化糖；使用氨基羧乙基硫色氨酸鍵(ChemistryEu.J.,2008,24,3404-3409)；使用疊氮化物與炔的“click’”反應(yīng)，其可以作為側(cè)鏈氨基酸殘基摻入或者位于肽序列的主鏈內(nèi)(DrugDisc.Today,2003,8(24),1128-1137)。在文獻(xiàn)中也已知金屬離子通過隔離特定殘基如組氨酸(其協(xié)同金屬陽(yáng)離子)可穩(wěn)定線性肽的限制的構(gòu)象(Angew.Int.Ed.Engl.,2003,42,421)。相似地，用非天然酸功能化線性肽序列及胺功能性或者多胺和多酸功能性也可用于在激活及酰胺鍵形成之后實(shí)現(xiàn)環(huán)化結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述抗原性PCSK9肽是通過所述抗原性PCSK9肽的兩個(gè)非相鄰氨基酸(例如N末端和C末端氨基酸)的彼此分子內(nèi)共價(jià)鍵而構(gòu)象限制的。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽是通過共價(jià)結(jié)合支架分子而構(gòu)象限制的。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述抗原性PCSK9肽是簡(jiǎn)單限制的，即在任一末端(C或N末端)偶聯(lián)于支架分子或者通過未位于任一末端的另一氨基酸偶聯(lián)于支架分子。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗原性PCSK9肽是雙重限制的，即在C末端和N末端均偶聯(lián)所述支架分子。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗原性肽是通過異手性二脯氨酸單位(D-Pro-L-Pro)的模板作用環(huán)化而限制的(Spathetal,1998,HelveticaChimicaActa81,p1726-1738)。所述支架(也稱作平臺(tái))可以是能通過共價(jià)鍵降低所述抗原性PCSK9肽可采取的構(gòu)象數(shù)的任何分子。舉例的構(gòu)象限制支架包括蛋白質(zhì)和肽，例如脂籠蛋白相關(guān)分子，如含有硫氧還蛋白和硫氧還蛋白樣蛋白的β-桶，核酸酶(例如RNaseA)，蛋白酶(例如胰蛋白酶)，蛋白酶抑制劑(例如水蛭蛋白酶抑制劑C)，抗體或其結(jié)構(gòu)剛性片段，熒光蛋白如GFP或YFP，食魚螺毒素，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀區(qū)域，CTL-A4，以及病毒樣顆粒(VLP)。其它合適的平臺(tái)分子包括碳水化合物如瓊脂糖。所述平臺(tái)可以是線性或環(huán)狀分子，例如是閉合的以形成環(huán)。所述平臺(tái)通常與所述抗原性PCSK9肽是異源的。這種與平臺(tái)連接的構(gòu)象限制的肽與線性肽相比被認(rèn)為對(duì)于蛋白酶解更具抗性。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述支架是如本申請(qǐng)中定義的免疫原性載體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽在免疫原性載體上被簡(jiǎn)單限制。在另一實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽在免疫原性載體上被雙重限制。在這種方式中，所述抗原性PCSK9肽形成構(gòu)象限制的環(huán)結(jié)構(gòu)，其經(jīng)證實(shí)是作為細(xì)胞內(nèi)識(shí)別分子的特別合適的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以被修飾以便于與平臺(tái)綴合，例如通過在一或兩個(gè)末端加入末端半胱氨酸和/或通過加入接頭序列如雙甘氨酸頭或尾加末端半胱氨酸，用賴氨酸作為末端的接頭，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的進(jìn)行這種功能的任何其它接頭。關(guān)于這種接頭的詳細(xì)描述在后文揭示。也可以使用生物正交化學(xué)(bioorthogonalchemistry)(如上述click反應(yīng))，其使得全長(zhǎng)肽序列與載體偶聯(lián)，因此避免了任何區(qū)域化學(xué)(regiochemical)和化學(xué)選擇性問題。已知且可以使用剛性接頭如Jonesetal.Angew.Chem.Int.Ed.2002,41:4241-4244所述接頭激發(fā)改良的免疫學(xué)應(yīng)答。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽附著于多價(jià)模板，其自身與載體偶聯(lián)，因此增加抗原的密度(見下文)。所述多價(jià)模板可以是適當(dāng)功能化的聚合物或者寡聚物如(但不限于)寡谷氨酸或者寡殼聚糖(見圖19)。本發(fā)明的免疫原性載體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽與免疫原性載體分子連接，形成進(jìn)行免疫接種的免疫原，優(yōu)選其中所述載體分子與天然PCSK9分子不相關(guān)。本文所用術(shù)語“免疫原性載體”包括具有在宿主動(dòng)物體內(nèi)獨(dú)立激發(fā)免疫原性應(yīng)答性質(zhì)的那些材料，其能通過肽、多肽或蛋白質(zhì)中游離羧基、氨基或者羥基與所述免疫原性載體材料上相應(yīng)基團(tuán)之間的肽鍵或酯鍵的形成而直接共價(jià)偶聯(lián)于所述肽、多肽或者蛋白質(zhì)，或者通過常規(guī)雙功能連接基團(tuán)鍵合，或者是作為融合蛋白。用于本發(fā)明免疫原中的載體的類型為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。舉例的這種免疫原性載體是：血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅蛋白；血藍(lán)蛋白(特別是匙孔血藍(lán)蛋白[KLH])；聚賴氨酸；聚谷氨酸；賴氨酸-谷氨酸共聚物；含有賴氨酸或鳥氨酸的共聚物；脂質(zhì)體載體；結(jié)核菌素的純化蛋白質(zhì)衍生物(PPD)；失活的細(xì)菌毒素或類毒素，如破傷風(fēng)或白喉毒素(TT和DT)或者TT的片段C，CRM197(白喉毒素的非毒性但是抗原性等同變體)，其它DT點(diǎn)突變體，如CRM176、CRM228、CRM45(UchidaetalJ.Biol.Chem.218；3838-3844,1973)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107，及由Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc,1992所述其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp，Gln或Ser和/或Ala158突變?yōu)镚ly及在US4709017或US4950740中揭示的其它突變；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一或多個(gè)殘基的突變及在US5917017或US6455673中揭示的其它突變；或者在US5843711中揭示的片段，肺炎球菌溶血素(Kuoetal(1995)Infectlmmun63；2706-13)，包括以某種方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO04081515，PCT/EP2005/010258)或者dPLY-formol，PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列在WO00/37105或WO00/39299中揭示)以及Pht蛋白融合體，如PhtDE融合蛋白、PhtBE融合蛋白、PhtA-E(WO01/98334,WO03/54007,WO2009/000826),OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常從腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清組B中提取-EP0372501)，PorB(來自腦膜炎奈瑟氏菌)，PD(流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)蛋白D–見例如EP0594610B)，或者其免疫學(xué)功能等價(jià)物，合成肽(EP0378881，EP0427347)，熱激蛋白(WO93/17712，WO94/03208)，百日咳蛋白(WO98/58668，EP0471177)，細(xì)胞因子，淋巴因子，生長(zhǎng)因子或激素(WO91/01146)，包含來自不同病原體衍生抗原的多個(gè)人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白質(zhì)(Falugietal(2001)EurJImmunol31；3816-3824)，如N19蛋白(Baraldoietal(2004)Infectlmmun72；4884-7)，肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)，鐵吸收蛋白(WO01/72337)，艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO00/61761)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性載體是CRM197。