一種宮頸癌相關(guān)的熱休克蛋白復(fù)合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,更具體地,本發(fā)明公開(kāi)了一類(lèi)能有效激活乳頭瘤病毒(HPV)特異性T細(xì)胞的熱休克蛋白復(fù)合物及其制備方法,以及其在治療和預(yù)防宮頸癌中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]腫瘤尤其是惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病,而宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女的生命健康的惡性腫瘤之一,其與乳腺癌一起被稱(chēng)為女性“雙癌”疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi),每年大約有53萬(wàn)左右的宮頸癌新發(fā)病例,約27.5萬(wàn)死亡病例,其中85%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。在我國(guó),每年新發(fā)病例約有10萬(wàn),約占女性腫瘤的5%,且近年來(lái)呈現(xiàn)地區(qū)增長(zhǎng)及發(fā)病年齡提前的現(xiàn)象。由于其對(duì)女性健康的重大危害及其所造成的社會(huì)問(wèn)題,針對(duì)宮頸癌的相關(guān)研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等研究的不斷進(jìn)展,宮頸癌治療在傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療基礎(chǔ)上,結(jié)合生物治療的綜合治療體系已成為研究的熱點(diǎn)。
[0003]手術(shù)治療是早期宮頸癌重要的首選治療手段,也是某些晚期宮頸癌不可缺少的綜合治療手段。放射治療歷來(lái)是宮頸癌的主要治療手段,術(shù)前放療可縮小腫瘤體積,降低癌細(xì)胞活性及術(shù)中播散,提高手術(shù)完整切除率。術(shù)后放療的目的則是補(bǔ)充手術(shù)的不足,提高局部控制率,減少?gòu)?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。晚期宮頸癌不能手術(shù),則首選放療。并且隨著化療技術(shù)的發(fā)展,近年來(lái)化療也成為宮頸癌綜合治療的一部分。新輔助化療(術(shù)前化療)已被證實(shí)可明顯提高患者的5年生存率,并越來(lái)越受到學(xué)者的重視。術(shù)前腔內(nèi)放療,然后再行根治性手術(shù),其治療效果更好。
[0004]近年來(lái)的研究證實(shí)高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素,通過(guò)激活針對(duì)HPV的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體被認(rèn)為可以很好的預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。然而目前沒(méi)有針對(duì)HPV激活特異性T細(xì)胞治療和預(yù)防宮頸癌的報(bào)道。
[0005]gp96是熱休克蛋白HSP90家族中的重要成員,主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(EndoplasmicReticulum),在正常組織和腫瘤中均有廣泛表達(dá)。正常情況下gp96在細(xì)胞中呈低水平表達(dá),而熱休克、葡萄糖缺乏、細(xì)菌和病毒感染等均可使其表達(dá)量上調(diào)。gp96分子具有結(jié)合多肽的能力,能結(jié)合含有5-25個(gè)氨基酸的肽段。熱休克蛋白HSP78是細(xì)胞質(zhì)中HSP70家族中的成員,分子量約78kDa。HSP78分子作為分子伴侶能與細(xì)胞中各種短肽結(jié)合。目前已證實(shí)gp96和HSP78分子可以結(jié)合多種組織特異性抗原多肽,包括泡狀口炎病毒抗原區(qū)肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。
[0006]在細(xì)胞外,gp96可將結(jié)合的短肽交叉呈遞給I類(lèi)MHC分子,從而激活⑶8+ T細(xì)胞,引發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。gp96還可以活化樹(shù)突細(xì)胞(DC)促進(jìn)MHC I類(lèi)和MHC II類(lèi)分子以及共刺激因子的表達(dá),從而提高免疫反應(yīng)。因而gp96-多肽復(fù)合物是優(yōu)良的細(xì)胞免疫激活劑。
[0007]腫瘤自體gp96因?yàn)閿y帶有患者自身腫瘤的抗原肽,可以激活患者個(gè)體特異性的T細(xì)胞反應(yīng),從而殺傷腫瘤細(xì)胞,已成功應(yīng)用于黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床治療。而宮頸癌相關(guān)的臨床應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。
