靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，所述的納米復(fù)合物是由第一生物分子修飾的金納米粒子和與所述第一生物分子互補的第二生物分子修飾的二氧化硅熒光納米粒子孵育反應(yīng)得到的復(fù)合物，本發(fā)明旨在提供一種能同時實現(xiàn)細胞成像、同步治療、實時監(jiān)測治療響應(yīng)三種功能的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，以及該納米復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。
【專利說明】靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學和納米醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，及其制備方法以及該納米復(fù)合物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]納米材料提供了一個堅實的支架，使得兩種或多種組分能夠被組合起來以提供具有協(xié)同作用的多功能納米醫(yī)藥平臺。納米粒子的表面組裝上用于靶向識別的組件(如抗體、核酸識配體或肽段等)、成像組件(如有機染料、量子點等)、細胞穿透組件(如受體結(jié)合肽段等)，而治療組件和控制藥物釋放的組件則包埋于納米粒子內(nèi)，從而組裝出多功能納米醫(yī)藥平臺。這些多功能納米復(fù)合物有望能檢測到腫瘤細胞、指示出它們的位置、將藥物靶向輸送到腫瘤細胞，同時監(jiān)測藥物治療響應(yīng)。將診斷功能和治療功能整合在一個單一系統(tǒng)內(nèi)是目前納米醫(yī)藥發(fā)展的一個重要方向，也將為未來個人化醫(yī)藥的應(yīng)用提供一個新的手段。
[0003]目前報道的多功能納米醫(yī)藥平臺，可大致分為三類:聚合物納米材料，成像組件和治療藥物被共包埋于聚合物納米粒子內(nèi)；無機納米材料，無機納米材料本身充當成像組件，而治療藥物或靶向試劑修飾于納米材料的表面；異質(zhì)納米材料，兩種或多種不同功能的納米粒子組裝起來以獲得多功能。聚合物納米材料通常是疏水性的，在水溶液中傾向于聚集，而且隨著邱值改變?nèi)菀着蛎洠@些性質(zhì)都極大地限制了聚合物多功能納米材料在生物醫(yī)學中的應(yīng)用。而無機納米材料并不容易制備，表面修飾方法不健全，穩(wěn)定性欠佳且有一定毒性，這些性質(zhì)都一定程度地限制了無機多功能納米材料在生物醫(yī)學中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種能同時實現(xiàn)細胞成像、同步治療、實時監(jiān)測治療響應(yīng)三種功能的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物。
[0005]同時，本發(fā)明的另外一個目的在于，提供該納米復(fù)合物的制備方法及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案提出結(jié)合二氧化硅熒光納米粒子豐富的發(fā)光性質(zhì)和金納米粒子的熒光猝滅特性及光熱效應(yīng)，組裝一種新型的異質(zhì)多功能納米復(fù)合物，同時實現(xiàn)細胞成像、同步治療、實時監(jiān)測治療響應(yīng)三種功能。
[0007]一種靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，所述的納米復(fù)合物是由第一生物分子修飾的金納米粒子和與所述第一生物分子互補的第二生物分子修飾的二氧化硅熒光納米粒子孵育反應(yīng)得到的復(fù)合物。
[0008]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物中，所述的二氧化硅熒光納米粒子的粒徑為50?8011111，優(yōu)選為58?62111110
[0009]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物中，所述的二氧化硅熒光納米粒子為包埋有熒光染料的二氧化硅熒光納米粒子。
[0010]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物中，所述的熒光染料為聯(lián)吡啶釕。當然，本發(fā)明并不限于熒光染料為聯(lián)吡啶釕，其還可以選擇為其他(16過渡金屬配合物，如銥配合物([11 ()32(1) 2= 0和錸配合物，或焚光納米粒子如0(136/2113量子點、碳量子點。