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是病毒樣顆粒(VLP)，優(yōu)選重組病毒樣顆粒。如本文所用，術(shù)語“病毒樣顆?！笔侵割愃朴诓《镜墙?jīng)證實(shí)是非病原性的結(jié)構(gòu)。通常，病毒樣顆粒缺少至少一部分病毒基因組。病毒樣顆粒也可以通常通過異源表達(dá)而大量產(chǎn)生且是可易于純化的。本發(fā)明的病毒樣顆?？珊信c其基因組不同的核酸。本發(fā)明的病毒樣顆粒的典型及優(yōu)選的實(shí)施方案是病毒殼體，如相應(yīng)病毒、噬菌體或者RNA-噬菌體的病毒殼體。如本文所用，術(shù)語“噬菌體病毒樣顆?！笔侵高@樣的病毒樣顆粒，其類似噬菌體結(jié)構(gòu)，是非復(fù)制性和非感染性的，且缺少至少編碼噬菌體復(fù)制機(jī)構(gòu)的一或多個(gè)基因，及典型也缺少編碼使病毒附著于或者進(jìn)入宿主中的一或多個(gè)蛋白質(zhì)的一或多個(gè)基因。然而，這個(gè)定義應(yīng)也涵蓋這樣的噬菌體病毒樣顆粒，其中前述一或多個(gè)基因仍存在，但是是失活的，且因此也產(chǎn)生非復(fù)制性和非感染性噬菌體病毒樣顆粒。從RNA噬菌體外殼蛋白的180個(gè)亞基自主裝配形成的及任選地含有宿主RNA的殼體結(jié)構(gòu)在本文稱作“RNA噬菌體外殼蛋白的VLP”。特定實(shí)例是Qbeta、MS2、PP7或AP205外殼蛋白的VLP。例如在Qbeta外殼蛋白的特定情況中，所述VLP可只從QbetaCP亞基裝配(通過表達(dá)含有例如TAA終止密碼子的QbetaCP基因而產(chǎn)生，通過阻抑作用排除較長(zhǎng)的A1蛋白的任何表達(dá)，見Kozlovska,T.M.,etal.,Intervirology39:9-15(1996))，或者在殼體裝配中另外含有A1蛋白亞基。通常限制殼體裝配中QbetaA1蛋白相對(duì)于QbetaCP的百分比，以保證殼體形成。適合作為本發(fā)明免疫原性載體的舉例的VLP包括但不限于如下蛋白的VLP，即Qbeta，MS2，PP7，AP205，及其它噬菌體外殼蛋白，如下病毒殼體和核心蛋白，乙型肝炎病毒(Ulrich,etal.,VirusRes.50:141-182(1998))，麻疹病毒(Warnes,etal.,Gene160:173-178(1995))，Sindbis病毒，輪狀病毒(美國(guó)專利5,071,651和5,374,426)，口蹄疫病毒(Twomey,etal.,Vaccine13:1603-1610,(1995))，Norwalk病毒(Jiang,X.,etal.,Science250:1580-1583(1990)；Matsui,S.M.,etal.,JClin.Invest.87:1456-1461(1991))，逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白(PCT專利申請(qǐng)WO96/30523)，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl，乙型肝炎病毒的表面蛋白(WO92/11291)，人乳頭瘤病毒(WO98/15631)，人多瘤病毒(SasnauskasK.,etal.,Biol.Chem.380(3):381-386(1999)；SasnauskasK.,etal.,Generationofrecombinantvirus-likeparticlesofdifferentpolyomavirusesinyeast.3rdInterationalWorkshop"Virus-likeparticlesasvaccines."Berlin,September26-29(2001))，RNA噬菌體，Ty，fr噬菌體，GA-噬菌體，AP205-噬菌體，及特別是Qbeta-噬菌體，豇豆褪綠斑駁病毒，豇豆花葉病毒，人乳頭瘤病毒(HPV)，牛乳頭瘤病毒，豬細(xì)小病毒，細(xì)小病毒如B19，豬細(xì)小病毒(PPV)和犬細(xì)小病毒(CPV)，杯狀病毒(例如Norwalk病毒，兔出血病病毒[RHDV])，動(dòng)物嗜肝DNA病毒核心抗原VLP，絲狀/桿狀植物病毒，包括但不限于煙草花葉病毒(TMV)，馬鈴薯X病毒(PVX)，番木瓜花葉病毒(PapMV)，苜?；ㄈ~病毒(AlMV)，及石茅高粱花葉病毒(JGMV)，昆蟲病毒如禽獸棚病毒(FHV)和四病毒，多瘤病毒如鼠多瘤病毒(MPyV)，鼠親肺病毒(MPtV)，BK病毒(BKV)，以及JC病毒(JCV)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，用作本發(fā)明免疫原性載體的VLP不限于任何特定形式。所述顆?？梢允腔瘜W(xué)合成的或者通過生物方法合成，其可以是天然或者非天然的。例如，這種類型的實(shí)施方案包括病毒樣顆?；蛘咂渲亟M形式。在更特別的實(shí)施方案中，所述VLP可包含或者由已知形成VLP的任何病毒的重組多肽組成。所述病毒樣顆粒可進(jìn)一步包含或者另外由這種多肽的一或多個(gè)片段以及這種多肽的變體組成。多肽的變體與其野生型相應(yīng)物相比在氨基酸水平具有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或者99％相同性。適用于本發(fā)明中的變體VLP可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆?！奔翱捎米鳌懊庖咴暂d體”即可。本發(fā)明優(yōu)選的VLP包括HBV的殼體蛋白或者表面抗原(分別為HBcAg和HBsAg)或者其重組蛋白或片段，及RNA-噬菌體的外殼蛋白或者其重組蛋白或片段，更優(yōu)選Qbeta的外殼蛋白或者其重組蛋白或片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗原性PCSK9肽組合使用的免疫原性載體是HBcAg蛋白。可用于本發(fā)明中的舉例的HBcAg蛋白可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如包括但不限于HBV核心蛋白，如Yuanetal.,(J.Virol.73:10122-10128(1999))所述，及在WO00/198333、WO00/177158、WO00/214478、WO00/32227、WO01/85208、WO02/056905、WO03/024480和WO03/024481中描述。適用于本發(fā)明中的HBcAg可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆?！奔翱捎米鳌懊庖咴暂d體”即可?？捎糜诒景l(fā)明中的特別感興趣的HBcAg變體是其中一或多個(gè)天然存在的半胱氨酸殘基已經(jīng)被缺失或取代的那些變體。本領(lǐng)域熟知游離半胱氨酸殘基可涉及許多化學(xué)副反應(yīng)中，包括二硫化物置換，與例如在與其它物質(zhì)的組合治療中注射的或形成的化學(xué)物質(zhì)或代謝物反應(yīng)，或者在暴露于UV光時(shí)直接氧化反應(yīng)及與核苷酸反應(yīng)。因此可以產(chǎn)生毒性加合物，特別是考慮到HBcAg具有結(jié)合核酸的強(qiáng)烈傾向的事實(shí)。所述毒性加合物因此分布在物種多樣性之間，其可單獨(dú)以低濃度存在，但是當(dāng)總和在一起時(shí)達(dá)到毒性水平。見于上述事實(shí)，在已經(jīng)被修飾以除去天然存在的半胱氨酸殘基的疫苗組合物中使用HBcAg的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是當(dāng)抗原或抗原決定簇附著時(shí)毒性物質(zhì)可以結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)目減少或者完全消除。