用于預(yù)防或治療宮頸癌的、包含人乳頭瘤病毒變形體及免疫增強(qiáng)劑的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療宮頸癌的、包含人乳頭瘤病毒（human papillomavirus;HPV)變形體及免疫增強(qiáng)劑的組合物。更具體地，融合蛋白通過(guò)誘導(dǎo)HPV16 和18型抗原特異性免疫應(yīng)答治療由HPV引起的腫瘤。所述融合蛋白包括融合多肽 (Polypeptide)、信號(hào)肽及免疫增強(qiáng)肽，所述融合多肽被重組，以使作為人乳頭瘤病毒16和 18型的抗原E6、E7的三維結(jié)構(gòu)變形。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，宮頸癌（cervicalcancer)是由于受人乳頭瘤病毒16和18型等的高危 型人乳頭瘤病毒的感染而引起的疾?。▃urHausen，Hetal.BiochemBiophysActa1996，1288;F55-F78,MarkHetal.JNatlCancerInst1993,85;958-964)。在HPV蛋白 中E6、E7蛋白對(duì)宮頸癌的發(fā)病起主要作用，而且已確認(rèn)在宮頸癌患者的腫瘤組織中表達(dá) 99%，從而成為制備用于治療和預(yù)防宮頸癌的疫苗的主要祀物質(zhì)（vonKnebelDoeberitz etal.Int.J.Cancer1992,51 ;831_834)J6與已知用作腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合，通過(guò)促進(jìn) P53的分解，用細(xì)胞凋亡(apoptosis)途徑阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。E7與作為腫瘤抑制因子的 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRb(retinoblastomaprotein)結(jié)合，通過(guò)使之失活并促進(jìn)其分解，誘 導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)入S期（Cobriniketal.，TrendsBiochemSci1992,17:312-5)。
[0003]然而，為治療宮頸癌，在使用通過(guò)同時(shí)表達(dá)HPV16的E6、E7蛋白的核酸序列的組合 物的臨床試驗(yàn)中，其療效并不顯著（GarciaFetal.ObstetGynecol2004,103;317_ 326)。此結(jié)果表明，僅施用HPV抗原是無(wú)法發(fā)生足以治療或抑制宮頸癌的抗原特異性免疫應(yīng) 答的。
[0004]因此，為治療子宮癌，需增強(qiáng)E6、E7的免疫原性（immunogenicity)，并且需消除所 述蛋白的致癌能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的在于，提供用于預(yù)防或治療由HPV引起的疾病的新型融合蛋白及編碼所 述融合蛋白的多核苷酸(polynucleotide)。所述融合蛋白可抑制HPVE6、E7蛋白的致癌能 力并展現(xiàn)增強(qiáng)的免疫原性。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供表達(dá)所述融合蛋白的重組載體（recombinant vector)、包含所述載體的宿主細(xì)胞以及用所述宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的方法。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供用所述融合蛋白的、用于預(yù)防或治療由HPV引起的 疾病的組合物。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供用所述組合物的、用于預(yù)防或治療由HPV引起的疾 病的方法。
[0009] 技術(shù)方案 為達(dá)到上述目的，一方面，本發(fā)明提供融合蛋白，該融合蛋白包括:融合多肽，即三維結(jié) 構(gòu)變形的、源于人乳頭瘤病毒16和18型并包含SEQIDNO: 1氨基酸序列的E6、E7;用于分泌 所述融合多肽的信號(hào)肽;和免疫增強(qiáng)肽。
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供多核苷酸，該多核苷酸用于編碼本發(fā)明的融合蛋白。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供重組載體，該重組載體包括本發(fā)明的多核苷酸。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞由本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化而成。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的方法，該方法是通過(guò)培養(yǎng)本 發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞完成的。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病的組合物，該 組合物包括作為活性成分的、選自本發(fā)明的融合蛋白、由表達(dá)所述融合蛋白的重組載體轉(zhuǎn) 化而成的宿主細(xì)胞及其均楽Xhomogenate)中的一種或多種的物質(zhì)。
[0015]另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病的方法，該方 法包括向需要者施用有效劑量的本發(fā)明的組合物的步驟。
[0016]有益效果 本發(fā)明所制備的融合蛋白通過(guò)誘導(dǎo)高的HPV16和18型抗原特異性免疫應(yīng)答來(lái)治療由HPV引起的腫瘤，所述融合蛋白包括為改變?cè)从贖PV16和18型E6、E7蛋白的三維結(jié)構(gòu)而被重 組的融合蛋白、用于向細(xì)胞外分泌該融合蛋白的信號(hào)肽及免疫增強(qiáng)肽。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過(guò)本發(fā)明 的GX-188E治療后展示的HPV16的E6特異性⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的圖。