[0011]在上述的革[1向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物中，所述的金納米粒子的粒徑為5?3011111，優(yōu)選為12?1411111。
[0012]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物中，所述的第一生物分子為可以識別特定細胞的核酸適配體，所述的第二生物分子為與所述核酸適配體互補的0嫩序列。其特定細胞多為腫瘤細胞。
[0013]進一步優(yōu)選地，所述的第一生物分子為能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體，所述的第二生物分子為與能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株801-7404的核酸適配體互補配對的0嫩序列；或者所述的第一生物分子為能特異性識別人急性淋巴白血病細胞⑶即-⑶！的核酸適配體，所述的第二生物分子為與能特異性識別人急性淋巴白血病細胞的核酸適配體互補配對的0嫩序列；或者所述的第一生物分子為能特異性識別人肺腺癌細胞八549的核酸適配體，所述的第二生物分子為與能特異性識別人肺腺癌細胞八549的核酸適配體互補配對的0嫩序列；但是本方案并不為上述羅列的3種細胞為限，可以根據(jù)實際需要設(shè)計不同細胞對應(yīng)的核酸適配體，對此本發(fā)明不作過多限制。
[0014]本發(fā)明還提供上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備方法，所述的制備方法為:將含有第一生物分子修飾的金納米粒子的緩沖溶液和含有第二生物分子修飾的二氧化硅熒光納米粒子的緩沖溶液混合后置于孵育箱中以37?471:的溫度進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后進行離心并洗滌。
[0015]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備方法中，所述的含有第一生物分子修飾的金納米粒子的緩沖溶液通過以下步驟制備:
[0016]步驟1:將含有第一生物分子的溶液與粒徑為5?30=0的金納米粒子混合孵育10?20小時；
[0017]步驟2:向步驟1所得到的溶液中加入氯化鈉溶液，進行陳化20?30小時；
[0018]步驟3:將步驟2所得到的溶液離心分離出紅色固體；
[0019]步驟4:將步驟3得到的紅色固體用？83緩沖溶液洗滌2?4次，最后保存在？83緩沖溶液中。
[0020]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備方法中，所述的步驟1中，5?3011111的金納米粒子通過以下步驟得到:
[0021]子步驟1:將質(zhì)量百分比濃度為0.1?0.3%。的氯金酸在劇烈攪拌的條件下加熱至沸騰；
[0022]子步驟2:加入質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸鈉溶液加入到子步驟1的溶液中，繼續(xù)在沸騰的狀態(tài)下攪拌反應(yīng)10?20111111 ；
[0023]子步驟3:將子步驟2得到的溶液在20?3001=分鐘內(nèi)冷卻至室溫，并以41:的條件進行保存。
[0024]在上述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備方法中，所述的含有第二生物分子修飾的二氧化硅熒光納米粒子的緩沖溶液通過以下步驟制備:
[0025]步驟1:將粒徑為50?80110的羧基修飾的二氧化硅熒光納米粒子分散于腿3緩沖溶液中；加入含有1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和^羥基琥珀酰亞胺的123緩沖液，反應(yīng)20?40分鐘使羧基修飾的二氧化硅熒光納米粒子表面的羧基活化，并離心除去未反應(yīng)的小分子，然后重新分散到？83緩沖溶液中；
[0026]步驟2:將步驟1得到的？83緩沖溶液與含有第二生物分子的溶液混合并孵育2?10小時；
[0027]步驟3:將步驟2得到的溶液離心后除去上清液，然后分散到？83緩沖溶液中。
[0028]此外，本發(fā)明的另一個目的在于，提供該靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其具體為:對腫瘤細胞進行標定并向該腫瘤細胞輸送藥物以殺死該腫瘤細胞，同時用于評價復(fù)合物作用于該腫瘤細胞后的治療效果。