此外，本發(fā)明也可以使用加工形式的HBcAg，其缺少乙型肝炎核心抗原前體蛋白的N末端前導(dǎo)序列，特別是當(dāng)HBcAg是在未發(fā)生加工的條件下產(chǎn)生的情況中(例如在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá))。本發(fā)明的其它HBcAg變體包括：i)與野生型HBcAg氨基酸序列之一或者其亞部分(subportion)具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同性的多肽序列，使用常規(guī)的已知計(jì)算機(jī)程序確定；ii)C-末端截短突變體，包括其中從C末端已經(jīng)除去1、5、10、15、20、25、30、34或35個(gè)氨基酸的突變體；ii)N-末端截短突變體，包括其中從N末端已經(jīng)除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個(gè)氨基酸的突變體；iii)在N末端和C末端均截短的突變體，包括其中在N末端已經(jīng)除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個(gè)氨基酸及在C末端已經(jīng)除去1、5、10、15、20、25、30、34或35個(gè)氨基酸的HBcAg。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它HBcAg變體蛋白是被修飾以增強(qiáng)外源表位的免疫原性呈遞的那些變體，其中缺失一或多個(gè)四精氨酸重復(fù)，但是其中C末端半胱氨酸被保留(見例如WO01/98333)，以及嵌合C末端截短HBcAg，如在WO02/14478、WO03/102165和WO04/053091中描述的那些。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗原性PCSK9肽組合使用的免疫原性載體是HBsAg蛋白?？捎糜诒景l(fā)明中的HBsAg蛋白可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如包括但不限于在US5792463、WO02/10416和WO08/020331中描述的HBV表面蛋白。適用于本發(fā)明中的HBsAg可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆粒”及可用作“免疫原性載體”即可。在另一實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或多肽組合使用的免疫原性載體是Qbeta外殼蛋白。發(fā)現(xiàn)Qbeta外殼蛋白當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)自主裝配為殼體(KozlovskaTM.etal.,GENE137:133-137(1993))。獲得的殼體或者病毒樣顆粒示出二十面噬菌體樣殼體結(jié)構(gòu)，直徑為25nm及T＝3準(zhǔn)對(duì)稱。進(jìn)一步地，噬菌體Qss的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解決。所述殼體含有外殼蛋白的180個(gè)拷貝，其通過二硫鍵在共價(jià)五聚物和六聚物中連接(Golmohammadi,R.etal.,Structure4:5435554(1996))，導(dǎo)致Qbeta外殼蛋白的殼體的顯著穩(wěn)定性。Qbeta殼體蛋白也示出對(duì)于有機(jī)溶劑和變性劑的非同尋常的抗性。Qbeta外殼蛋白的殼體的高度穩(wěn)定性是一優(yōu)勢(shì)特征，特別是用于本發(fā)明哺乳動(dòng)物和人的免疫和接種中時(shí)?？捎糜诒景l(fā)明中的舉例的Qbeta外殼蛋白可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如在WO02/056905、WO03/024480、WO03/024481(以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文)中已經(jīng)廣泛描述，包括但不限于在PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中揭示的氨基酸序列，登記號(hào)VCBPQbeta是指QbetaCP，登記號(hào)AAA16663是指QbetaA1蛋白，及其變體，包括其中N末端甲硫氨酸被裂解的變體蛋白，缺失100、150或180個(gè)氨基酸的C末端截短形式的QbetaA1，已經(jīng)通過缺失或取代除去賴氨酸殘基或者通過取代或插入添加賴氨酸殘基而修飾的變體蛋白(見例如在WO03/024481中揭示的Qbeta-240、Qbeta-243、Qbeta-250、Qbeta-251和Qbeta-259，所述文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容援引加入)，以及與上述任何Qbeta核心蛋白顯示至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同性的變體。適用于本發(fā)明的變體Qbeta外殼蛋白可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆?！奔翱捎米鳌懊庖咴暂d體”即可。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以通過化學(xué)綴合或者通過遺傳工程化融合配偶體的表達(dá)而與免疫原性載體偶聯(lián)。所述偶聯(lián)非必需是直接偶聯(lián)，而是可以通過接頭序列偶聯(lián)。更通常地，在抗原性肽融合、綴合或另外附著于免疫原性載體的情況中，典型要在所述抗原性肽的一或兩個(gè)末端加入間隔或者接頭序列。這種接頭序列通常包含由細(xì)胞的內(nèi)體或者其它小泡區(qū)室的蛋白酶體、蛋白酶識(shí)別的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽作為與免疫原性載體的融合蛋白被表達(dá)。所述肽的融合可以通過插入在所述免疫原性載體一級(jí)序列中而實(shí)現(xiàn)，或者通過與所述免疫原性載體的N或C末端融合而實(shí)現(xiàn)。在后文當(dāng)提及肽與免疫原性載體的融合蛋白時(shí)，涵蓋與亞基序列任一端的融合或者在所述載體序列內(nèi)內(nèi)部插入所述肽。在后文提及融合時(shí)，其可以通過所述抗原性肽插入所述載體序列中、用所述抗原性肽取代所述載體的部分序列或者通過組合缺失、取代或插入而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)所述免疫原性載體是VLP時(shí)，嵌合抗原性肽-VLP亞基通常能自主裝配成VLP。展示與其亞基融合的表位的VLP在后文也稱作嵌合VLP。例如，EP0421635B描述了嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原顆粒在病毒樣顆粒中呈遞外源肽序列的應(yīng)用?？梢栽谒隹乖噪男蛄腥我欢思尤雮?cè)翼氨基酸殘基，所述抗原性肽序列與VLP亞基序列的任一端融合或者將這種肽序列內(nèi)部插入VLP亞基序列中。甘氨酸和絲氨酸殘基是在融合的肽加入側(cè)翼序列中特別優(yōu)選使用的氨基酸。甘氨酸殘基賦予另外的柔性，其可以降低外源序列與VLP亞基序列融合的潛在不穩(wěn)定效應(yīng)。在本發(fā)明一特定實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是HBcAgVLP。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了所述抗原性肽與HBcAg的N末端的融合蛋白(Neyrinck,S.etal.,NatureMed.5:11571163(1999))或者插入在所謂的主要免疫顯性區(qū)域(MIR)中(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98114(2001)),WO01/98333)，這些是本發(fā)明的特異實(shí)施方案。在MIR中有缺失的HBcAg的天然發(fā)生的變體也已經(jīng)有描述(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001))，與N或C末端的融合以及插入在MIR的相應(yīng)于與野生型HBcAg相比是缺失位點(diǎn)的位置是本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案。