Eps8抗腫瘤ctl表位肽及其應用的制作方法
【專利摘要】一種EPS8來源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其序列為：d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val，其中，d為Gln或Tyr。本發(fā)明還公開了該表位肽在藥物中的應用。本發(fā)明誘導的特異性CTL均能分泌一定的IFN-γ，并對HLA-A*0201和EPS8表達陽性的MCF-7細胞以及負載EPS8的T2A2細胞均表現出一定的抗原特異性殺傷效應，制成的EPS8表達陽性腫瘤的治療性多肽疫苗，在腫瘤特異性免疫治療領域有著巨大的開發(fā)應用潛力。
【專利說明】EPS8抗腫瘤CTL表位肽及其應用
[0001] 本申請是申請日為2013年12月23日、申請?zhí)枮?01310717092. 0、發(fā)明名稱為 EPS8抗腫瘤CTL表位肽及其應用的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物化學領域中的多肽【技術領域】，具體涉及一種EPS8來源的抗腫瘤 CTL表位肽及其在制備治療腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0003] 惡性腫瘤是新世紀人類的第一殺手。手術、放療及化療等傳統(tǒng)治療方法對某些腫 瘤尤其是晚期惡性腫瘤的治療效果尚不理想。近年來，細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)在抑制腫瘤中的作用受到極大重視，如何有效激發(fā)CTL介導的特異性細 胞免疫應答，發(fā)揮抗腫瘤效能，已經成為當今腫瘤治療性多肽疫苗研制領域的一個重要課 題。
[0004] 腫瘤抗原的發(fā)現及其CTL表位的鑒定是腫瘤特異性免疫治療以及腫瘤治療性多 肽疫苗研制的重要前提。表皮生長因子受體通路底物No. 8(Epidermal Growth Factor Receptor pathway substrate No. 8, EPS8)是表皮生長因子受體（EGFR)重要的激酶活性底 物之一。近年研宄顯示，EPS8在多種實體瘤（如宮頸癌、結直腸癌、垂體瘤、口腔鱗癌、胰腺 導管癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌及惡性膠質瘤等）及血液系統(tǒng)腫瘤（如多發(fā)性骨髓瘤、急 性髓系白血病、混合系白血病等）的組織及細胞中表達異常升高，而在正常組織表達很低 或無表達。進一步的研宄顯示，EPS8通過調控細胞周期促進腫瘤細胞的增殖，通過參與細 胞偽足的形成及與肌動蛋白的相互作用促進腫瘤細胞的轉移，通過影響腫瘤細胞對化療藥 物的耐受性與患者的預后相關(Li Y*，Xue T, He Y, Du J. A novel oncoprotein Eps8:new target for anti-cancer therapy. Future Oncology. 2013 (Accepted))。此外，本課題組 在前期的實驗研宄中發(fā)現，重組小鼠 rmHis-EpsS蛋白疫苗可有效誘導荷4T1乳腺癌小鼠產 生特異性抗腫瘤免疫應答，抑制小鼠體內腫瘤細胞的增殖，延長其生存時間，而對小鼠腦、 心、肝、腎、小腸、附睪組織無明顯的毒性作用。（He YJ, Zhou .T，Li Y*，et al. Eps8vaccine exerts prophylactic antitumor effects in a murine model: a novel vaccine for breast carcinoma. Mol Med Rep. 2013Aug;8 (2) :662-8)。因此，EPS8 是腫瘤診斷和抗腫瘤 治療的新靶點，在腫瘤免疫治療中具有巨大潛力。
[0005] 免疫原性弱和免疫耐受極大地限制了天然CTL表位在腫瘤治療性多肽疫苗中的 應用，因此，有效提高天然CTL表位的免疫原性并打破機體的免疫耐受成為腫瘤治療性多 肽疫苗發(fā)展的關鍵。在眾多腫瘤治療性多肽疫苗的增強策略中，對天然CTL表位進行分子 改造被認為是最行之有效的方法之一。由于CTL表位與主要組織相容性復合體（MHC)- I 類分子的結合是誘導CTL免疫應答的關鍵因素，而CTL表位與MHC- I類分子結合的重要基 礎是錨定殘基，因此，可通過改變錨定殘基或其相鄰位置的氨基酸殘基以達到增強免疫原 性而不影響特異性的目的。研宄發(fā)現，在九肽CTL表位中，第二位及第九位為HLA-A2. 1分 子的主要錨定位點，二位為Leu或Met，九位為Leu、Val或lie，能將表位與MHC結合的能力 提高10?100倍，而在一位引入Tyr則可依靠其側鏈苯環(huán)的疏水作用以及酚羥基的氫鍵作 用增強表位肽與HLA分子的相互作用。