[0029]所述的腫瘤細胞可以包括人肝細胞性肝癌細胞株861-7404、人急性淋巴白血病細胞⑶即-⑶！、人肺腺癌細胞八549，但是本方案并不為上述羅列的3種細胞為限，可以根據(jù)實際需要設(shè)計不同細胞對應(yīng)的核酸適配體，對此本發(fā)明不作過多限制。
[0030]本發(fā)明的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物由二氧化硅納米粒子和金納米粒子組裝而成；將能夠識別癌細胞的生物分子修飾到同時充當熒光猝滅劑和光熱轉(zhuǎn)換器的金納米粒子上，而與其互補的生物分子則被修飾到充當熒光成像組件的二氧化硅納米粒子上，利用互補生物分子對之間的高親和力從而將二氧化硅納米粒子和金納米粒子組裝成多功能納米復(fù)合物，并將其用于在體外進行細胞成像和同步治療的同時，實時監(jiān)測細胞對治療的反應(yīng)。
[0031]金納米粒子在這一新型的多功能納米材料中將起雙重作用:作為熒光能量受體猝滅二氧化硅的熒光，和作為激光能量受體將光能轉(zhuǎn)化為熱能而殺死癌細胞。修飾于金納米粒子表面的生物分子也起雙重作用:組裝多功能納米材料和識別靶標細胞的功能。
[0032]發(fā)明提出的針對癌細胞的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特點是:多功能、集成化、高靈敏、容易調(diào)控，其具體為:
[0033]1) 二氧化硅納米顆粒具有水溶性、生物相容性，并且其表面容易進行修飾，其最大發(fā)射波長可以很容易的調(diào)控；
[0034]2)金納米粒子的大小和形狀容易控制，在可見光區(qū)有強吸收且吸收帶寬，對特定的發(fā)光波段具有很強的猝滅效應(yīng)；
[0035]3)通過調(diào)控，金納米粒子的吸收譜帶和二氧化硅納米粒子的發(fā)光譜帶可以很好的重疊，從而調(diào)控熒光能量轉(zhuǎn)移效率；
[0036]4)通過合理設(shè)計0嫩序列，可以精確控制金納米粒子和二氧化硅納米粒子之間的距離和相互作用的強度，從而調(diào)控熒光能量轉(zhuǎn)移的效率。
[0037]5)結(jié)合二氧化娃納米粒子和金納米粒子兩者的優(yōu)點研制出的多功能納米材料具有高性能和高靈敏的特點。當沒有靶標細胞存在時，由于金納米粒子的猝滅作用使納米器件不發(fā)光；當納米器件遇到靶標細胞并進入細胞時，由于細胞內(nèi)0他86的作用，二氧化硅納米粒子與金納米粒子分開，發(fā)出強熒光。信號從無到有，靈敏度高。
[0038]結(jié)合二氧化娃納米粒子和金納米粒子兩者的優(yōu)點研制出的多功能納米材料具有多功能和集成化的特點。這一多功能納米材料可在實現(xiàn)細胞成像和同步治療的同時，監(jiān)測細胞對藥物治療的響應(yīng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為實施例1的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的組裝和應(yīng)用原理圖。
[0040]圖2為實施例1的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的電鏡圖。

【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0042]實施例1
[0043]靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物通過以下步驟制備:
[0044]步驟1:直徑為6011111的二氧化硅熒光納米粒子的制備:向50^1圓底燒瓶中加入7.5111[環(huán)己烷，1.77齓1-100,1.8111[正己醇和340 重蒸水。均勻攪拌200111后，反應(yīng)體系形成了油包水的微乳體系，然后再向混合物中緩慢滴加80 VI 0.111101/1聯(lián)吡啶釕水合物以及100 4 [四甲氧基娃氧燒，反應(yīng)30111111后，加入60 VI 28%氨水使娃氧燒水解。室溫下反應(yīng)2處以后，再加入50 VI四甲氧基硅氧烷和50 VI 0X28(羧基乙基硅烷三醇)，隨后再在室溫下反應(yīng)2處。待反應(yīng)完成，向反應(yīng)體系中加入20此丙酮破乳，接著超聲，渦旋，80001'卹離心。按照以上方法再用乙醇洗兩次，水洗一次后，將得到的二氧化硅熒光納米粒子分散于重蒸水中待用。