與C末端的融合也已經(jīng)有描述(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于發(fā)現(xiàn)關(guān)于怎樣使用傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建融合蛋白的指導(dǎo)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了編碼HBcAg和HBcAg融合蛋白及可用于表達(dá)HBcAg和HBcAg融合蛋白的載體和質(zhì)粒(Pumpens,P.and#38；Grens,E.Intervirology44:98-114(2001),Neyrinck,S.etal.,NatureMed.5:1157-1163(1999))，其可用于實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)化自主裝配效力及展示插入在HBcAg的MIR中的表位的一個(gè)重要因素是插入位點(diǎn)的選擇，以及在插入時(shí)從HBcAg序列MIR內(nèi)缺失的氨基酸數(shù)目(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001)；EP0421635；美國(guó)專利No.6,231,864)，或者換句話說，HBcAg的哪些氨基酸用新表位取代。例如，已經(jīng)描述了用外源表位取代HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或者80-81(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001)；EP0421635；US6,231,864,WO00/26385)。HBcAg含有長(zhǎng)精氨酸尾(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001))，其對(duì)于殼體裝配不是必須的并且能結(jié)合核酸(Pumpens,P.andGrens,E.,Intervirology44:98-114(2001))。包含或者缺少這個(gè)精氨酸尾的HBcAg是本發(fā)明的兩個(gè)實(shí)施方案。在本發(fā)明另一特異實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是RNA噬菌體優(yōu)選Qbeta的VLP。RNA噬菌體的主要外殼蛋白當(dāng)在細(xì)菌及特別是在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)自發(fā)裝配成VLP。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了融合蛋白構(gòu)建體，其中抗原性肽與截短形式的Qbeta的A1蛋白C末端融合或者插入在所述A1蛋白中(Kozlovska,T.M.,etal.,Intervirology,39:9-15(1996))。所述A1蛋白是通過在UGA終止密碼子的抑制作用產(chǎn)生的，長(zhǎng)度為329個(gè)氨基酸，或者如果考慮到在N末端甲硫氨酸的裂解則為328個(gè)氨基酸。在丙氨酸(由QbetaCP基因編碼的第二個(gè)氨基酸)之前的N末端甲硫氨酸的裂解通常發(fā)生在大腸桿菌中，對(duì)于Qbeta外殼蛋白的N末端也是這種情況。所述A1基因的一部分，UGA琥珀密碼子的3’部分編碼所述CP延伸，其長(zhǎng)度為195個(gè)氨基酸。所述抗原性肽插入在CP延伸的第72與73位之間是本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案(Kozlovska,T.M.,etal.,Intervirology39:9-15(1996))。所述抗原性肽融合在C末端截短的QbetaA1蛋白的C末端是本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案。例如，Kozlovskaetal.,(Intervirology,39:9-15(1996))描述了QbetaA1蛋白質(zhì)融合，其中所述表位融合在第19位截短的QbetaCP延伸的C末端。如Kozlovskaetal.(Intervirology,39:9-15(1996))所述，展示融合的表位的顆粒的裝配典型需要存在A1蛋白-抗原融合體及野生型CP以形成嵌合顆粒。然而，本發(fā)明也包括包含病毒樣顆粒及從而特別包含RNA噬菌體Qbeta外殼蛋白的VLP(其只是由具有與其融合的抗原性肽的VLP亞基組成)的實(shí)施方案。嵌合顆粒的產(chǎn)生可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)。Kozlovskaetal.,Intervirology,39:9-15(1996)描述了三種方法，這三種方法均可用于實(shí)施本發(fā)明。在第一種方法中，融合的表位在VLP上的有效展示通過質(zhì)粒在大腸桿菌菌株中的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，所述質(zhì)粒編碼在CP與CP延伸之間具有UGA終止密碼子的QbetaA1l蛋白融合體，所述大腸桿菌菌株攜帶編碼克隆的UGA阻抑物tRNA的質(zhì)粒，使得UGA密碼子翻譯成Trp(pISM3001質(zhì)粒(SmileyB.K.,etal.,Gene134:33-40(1993)))。在另一種方法中，所述CP基因終止密碼子被修飾為UAA，表達(dá)A1蛋白-抗原融合體的第二質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)化。所述第二質(zhì)粒編碼不同的抗生素抗性，及復(fù)制起點(diǎn)與第一質(zhì)粒相容。在第三種方法中，CP和A1蛋白-抗原融合體以雙順反子形式編碼，與啟動(dòng)子如Trp啟動(dòng)子可操縱地連接，如Kozlovskaetal.,Intervirology,39:9-15(1996)的圖1所述。適于抗原或者抗原決定簇的融合的其它VLP在WO03/024481中描述，包括噬菌體fr、RNAphaseMS-2、乳頭瘤病毒的殼體蛋白、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty、酵母以及逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒、HIV2Gag、豇豆花葉病毒、細(xì)小病毒VP2VLP、HBsAg(US4,722,840,EP0020416B1)。適于實(shí)施本發(fā)明的嵌合VLP的實(shí)例也包括在Intervirology39:1(1996)中描述的那些。預(yù)期用于本發(fā)明中的VLP的其它實(shí)例是：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIVGAG、煙草花葉病毒、SV-40的病毒樣顆粒、多瘤病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、輪狀病毒和Norwalk病毒。對(duì)于與免疫原性載體偶聯(lián)或者不偶聯(lián)的本發(fā)明的任何重組表達(dá)的抗原性PCSK9肽，編碼所述肽或蛋白質(zhì)的核酸也是本發(fā)明的一方面，包含所述核酸的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(自主或染色體插入的)也是本發(fā)明的一方面。通過將其在上述宿主細(xì)胞中表達(dá)及從中分離免疫原的重組產(chǎn)生所述肽或蛋白質(zhì)的方法是本發(fā)明的另一方面。全長(zhǎng)天然PCSK9分子或者編碼其的全長(zhǎng)天然DNA序列不包含在本發(fā)明內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)與免疫原性載體化學(xué)偶聯(lián)。通過單點(diǎn)綴合(例如N末端或C末端點(diǎn))或者作為鎖定的結(jié)構(gòu)(lockeddownstructure)，其中肽的兩端綴合于免疫原性載體蛋白或者綴合于支架結(jié)構(gòu)如VLP，可以發(fā)生綴合以使得肽自由運(yùn)動(dòng)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的綴合化學(xué)發(fā)生綴合，如通過半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或者通常已知作為綴合點(diǎn)的其它羧基部分，如谷氨酸或者天冬氨酸。因此，例如對(duì)于直接共價(jià)偶聯(lián)而言，可以利用碳二亞胺、戊二醛或者(N-[y-malcimidobutyryloxy]琥珀酰亞胺酯，利用可商購(gòu)的異雙功能接頭如CDA和SPDP(根據(jù)廠商指導(dǎo)使用)。肽、特別是環(huán)化肽與蛋白質(zhì)載體通過?；码难苌锞Y合的例子在WO03/092714中描述。