[0006] 本申請主要采用理論和實驗相結合的方法，修飾并初步鑒定出與MHC- I類分子 具有強結合力并有效誘導抗腫瘤免疫應答的EPS8來源的候選CTL表位肽及其類似物。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明所要解決的一個技術問題是針對上述的技術現狀而提供一種腫瘤抗原 EPS8來源的HLA-A*0201限制性CTL表位，該表位能夠以高親和力結合HLA-A*0201分子，所 形成的復合物穩(wěn)定，能夠誘導肽特異性的CTL免疫應答，表現為刺激肽特異性CTL分泌高水 平的IFN-γ并對腫瘤細胞產生特異性殺傷效應。
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是針對上述的技術現狀而提供一種在腫瘤原 EPS8來源的HLA-A*0201限制性CTL表位肽在制備治療腫瘤藥物中的應用。
[0009] 本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：
[0010] EPS8 抗腫瘤 CTL 表位肽，為九肽，其序列為：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-V al，其中，a 為 Thr 或 Leu ;b-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe_c，其中，b 為 Ile 或 Tyr，c 為 Ile 或 Val ;Phe-Leu-Phe-Thr-Pr〇-Leu-Asn-Met-Val ;d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-V al，其中，d為Gln或Tyr。
[0011] 當 a 為 Thr 時，序列為 Trp-Thr-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val (即 WTQDMILQV，記 為 EPS8-101);
[0012] 當 a 為 Leu 時，序列為 Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val (WLQDMILQV，記為 EPS8-101-2L)；
[0013] 當 b 為 lie，c 為 Ile 時，序列為 Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Ile (即 ILDDIEFFI，記為 EPS8-276);
[0014] 當 b 為 lie，c 為 Val 時，序列為 Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val (艮P ILDDIEFFV，記為 EPS8-276-9V);
[0015] 當 b 為 Tyr，c 為 Val 時，序列為 Tyr-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val (艮P YLDDIEFFV，記為 EPS8-276-1Y9V);
[0016] Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val (即 FLFTPLNMV，記為 EPS8-360);
[0017] 當 d 為 Gln 時，序列為 Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val (即 QLAESVANV，記 為 EPS8-455);
[0018] 當 d 為 Tyr 時，序列為 Tyr-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val (即 YLAESVANV，記 為 EPS8-455-1Y)。
[0019] 此外，本發(fā)明涵蓋經過修飾的肽，其中替代或添加了一個、兩個或更多個氨基酸而 得到的序列，只要經過修飾的肽保留原始的CTL誘導能力。
[0020] 所述腫瘤抗原EPS8來源的HLA-A*0201限制性CTL表位在制備腫瘤治療性多肽疫 苗中的應用。
[0021] 其中，所述EPS8陽性腫瘤包括宮頸癌、結直腸癌、垂體瘤、口腔鱗癌、胰腺導管癌、 乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性膠質瘤、多發(fā)性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等。