[0008]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]因此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服腫瘤細(xì)胞免疫編輯導(dǎo)致的低下的免疫反應(yīng),能夠在宮頸癌患者中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(殺傷性T細(xì)胞,CTL),利用CTL的特異性殺傷能力治療和預(yù)防宮頸癌,同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞及組織無(wú)破壞作用。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與gp96和HSP78結(jié)合的多肽形成的抗宮頸癌復(fù)合物。所述的多肽可以分別是宮頸癌相關(guān)乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第25-33位的氨基酸序列,其序列可以是ELQTTIHEI,或其變異序列;乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第29-37位的氨基酸序列,其序列可以是TIHEIILEC,或其變異序列;乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第110-118位的氨基酸序列,其序列可以是CINCQKPLC,或其變異序列。
[0011]本發(fā)明的復(fù)合物既包括熱休克蛋白以非共價(jià)鍵與多肽結(jié)合形成的復(fù)合物,又包括熱休克蛋白以共價(jià)鍵與多肽結(jié)合形成的復(fù)合物。本發(fā)明提供了制備本發(fā)明中如上所述抗原多肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的復(fù)合物的方法。
[0012]本發(fā)明所訴的表位肽可以以熱休克蛋白復(fù)合物形式在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)形成特異性的CTL。
[0013]本發(fā)明所訴的表位肽可以在體外單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式刺激HLA-A2陽(yáng)性宮頸癌患者PBMC分泌IFN- γ,且這種作用在自體gp96免疫后顯著增強(qiáng)。
[0014]本發(fā)明所訴的表位肽可以單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式提高HLA-A2陽(yáng)性宮頸癌患者特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
[0015]本發(fā)明所述的特異性CTL的誘導(dǎo)可以被Treg細(xì)胞的抑制劑增強(qiáng)。
[0016]首次從五例HPV陽(yáng)性宮頸癌腫瘤組織中純化的熱休克蛋白gp96復(fù)合物中分離出一特異9肽,經(jīng)氨基酸序列分析為“ELQTTIHEI”,經(jīng)查詢(xún)發(fā)現(xiàn)該序列位于宮頸癌相關(guān)乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第25-33位,人工合成該序列并與體外表達(dá)的gp96蛋白組裝,體外合成gp96-9肽復(fù)合物,將該gp96-9肽復(fù)合物免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠,能刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL),且應(yīng)用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制劑可以增強(qiáng)gp96-9肽復(fù)合物的免疫效果2倍以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gp96-9肽復(fù)合物可開(kāi)發(fā)成為一種新型宮頸癌的治療性藥物。
[0017]
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1.小鼠(BALB/chu A2+)的特異性CTL反應(yīng)。以gp96-9肽復(fù)合物按0、1、3周的周期免疫小鼠,最后一次免疫3天后檢測(cè)特異性細(xì)胞裂解率。效應(yīng)細(xì)胞CTL對(duì)靶細(xì)胞的裂解百分率以4小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放法測(cè)定,效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比分別是10、25、50和100,圖中裂解率為10只小鼠平均值。
[0018]圖2.gp96_肽段I免疫的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞可抑制裸鼠皮下接種的宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。雌性裸鼠背部皮下接種人宮頸癌細(xì)胞Caski,荷瘤7天后轉(zhuǎn)輸不同來(lái)源的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞??乖腎組(n=20)的接受經(jīng)過(guò)gp96-抗原肽I復(fù)合物免疫的BALB/c HLA A2+小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞;無(wú)關(guān)肽對(duì)照組(n=20)接受經(jīng)過(guò)gp96-無(wú)關(guān)肽(HBcAg87-95)復(fù)合物免疫的Balb/c HLA A2+小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞。
[0019]