在偶聯(lián)反應(yīng)之后，所述免疫原可易于通過透析方法、凝膠過濾方法、分級(jí)分離方法等分離和純化。以半胱氨酸殘基為末端的肽(優(yōu)選在環(huán)化區(qū)域外面有接頭)可以通過馬來酰亞胺化學(xué)與載體蛋白質(zhì)便利地綴合。當(dāng)所述免疫原性載體是VLP時(shí)，具有相同氨基酸序列或者不同氨基酸序列的一些抗原性肽可以與單一VLP分子偶聯(lián)，優(yōu)選獲得以定向方式呈遞一些抗原決定簇的重復(fù)及有序結(jié)構(gòu)，如WO00/32227、WO03/024481、WO02/056905和WO04/007538所述。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽通過化學(xué)交聯(lián)、典型及優(yōu)選通過使用異雙功能交聯(lián)劑結(jié)合VLP。本領(lǐng)域已知一些異雙功能交聯(lián)劑。在一些實(shí)施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有可與第一附著位點(diǎn)反應(yīng)的官能團(tuán)，即與VLP或VLP亞基的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基基團(tuán)反應(yīng)，另一官能團(tuán)可與優(yōu)選的第二附著位點(diǎn)反應(yīng)，即與所述抗原性肽融合的半胱氨酸殘基反應(yīng)，任選地也通過還原用于反應(yīng)。所述方法的第一個(gè)步驟典型被稱作衍生化，是VLP與交聯(lián)劑的反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是激活的VLP，也稱作激活的載體。在第二個(gè)步驟中，使用常規(guī)方法如凝膠過濾或者透析方法，未反應(yīng)的交聯(lián)劑被除去。在第三個(gè)步驟中，所述抗原性肽與激活的VLP反應(yīng)，這個(gè)步驟典型被稱作偶聯(lián)步驟。未反應(yīng)的抗原性肽可以在第四個(gè)步驟中任選地除去，例如通過透析。一些異雙功能交聯(lián)劑為本領(lǐng)域已知。這些包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA及其它交聯(lián)劑，例如得自PierceChemicalCompany(Rockford,IL,USA)并具有一個(gè)與氨基反應(yīng)的官能團(tuán)及一個(gè)與半胱氨酸殘基反應(yīng)的官能團(tuán)。上述交聯(lián)劑均導(dǎo)致硫醚鍵形成。適用于實(shí)施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑特征在于在偶聯(lián)時(shí)在所述抗原性肽與VLP之間導(dǎo)入二硫鍵。屬于這個(gè)類別的優(yōu)選交聯(lián)劑包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。VLP與交聯(lián)劑的衍生化程度可以通過改變實(shí)驗(yàn)條件而影響，所述實(shí)驗(yàn)條件如每種反應(yīng)配偶體的濃度、一種試劑相對(duì)于另一種的過量、pH、溫度和離子強(qiáng)度。偶聯(lián)度，即抗原性肽/VLP亞基的量可以通過改變上述實(shí)驗(yàn)條件而調(diào)節(jié)，以符合疫苗的要求?？乖噪呐cVLP結(jié)合的另一種方法是VLP表面上賴氨酸殘基與抗原性肽上半胱氨酸殘基的連接。在一些實(shí)施方案中，可需要含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點(diǎn)或者作為其一部分的氨基酸接頭與抗原性肽融合以偶聯(lián)VLP。通常，優(yōu)選柔性氨基酸接頭。所述氨基酸接頭的例子選自：(a)CGG；(b)N-末端γ1-接頭；(c)N-末端γ3-接頭；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-末端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12及k＝0-5；(g)N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，i＝0-2；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(1)C-末端γ1-接頭；(m)C-末端γ3-接頭；(n)C-末端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12及k＝0-5；(p)C-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)t(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，1＝0-2及o＝0-8。氨基酸接頭的進(jìn)一步實(shí)例是免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)，甘氨酸-絲氨酸接頭(GGGGS)n，及甘氨酸接頭(G)n，所有均進(jìn)一步含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點(diǎn)及任選地含有進(jìn)一步的甘氨酸殘基。所述氨基酸接頭的典型優(yōu)選實(shí)例是：N-末端γ1:CGDKTHTSPP，C-末端γ1:DKTHTSPPCG，N-末端γ3:CGGPKPSTPPGSSGGAP，C-末端γ3:PKPSTPPGSSGGAPGGCG，N-末端甘氨酸接頭:GCGGGG及C-末端甘氨酸接頭:GGGGCG。當(dāng)疏水性抗原性肽與VLP結(jié)合時(shí)，特別適用于本發(fā)明中的其它氨基酸接頭是：對(duì)于N末端接頭是CGKKGG或CGDEGG，對(duì)于C末端接頭是GGKKGC和GGEDGC。對(duì)于C末端接頭，所述末端半胱氨酸任選地是C末端酰胺化的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在所述肽C末端的GGCG、GGC或GGC-NH2(NH2表示酰胺化)接頭或者在N末端的CGG是優(yōu)選的氨基酸接頭。通常，甘氨酸殘基被插入在較大(bulky)氨基酸與用作第二附著位點(diǎn)的半胱氨酸之間，以避免在偶聯(lián)反應(yīng)中所述較大氨基酸的潛在位阻現(xiàn)象。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，氨基酸接頭GGC-NH2與所述抗原性肽的C末端融合?？乖噪纳洗嬖诘陌腚装彼釟埢枰云溥€原狀態(tài)與激活的VLP上的異雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)，即需要利用游離的半胱氨酸或者具有游離巰基的半胱氨酸殘基。在作為結(jié)合位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是氧化形式的情況中，例如其形成二硫鍵，需要用例如DTT、TCEP或者對(duì)-巰基乙醇還原這個(gè)二硫鍵。低濃度的還原劑與偶聯(lián)反應(yīng)相容，如WO02/05690所述，而較高濃度則抑制偶聯(lián)反應(yīng)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在這種情況中，在偶聯(lián)之前需要除去還原劑或者降低其濃度，例如通過透析、凝膠過濾或者反相HPLC進(jìn)行。通過使用上述方法的異-雙功能交聯(lián)劑使所述抗原性肽與VLP結(jié)合，使得所述抗原性肽與VLP以定向方式偶聯(lián)。使所述抗原性肽與VLP結(jié)合的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS使所述抗原性肽與VLP交聯(lián)的方法。在其它方法中，使用同-雙功能交聯(lián)劑如戊二醛、DSGBM[PEO]4、BS3(PierceChemicalCompany,Rockford,IL,USA)或者具有與VLP的胺基或羧基反應(yīng)的官能團(tuán)的其它已知的同-雙功能交聯(lián)劑使所述抗原性肽附著于VLP。VLP與抗原性肽結(jié)合的其它方法包括其中VLP是生物素化的及所述抗原性肽作為鏈霉抗生物素蛋白-融合蛋白表達(dá)的方法，或者其中抗原性肽與VLP均是生物素化的方法，例如WO00/23955所述。在這種情況中，通過調(diào)節(jié)抗原性肽與鏈霉抗生物素蛋白的比率而使所述抗原性肽可以首先結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白，以便仍有游離結(jié)合位點(diǎn)可用于與在下一步驟中加入的VLP結(jié)合?；蛘?，所有成分可以在“一鍋”反應(yīng)中混合?？