[0022] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了來源于腫瘤抗原EPS8的天然CTL表位肽及 模擬表位肽，該CTL表位能夠肽能夠誘導肽特異性的CTL免疫應答，表現為可刺激肽特異性 CTL分泌高水平IFN-γ并對EPS8陽性腫瘤細胞產生特異性殺傷效應；由于腫瘤抗原EPS8 廣泛表達于不同類型的腫瘤組織中，因此，本發(fā)明的CTL表位肽可作為活性成分，和藥學上 課接受的載體組成組合物，或者，與其它具有藥理活性的提取物和/或合成藥物和藥學上 課接受的載體組成組合物，再按照藥學領域的常規(guī)方法制備基于抗原EPS8的腫瘤疫苗，用 于治療和/或預防EPS8表達陽性的腫瘤，和/或預防其手術后復發(fā)，在腫瘤免疫治療領域 具有很好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明表位肽誘導的特異性CTL分泌IFN-γ能力的檢測結果；
[0024] 圖2為本發(fā)明表位肽誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應的檢測結果；
[0025] 圖3為本發(fā)明表位肽EPS8-101誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應的 HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0026] 圖4為本發(fā)明表位肽EPS8-276誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應的 HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0027] 圖5為本發(fā)明表位肽EPS8-360誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應的 HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0028] 圖6為本發(fā)明表位肽EPS8-455誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應的 HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0029] 圖7為本發(fā)明表位肽EPS8-101-IY誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應 的HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0030] 圖8本發(fā)明表位肽為EPS8-276-9V誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效應 的HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0031] 圖9為本發(fā)明表位肽EPS8-276-1Y9V誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效 應的HLA-A*0201限制性檢測結果；
[0032] 圖10為本發(fā)明表位肽EPS8-455-1Y誘導的特異性CTL對腫瘤細胞特異性殺傷效 應的HLA-A*0201限制性檢測結果；
【具體實施方式】
[0033] 為以下將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。
[0034] 一、EPS8HLA-A*0201 限制性 CTL 表位的預測
[0035] 1、生物學軟件預測CTL表位
[0036] 本發(fā)明所述的EPS8來源的抗腫瘤CTL表位肽類似物，是根據抗原的一級結構，采 用免疫信息學手段，運動在線生物學軟件SYFPEITHI、BIMAS和NetMHC 3. 2對EPS8抗原結 構的HLA-A*0201限制性進行預測分析，篩選WTQDMILQV(記為EPS8-101)、ILDDIEFFI (記 為 EPS8-276)、FLFTPLNMV (記為 EPS8-360)及 QLAESVANV (記為 EPS8-455)作為候選 CTL表位肽，并根據HLA-A*0201限制性表位基序及其它位置上不同氨基酸殘基對表位 與HLA-A*0201分子親和力的影響，對上述天然CTL表位的主要錨定殘基或其相鄰位置 的氨基酸殘基進行替換，使CTL表位不包含不利于結合的氨基酸殘基或有利于結合的氨 基酸殘基多余不利于結合的氨基酸殘基，由此設計出4個模擬CTL表位：WLQDMILQV(記 為 EPS8-101-2L)、ILDDIEFFV (記為 EPS8-276-9V)、YLDDIEFFV (記為 EPS8-276-1Y9V)和 QLAESVANV (記為 EPS8-455)。
[0037] 二、候選模擬CTL表位的合成
[0038] 候選模擬CTL表位委托杭州中肽生化有限公司采用標準Fmoc方案進行合成，并采 用反相高效液相色譜法進行純化和純度分析，質譜法進行鑒定和分子量測定。結果顯示，各 候選模擬CTL表位的純度均高于95%，分子量與理論值相符。
[0039] 所得候選CTL表位肽用二甲基亞砜（DMSO)溶解制成儲備液，置溫度-70 °C保存，臨 時前用磷酸鹽緩沖液（PBS)稀釋。固相合成步驟可參考現有的技術。