[0018] 圖2展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過(guò)本發(fā)明 的GX-188E治療后展示的HPV16的E7特異性⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的圖。
[0019]圖3展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過(guò)本發(fā)明 的GX-188E治療后展示的HPV18的E6特異性⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的圖。
[0020]圖4展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過(guò)本發(fā)明 的GX-188E治療后展示的HPV18的E7特異性⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的圖。
[0021 ]圖5展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過(guò)本發(fā)明 的GX-188E治療后展示的抗癌效果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面將詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。
[0023]本發(fā)明涉及融合蛋白，該融合蛋白包括:源于人乳頭瘤病毒16及18型并包含SEQ IDNO: 1氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)變形的E6、E7融合多肽；用于分泌所述融合多肽的信號(hào)肽； 和免疫增強(qiáng)肽。
[0024]本發(fā)明的融合蛋白包括融合多肽，該融合多肽被重組以使源于人乳頭瘤病毒16及 18型的E6、E7的三維結(jié)構(gòu)變形。更具體地，所述融合多肽由源于人乳頭瘤病毒16型的E6蛋白 的第1~85位的氨基酸、E7蛋白的第1~65位的氨基酸、E6蛋白的第71~158位的氨基酸、E7 蛋白的第51~98位的氨基酸和源于人乳頭瘤病毒18型的E6蛋白的第1~85位的氨基酸、E7 蛋白的第1~65位氨基酸、E6蛋白的第71~158位的氨基酸、E7蛋白的第51~105位的氨基酸 組成。
[0025]最為具體地，融合多肽可包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
[0026]此外，所述信號(hào)肽指包括約20~30個(gè)氨基酸的肽，所述肽能將在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋 白，尤其將包含E6、E7融合多肽的蛋白分泌至細(xì)胞外。而且，用于編碼所述肽的核酸序列被 稱為"分泌信號(hào)序列"。由于本發(fā)明的E6、E7融合多肽是在受病毒感染的細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)的 蛋白（nucleusprotein)，其免疫力弱。因此，由分泌信號(hào)序列表達(dá)的信號(hào)肽誘導(dǎo)三維結(jié)構(gòu) 變形的E6、E7分泌至細(xì)胞外，從而增強(qiáng)抗原特異性體液免疫應(yīng)答（humoralimmune response)及細(xì)胞免疫應(yīng)答（cellularimmuneresponse)。
[0027]所述信號(hào)肽可使用包括哺乳動(dòng)物等的高等真核細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)肽，如tPA(組織型纖 溶酶原激活物）、HSVgDs，或可使用生長(zhǎng)激素等的分泌信號(hào)序列。優(yōu)選地，可使用tPA。更優(yōu) 選地，可包含SEQID N0:2的氨基酸序列。
[0028]此外，免疫增強(qiáng)肽指激活與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞(如，樹(shù)突狀細(xì)胞等）以增強(qiáng)免疫 應(yīng)答的肽。
[0029] 所述免疫增強(qiáng)肽可使用CD40配體、Flt3配體(fms樣酪氨酸激酶3配體）、鞭毛蛋白 或0X40等。優(yōu)選地，可使用Flt3配體。所述Flt3配體是能夠誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC)的增殖與成熟的因子，經(jīng)抗原可增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而且在與腫瘤抗原融合時(shí)具有能 非常有效地減少腫瘤的效果。更優(yōu)選地，所述Flt3配體包含SEQIDN0:3的氨基酸序列。
[0030]另一方面，本發(fā)明涉及用于編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸。
[0031] 所述多核苷酸用于編碼本發(fā)明的融合蛋白，所述E6、E7融合多肽可由SEQIDN0:4 的堿基序列編碼而成，但不限于此。此外，所述信號(hào)肽可由SEQIDNO:5的堿基序列編碼而 成，但不限于此。此外，所述免疫增強(qiáng)肽可由SEQIDN0:6的堿基序列編碼而成，但不限于 此。
[0032]此外，本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)化學(xué)合成方法或遺傳工程技術(shù)而制備?；瘜W(xué)合成 方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可使用任何方法。此外，也可通過(guò)委托商業(yè)核酸合成及制 造商購(gòu)買(mǎi)。當(dāng)通過(guò)遺傳工程技術(shù)制備時(shí)，例如，通過(guò)分別制得用于編碼已知的E6和E7融合多 肽、信號(hào)肽和免疫增強(qiáng)肽的核酸片段，連接這些片段以符合讀框來(lái)制備。所述制得核酸片段 的方法為本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)適當(dāng)?shù)南拗泼溉菀讓⑵溥B接。在本發(fā)明的
【具體實(shí)施方