梢允褂闷渌潴w-受體對(duì)作為結(jié)合劑以使抗原性肽與VLP結(jié)合，其中利用可溶形式的受體和配體，其能與VLP或抗原性肽交聯(lián)。或者，所述配體或受體可以與抗原性肽融合，由此介導(dǎo)與分別與所述受體或配體化學(xué)結(jié)合或者融合的VLP的結(jié)合。融合也可以通過插入或取代而實(shí)現(xiàn)。如果空間排列允許，一或幾個(gè)抗原分子可以附著于RNA噬菌體外殼蛋白的殼體或VLP的一個(gè)亞基，優(yōu)選通過RNA噬菌體的VLP的暴露的賴氨酸殘基進(jìn)行。RNA噬菌體的外殼蛋白VLP及特別是QP外殼蛋白VLP的一個(gè)特異特征因此是每個(gè)亞基可以偶聯(lián)若干抗原。這樣可以產(chǎn)生密度抗原陣列。Q外殼蛋白的VLP或者殼體在其表面上展示限定數(shù)目的賴氨酸殘基，具有限定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即三個(gè)賴氨酸殘基指向殼體內(nèi)部并與RNA相互作用，以及四個(gè)其它賴氨酸殘基暴露于殼體外面。這些限定性質(zhì)有益于抗原附著于其中賴氨酸殘基與RNA相互作用的所述顆粒的外面而不是所述顆粒的內(nèi)部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的VLP在其表面上也具有限定數(shù)目的賴氨酸殘基以及這些賴氨酸殘基的限定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基和/或第二附著位點(diǎn)包含巰基或者半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基，第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述抗原或抗原決定簇通過半胱氨酸殘基與RNA噬菌體外殼蛋白VLP的賴氨酸殘基結(jié)合，特別是與Qbeta外殼蛋白的VLP結(jié)合。衍生自RNA噬菌體的VLP的另一優(yōu)勢(shì)是其在細(xì)菌中的高表達(dá)產(chǎn)量，使得可以低成本產(chǎn)生大量材料。此外，VLP作為載體的使用使得可以形成具有可變抗原密度的大型抗原陣列和綴合物。特別地，RNA噬菌體的VLP的使用及從而RNA噬菌體Qbeta外殼蛋白的VLP的使用可以實(shí)現(xiàn)非常高的表位密度。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本文揭示的抗原性PCSK9肽與CRM197直接或者通過本文揭示的肽接頭之一連接，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)，以產(chǎn)生免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽與CRM197通過如本文所述化學(xué)交聯(lián)方式及優(yōu)選通過使用如上述異雙功能交聯(lián)劑連接。與CRM197一起使用的優(yōu)選的異雙功能交聯(lián)劑是BAANS(溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)、SMPH(琥珀酰亞氨基-6-[β-馬來酰亞氨基丙酰氨基]己酸酯)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA以及得自例如PierceChemicalCompany(Rockford,IL,USA)的其它交聯(lián)劑。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑是BAANS或SMPH。或者，在本發(fā)明中也可以使用適合在所述抗原性肽與CRM197之間導(dǎo)入二硫鍵的交聯(lián)劑。屬于這個(gè)類別的優(yōu)選交聯(lián)劑包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，當(dāng)本文揭示的抗原性PCSK9肽序列包含半胱氨酸時(shí)，所述抗原性PCSK9肽可以通過所述半胱氨酸直接與CRM197共價(jià)連接。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可包含免疫原性綴合物的混合物，即偶聯(lián)于一或若干個(gè)本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的免疫原性載體。因此，這些免疫原性組合物可以由氨基酸序列不同的免疫原性載體組成。例如，可以制備這樣的疫苗組合物，其包含“野生型”VLP和其中一或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被改變(例如缺失、插入或取代)的修飾的VLP蛋白?；蛘撸梢允褂孟嗤庖咴暂d體，但是偶聯(lián)于不同氨基酸序列的抗原性PCSK9肽。本發(fā)明因此還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原的方法，所述方法包括：i)提供本發(fā)明的抗原性PCSK9肽，ii)提供本發(fā)明的免疫原性載體，優(yōu)選VLP，及iii)組合所述抗原性PCSK9肽及所述免疫原性載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合步驟通過化學(xué)交聯(lián)、優(yōu)選通過異雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽與免疫原性載體分子連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性載體選自本文所述任何免疫原性載體。在另一實(shí)施方案中，所述免疫原性載體選自：血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，球蛋白，甲狀腺球蛋白，血紅蛋白，血藍(lán)蛋白(特別是匙孔血藍(lán)蛋白[KLH])以及病毒樣顆粒(VLP)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是白喉類毒素，白喉毒素的CRM197突變體，破傷風(fēng)類毒素，匙孔血藍(lán)蛋白或者病毒樣顆粒(VLP)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是DT、CRM197或者VLP，所述VLP選自HBcAgVLP、HBsAgVLP、QbetaVLP、PP7VLP、PPVVLP、Norwalk病毒VLP或者本文揭示的任何變體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是噬菌體VLP，如QbetaVLP，選自QbetaCP；QbetaA1,Qbeta-240,Qbeta-243,Qbeta-250,Qbeta-251及Qbeta-259(在WO03/024481中揭示)或者PP7。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原性載體是CRM197。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性載體與本文揭示的抗原性PCSK9肽直接或者通過接頭共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性載體通過如本文所述表達(dá)融合蛋白與本文揭示的所述抗原性PCSK9肽連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽通過如本文所述化學(xué)交聯(lián)方式及優(yōu)選通過使用異雙功能交聯(lián)劑與免疫原性載體優(yōu)選VLP連接。本領(lǐng)域已知一些異雙功能交聯(lián)劑。在一些實(shí)施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有可以與第一附著位點(diǎn)反應(yīng)的官能團(tuán)，即與VLP或VLP亞基的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基反應(yīng)，以及含有另一個(gè)官能團(tuán)，該官能團(tuán)可與優(yōu)選的第二附著位點(diǎn)反應(yīng)，即與所述抗原性肽融合的半胱氨酸殘基反應(yīng)，所述半胱氨酸殘基經(jīng)還原反應(yīng)而可用于反應(yīng)。