[0040] 三、上述制備的CTL表位肽，可用于制備腫瘤治療性多肽疫苗，其應用實驗如下：
[0041] 3. 1、候選CTL表位肽與HLA-A*0201分子親和力試驗
[0042] (I) 800rpm離心收集HLA-A2. 1表達陽性且缺失內源性抗原加工處理能力的T2細 胞（ATCC公司），PBS洗滌3次，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞至細胞密度為I X IO6/ ml，接種于24孔板；
[0043] (2)每孔加入CTL表位肽、陽性對照肽（流感基質蛋白MP58_66:GILGFVFTL)或陰 性對照肽（Idi 〇type98_1Q6:AHTKDGFNF)至終濃度為50 μ g/ml (內含β 2微球蛋白3 μ g/ml)， 37°C，5% CO2、飽和濕度條件下孵育18h ;
[0044] (3)冰PBS洗滌3次后，加入FITC標記的HLA-A2. 1抗體，4°C避光孵育30min ;
[0045] (4)冰PBS洗滌3次后，流式細胞儀于波長488nm處測定平均熒光強度，并計算熒 光系數FI :FI=(樣品平均熒光強度-背景平均熒光強度）/背景平均熒光強度檢測。FI > 1. 5為高親和力，I. 0 < FI < 1. 5為中等親和力，FI < I. 0為低親和力。
[0046] 結果：如表1所示，EPS8-276、EPS8-360及EPS8-455表位肽與HLA-A2. 1分子具有 高親和力，EPS8-101表位肽具中等親和力；且改造肽與HLA-A2. 1分子的結合力均高于母體 肽。
[0047] 3. 2、候選CTL表位肽/HLA-A2. 1分子復合物穩(wěn)定性分析
[0048] (I) 800rpm離心收集T2A2細胞，用冰PBS洗滌3次，無血清RPMI 1640培養(yǎng)基（含 100ng/ml人β 2微球蛋白）重懸至細胞密度為I. 0 X l〇7ml，接種于24孔培養(yǎng)板；
[0049] (2)每孔加入CTL表位肽至終濃度為100 μ mol/ml，37°C、5% 0)2及飽和濕度條件 下孵育Wh ;
[0050] (3)冰PBS洗滌細胞4次，除去未結合的游離肽；
[0051] (4)每孔加入 Brefeldin A(BFA，Sigma 公司）至終濃度為 10 μ g/ml，37°C、5% CO2 及飽和濕度條件下孵育Ih ;
[0052] (5)冰PBS洗滌細胞1次；
[0053] (6)加入含0. 5 μ g/ml BFA的無血清1640培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2及飽和濕度條 件下分別孵育〇h、2h、4h、6h、8h ;
[0054] (7)孵育結束后，冰PBS洗滌3次，加入FITC標記的HLA-A2. 1抗體，4°C避光反應 30min ；
[0055] (8)冰PBS洗滌3次后，流式細胞儀于波長488nm處測定平均熒光強度。結果用表 位肽/HLA-A2. 1分子復合物的半衰期DC50表示。
[0056] 結果：如表1所不，8條表位肽/HLA-A2. 1復合物的半衰期均大于6h。
[0057] 表1表位肽與HLA-A2. 1分子結合力及穩(wěn)定性試驗結果
[0058]
【權利要求】
1. 一種EPS8抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其序列為：d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn -Val，其中，d 為 Gin 或 Tyr。
2. 根據權利要求1所述的EPS8抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于：在d為Gin時，其序 列為：Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val 〇
3. 根據權利要求1所述的EPS8抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于：在d為Tyr時，其序 列為：Tyr-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val。
4. 根據權利要求1所述的EPS8抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于：采用固相合成法制備 CTL表位肽。
5. 權利要求1?3任意一項權利要求所述的EPS8抗腫瘤CTL表位肽在制備治療腫瘤 藥物中的應用。
【文檔編號】A61K39/00GK104497125SQ201410857508
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李玉華, 周煒均 申請人:南方醫(yī)科大學