圖3.小鼠(BALB/cHWA2+)的特異性CTL反應(yīng)。以宮頸癌患者腫瘤組織來(lái)源gp96或小鼠肝臟gp96按0、1、3周的周期免疫小鼠,最后一次免疫3天后檢測(cè)9肽特異性T細(xì)胞的變化。以IFN- γ的ELISP0T方法檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中9肽特異性T細(xì)胞。無(wú)關(guān)肽HBcAg82 90肽為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示只有宮頸癌患者來(lái)源的gp96抗原復(fù)合物能激活9肽特異性的T細(xì)胞,表明復(fù)合物中包含相關(guān)的抗原。
[0020]圖4.宮頸癌患者免疫自體腫瘤gp96復(fù)合物后9肽特異性T細(xì)胞的變化。以IFN-γ的ELISP0T方法檢測(cè)患者外周血中9肽特異性T細(xì)胞。無(wú)關(guān)肽HBcAg82 9。肽為陰性對(duì)照。
[0021]【具體實(shí)施方式】:
下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明,但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實(shí)施例1.從宮頸癌組織中純化gp96蛋白
選擇HPV陽(yáng)性和HPV陰性的宮頸癌患者組織純化gp96復(fù)合物。將宮頸癌組織勻漿后離心,用30%/70%飽和度(NH4) #04沉淀,沉淀溶解后采用ConA Sepharose (GE公司)進(jìn)行親和層析,用8%的α-甲基葡萄糖苷洗脫結(jié)合的蛋白,糖苷洗脫液以Hitrap-Q (GE公司層析系統(tǒng))進(jìn)行陰離子層析,經(jīng)過(guò)這三步純化獲得>95%純度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94單克隆抗體(Santa Cruz公司)進(jìn)行Western鑒定。其純度用SDS-PAGE、銀染和反相HPLC鑒定。
[0023]
實(shí)施例2.從gp96蛋白釋放非共價(jià)結(jié)合的多肽
將純化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其終濃度達(dá)到0.2% (pH約2.0),然后用超濾法(分子截留為30 kDa, Millipore公司)分離多肽,將多肽混合物進(jìn)行MALD1-T0F質(zhì)譜(ABI 4700)分析,多肽分子量大多在600-1200 Da之間。
[0024]
實(shí)施例3.反相HPLC分析多肽
多肽混合物凍干后溶于溶液A(0.065% TFA, 2%乙腈),反相層析柱C18上樣(S^hasilpeptide C18 ;5 μ m 粒度;4.6 X 250mm,GE 公司),從 O 至 65% 溶液 B (0.05% TFA,100% 乙腈)進(jìn)行梯度洗脫,流速為I mL/min,用214nm波長(zhǎng)檢測(cè)。比較HPV+與HPV腫瘤組織HPLC圖譜,發(fā)現(xiàn)一個(gè)HPV+組織共有而HPV組織中沒(méi)有的肽峰。
[0025]
實(shí)施例4.多肽微量測(cè)序與序列分析
收集該特異肽峰用MALD1-T0F質(zhì)譜(ABI公司4700系統(tǒng))鑒定其純度,只發(fā)現(xiàn)分子量為1083 Da的單一峰。對(duì)該肽微量測(cè)序(Procise 491.蛋白測(cè)序儀,ABI公司),其氨基酸序列為“ELQTTIHEI”,5份腫瘤組織得到的序列一致。在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)?cè)撔蛄?NCBI),發(fā)現(xiàn)它位于HPV蛋白E6的25-33位。
[0026]
實(shí)施例5.gp96蛋白與人工合成的多肽體外快速組裝
人工合成9肽“ELQTTIHEI” (委托吉爾生化有限公司合成),將gp96蛋白與多肽進(jìn)行體外組裝,體外結(jié)合反應(yīng)體系:
2.7 mmol/L KCl, 1.47 mmol/L KH2PO4,8.1 mmol/L Na2HPO4,138mmol/L NaCl, 10%(V/V)甘油,3.0 mmol/L 9肽,0.421 mmol/L gp96蛋白,60°C反應(yīng)10分鐘,超濾法(截留分子量30 kDa,Millipore公司)去除未結(jié)合的多肽。
[0027]
實(shí)施例6表達(dá)宮頸癌相關(guān)抗原肽I和熱休克蛋白gp96的融合蛋白本實(shí)例提供了宮頸癌相關(guān)抗原肽l(ELQTTIHEI)與熱休克蛋白gp96以共價(jià)鍵形成的融合蛋白的方法。我們?nèi)斯ず铣苫パa(bǔ)的核酸序列(5’ GATCC GAGCTGCAAACAACTATACATGATATAA 3’及 5’ GATCT TATATCATGTATAGTTGTTTGCAGCTC G 3’),并通過(guò)復(fù)性獲得雙鏈DNA片段,核酸序列對(duì)應(yīng)于該肽的氨基酸序列,同時(shí)還在序列的5’端引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I粘性末端,3端引入限制性酶切位點(diǎn)Bgl II的粘性末端,獲得粘性片段I。我們通過(guò)PCR在gp96的基因兩端分別引入限制性酶切位點(diǎn)Bgl II和Xho I,限制性酶切獲得粘性片段2。我們酶切真核表達(dá)載體pSeCTag2/Hygr0 A獲得BamH I, Xho I雙切的粘性片段3。將3個(gè)DNA片段用T4連接酶連接,將抗原肽-gp96表達(dá)框插入到表達(dá)載體pSecTag2/Hygro A0將基因工程載體pSecTag2 /HygroB-Seql-hgp96通過(guò)電穿孔的方式轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,以潮霉素B抗生素篩選陽(yáng)性克隆,并通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的gp96獲得高產(chǎn)細(xì)胞株。
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