包含接頭的本發(fā)明抗原性PCSK9肽在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端或者在其C末端或者在N和C兩個(gè)末端的接頭，所述接頭在化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)中能與所述免疫原性載體的附著位點(diǎn)反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的接頭，所述接頭化學(xué)式為(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，優(yōu)選(G)nC，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自0、1、2和3，最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時(shí)，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。優(yōu)選本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的具有化學(xué)式GGGC、GGC、GC或C的接頭。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的接頭，所述接頭的化學(xué)式是C(G)n、CS(G)n或者K(G)n，優(yōu)選C(G)n，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自0、1、2和3，最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時(shí)，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。優(yōu)選本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的具有化學(xué)式CGGG、CGG、CG或C的接頭。在另一實(shí)施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的接頭，該接頭的化學(xué)式是(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，優(yōu)選(G)nC，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自0、1、2和3，最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時(shí)，該化學(xué)式代表半胱氨酸)以及包含在其N末端的接頭，該接頭的化學(xué)式是C(G)n、CS(G)n或者K(G)n，優(yōu)選C(G)n，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選0、1、2和3，最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時(shí)，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。優(yōu)選本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的具有化學(xué)式CGGG、CGG、CG或C的接頭以及在其C末端的具有化學(xué)式GGGC、GGC、GC或C的接頭。優(yōu)選地，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的半胱氨酸及在其C末端的半胱氨酸。進(jìn)一步包含這種接頭的代表性的抗原性PCSK9肽如SEQIDNO:313、314、315、316、317、322、323、324、325、326、327、328、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418和419所示。進(jìn)一步包含這種接頭的代表性的抗原性PCSK9肽如SEQIDNO:313、314、315、316、317、322、323、324、325、326、327和328所示。優(yōu)選的包含接頭的抗原性PCSK9肽如SEQIDNo:317、322、323、324、401、402、403、413、414、415和416所示。優(yōu)選的包含接頭的抗原性PCSK9肽如SEQIDNo:317、322、323和324所示。最優(yōu)選的包含接頭的抗原性PCSK9肽如SEQIDNo:317、322、402和413所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是環(huán)化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)化的抗原性PCSK9肽附著于免疫原性載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)化的抗原性PCSK9肽通過共價(jià)結(jié)合附著于免疫原性載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)化的抗原性PCSK9肽通過其氨基酸側(cè)鏈之一與載體的共價(jià)結(jié)合而附著于免疫原性載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，在環(huán)化的PCSK9肽中加入包含可變數(shù)目甘氨酸殘基和一個(gè)半胱氨酸殘基的半胱氨酸、GC或CC片段以使得可以通過加入的半胱氨酸與所述免疫原性載體共價(jià)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽是環(huán)化的，且包含半胱氨酸、(G)nC或C(G)n片段，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自0、1、2和3，最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時(shí)，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。這種構(gòu)象限制的抗原性PCSK9肽的非限制性實(shí)例是SEQIDNo:318、319、320和321所示肽。優(yōu)選的環(huán)化的肽是SEQIDNo:318所示肽。使用各種接頭使抗原性PCSK9肽與上述載體或支架綴合的實(shí)例均在本發(fā)明范圍內(nèi)且組成了本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案，這些實(shí)例在下文提供：肽–GGGGGC–支架，肽–GGGGC–支架，肽–GGGC–支架，肽–GGC–支架，肽–GC–支架，肽–C–支架，肽–GGGGGK–支架，肽–GGGGK–支架，肽–GGGK–支架，肽–GGK–支架，肽–GK–支架，肽–K–支架，肽–GGGGSC–支架，肽–GGGSC–支架，肽–GGSC–支架，肽–GSC–支架，肽–SC–支架，支架–CSGGGG–肽，支架–CSGGG–肽，支架–CSGG–肽，支架–CSG–肽，支架–CS–肽，支架–KGGGG–肽，支架–KGGG–肽，支架–KGG–肽，支架–KG–肽，支架–K–肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽由本文揭示的任何抗原性PCSK9肽組成，所述支架由本文揭示的任何免疫原性載體、優(yōu)選VLP組成。下文提供了使用各種接頭與雙重限制的(doublyconstrained)肽的綴合的組合的實(shí)例，其中所述載體可以是相同的載體單體或者不同的載體單體。(在下文的實(shí)例中，所述GC接頭可以由上文舉例的任何GK接頭或者GSC接頭或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它接頭取代)：載體–CGGGGG–肽–GGGGGC–載體，載體–CGGGG–肽–GGGGC–載體,載體–CGGGG–肽–GGGGC–載體,載體–CGGG–肽–GGGC–載體,載體–CG–肽–GC–載體,載體–CG–肽–C–載體,載體–C–肽–C–載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽由本文揭示的任何抗原性PCSK9肽組成，所述載體由本文揭示的任何免疫原性載體優(yōu)選VLP組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述肽由選自SEQIDNo:1-312、330-398及420-588的氨基酸序列組成或者基本上由其組成，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端或者在其N末端的半胱氨酸，其通過硫醚鍵與免疫原性載體化學(xué)交聯(lián)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原性載體選自DT(白喉毒素)、TT(破傷風(fēng)類毒素)或者TT的片段C、PD(流感嗜血桿菌蛋白D)、CRM197，其它DT點(diǎn)突變體，如CRM176、CRM228、CRM45、CRM9、CRM102、CRM103和CRM107。優(yōu)選所述免疫原性載體是CRM197。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述肽由選自SEQIDNo:1-312、330-398及420-588的氨基酸序列組成或者基本上由其組成，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端或者在其N末端的半胱氨酸，其通過硫醚鍵與免疫原性載體化學(xué)交聯(lián)，使用SMPH(琥珀酰亞氨基-6-[β-馬來酰亞氨基丙酰氨基]己酸酯)或者BAANS(溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)作為交聯(lián)劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原性載體選自DT(白喉毒素)、TT(破傷風(fēng)類毒素)或者TT的片段C、PD(流感嗜血桿菌蛋白D、CRM197，其它DT點(diǎn)突變體，如CRM176、CRM228、CRM45、CRM9、CRM102、CRM103及CRM107。優(yōu)選所述免疫原性載體是CRM197。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述肽由選自SEQIDNo:1-312、330-398及420-588的氨基酸序列組成或者基本上由其組成，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的半胱氨酸，其通過硫醚鍵與免疫原性載體化學(xué)交聯(lián)，使用SMPH(琥珀酰亞氨基-6-[β-馬來酰亞氨基丙酰氨基]己酸酯)或者BAANS(溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)作為交聯(lián)劑，所述鍵在CRM197的賴氨酸殘基與所述抗原性肽的半胱氨酸殘基之間。包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的組合物本發(fā)明進(jìn)一步涉及組合物，特別是免疫原性組合物，也稱作“主題(subject)免疫原性組合物”，其包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽，優(yōu)選與免疫原性載體連接，及任選地包含至少一種佐劑。這種免疫原性組合物，特別是當(dāng)作為藥物組合物配制時(shí)，被認(rèn)為可用于預(yù)防、治療或者減輕PCSK9-相關(guān)疾病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的主題免疫原性組合物包含抗原性PCSK9肽，任選地包含接頭，所述肽包含選自SEQIDNo:1-328、330-398及401-588的氨基酸序列及其功能活性變體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原性PCSK9肽與免疫原性載體連接，優(yōu)選與DT、CRM197或VLP連接，更優(yōu)選與HBcAg、HBsAg、Qbeta、PP7、PPV或者Norwalk病毒VLP連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的主題免疫原性組合物包含抗原性PCSK9肽，任選地包含接頭，所述肽包含與VLP、優(yōu)選QbetaVLP連接的選自SEQIDNo:1-328、330-398及401-588的氨基酸序列及其功能活性變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的主題免疫原性組合物包含抗原性PCSK9肽，任選地包含接頭，所述肽包含與CRM197連接的選自SEQIDNo:1-328、330-398及401-588的氨基酸序列及其功能活性變體。本發(fā)明的包含抗原性PCSK9肽的主題免疫原性組合物可以通過多種方式制備，如在下文詳細(xì)描述。在一些實(shí)施方案中，主題免疫原性組合物包含單一物種的抗原性PCSK9肽，如所述免疫原性組合物包含一群抗原性PCSK9肽，其基本上均具有相同氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，主題免疫原性組合物包含兩或多個(gè)不同抗原性PCSK9肽，如所述免疫原性組合物包含一群抗原性PCSK9肽，該群成員的氨基酸序列可不同。主題免疫原性組合物可包含2-大約20個(gè)不同的抗原性PCSK9肽，如主題免疫原性組合物可包含2,3,4,5,6,7,8,9,10,11-15或者15-20個(gè)不同的抗原性PCSK9肽，所述肽均具有與其它抗原性PCSK9肽氨基酸序列不同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，主題免疫原性組合物包含多聚體化的抗原性PCSK9多肽。如本文所用，術(shù)語“包含抗原性PCSK9肽的免疫原性組合物”或者“本發(fā)明的免疫原性組合物”或者“主題免疫原性組合物”是指包含偶聯(lián)或者不偶聯(lián)于免疫原性載體的單一物種(多聚體化或否)或者多物種的抗原性PCSK9肽的免疫原性組合物。在使用兩或多種肽偶聯(lián)載體的情況中，所述肽可以偶聯(lián)于相同載體分子或者各自偶聯(lián)于載體分子，然后組合產(chǎn)生免疫原性組合物。本發(fā)明另一方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明免疫原的方法，所述方法包括將抗原性PCSK9肽與免疫原性載體偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)是化學(xué)偶聯(lián)。佐劑在一些實(shí)施方案中，主題免疫原性組合物包含至少一種佐劑。合適的佐劑包括適用于哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的那些?？捎糜谌说囊阎线m佐劑的例子包括但不限于明礬，磷酸鋁，氫氧化鋁，MF59(4.3％w/v角鯊烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween80)、0.5％w/v三油酸山梨坦(Span85))，含有CpG的核酸(其中胞嘧啶是未甲基化的)，QS21(皂苷佐劑)，MPL(單磷酰脂質(zhì)A)，3DMPL(3-O-去酰化MPL)，Aquilla提取物，ISCOMS(見例如etal.(1998)J.LeukocyteBiol.64:713；WO90/03184，WO96/11711，WO00/48630，WO98/36772，WO00/41720，WO06/134423和WO07/026190)，LT/CT突變體，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，QuilA，TiterMaxclassic，TiterMaxGold，白細(xì)胞介素等。對(duì)于包括但不限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的獸醫(yī)應(yīng)用，可以使用弗氏佐劑，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱作正-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(CGP19835A，稱作MTP-PE)及RIBI，其含有從細(xì)菌中提取的三種成分，單磷酰脂質(zhì)A，海藻糖二霉菌酸酯以及細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，于2％角鯊烯/Tween80乳狀液中。增強(qiáng)所述組合物效力的其它舉例的佐劑包括但不限于：(1)水包油乳狀液配制物(有或無其它特定免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或者細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如(a)MF59TM(WO90/14837，Vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach第10章,eds.Powell&Newman,PlenumPress1995)，含有5％角鯊烯、0.5％Tween80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)和0.5％Span85(三油酸山梨坦)(任選地含有與二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)共價(jià)連接的胞壁酰三肽)，使用微流化儀(microfluidizer)配制成亞微米粒子，(b)SAF，含有10％角鯊?fù)椤?.4％Tween80、5％pluronic阻斷...