[0045]步驟2:直徑為13鹽的金納米粒子的制備:將100111[蒸館|水和2?[質(zhì)量分數(shù)為1%的氯金酸，加入到250??！^三頸燒瓶中，并在劇烈攪拌的條件下加熱至沸騰。然后，迅速將新鮮配制的質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸鈉溶液加入到上述沸騰溶液中，反應(yīng)15-=后，繼續(xù)攪拌使溶液冷卻至室溫，于41:保存。
[0046]步驟3:將能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體修飾于金納米粒子上:將序列為 5, -118-^166^161666^66666^010^66^0^61 0^0666^-3；的核酸適配體配制成濃度10 ^1，取100 VI上述0嫩溶液與50 金納米顆粒混合孵育16卜后，加21恥?:1使其最終濃度為0.11，陳化2處后，用0.1I ？83七6 811打61*6(1 &111=6,磷酸緩沖液)(師.2)離心洗3次后，得到的紅色物質(zhì)溶解在200 111 0.1I ^88(^7.2)緩沖溶液中。在本實施例中，單位1、V1、禮中1均代表11101/1。
[0047]步驟4:將與能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體互補配對的0嫩序列修飾于二氧化硅熒光納米粒子上:將0.制備的羧基修飾的二氧化硅熒光納米粒子分散在20此的123(2-^-嗎啡啉-乙磺酸緩沖溶液)緩沖溶液中(邱=5.5)，加入20[含有211)1(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(￡00和5禮^羥基琥珀酰亞胺(順3)的123緩沖液，反應(yīng)30-11使二氧化硅表面的羧基活化，離心除去未反應(yīng)的小分子，重新分散在？83緩沖液中(1)? = 7.4)。將序列為:
[0048]3,的 0嫩序列配制成濃度10 V1，取50 VI上述0嫩溶液與100 V I 二氧化硅熒光納米粒子混合孵育6卜，待反應(yīng)完成以后，將所得到的納米復(fù)合物用離心機在5000印！11離心10分鐘后除去上清液，然后用去離子水洗滌3次后其分散于0.1I ^88(^7.2)緩沖液中備用。
[0049]步驟5:靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備:取200 V I修飾有能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體的金納米粒子與20 V I修飾有能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體互補配對的0嫩序列的二氧化硅熒光納米粒子在421:孵育箱混合反應(yīng)過夜。待反應(yīng)完成以后，將所得到的納米復(fù)合物用離心機在500011)111離心10分鐘后除去上清液，然后用4X330(85111116 80(1111111 011:1-81:6,檸檬酸鈉緩沖液),2^880,1^880,0.5X880 37。。各洗 20- ^0.2X880 37。。洗 10—；0.2X3%與0.1I ？88各洗10—后，分散于0.1I ？88 (￠117.2)緩沖液中備用，得到含有靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的？83緩沖溶液，所獲得的納米復(fù)合物電鏡圖片如圖2所示。
[0050]通過上述步驟得到的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其具體的原理如圖1所示，首先，在金納米粒子1上修飾能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體，得到能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體金納米粒子3，同時在二氧化硅熒光納米粒子2上修飾能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體互補配對的0嫩序列，得到修飾有能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的核酸適配體互補配對的0嫩序列的二氧化硅熒光納米粒子4，經(jīng)過反應(yīng)后組裝得到靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合5，當核酸適配體識別到人肝細胞性肝癌細胞株861-7404時，進入人肝細胞性肝癌細胞6中，在溶酶體0似86的作用下，二氧化硅納米粒子與金納米粒子分開，二氧化硅納米粒子發(fā)出強熒光。信號從無到有，靈敏度高。同時，在外界輸入的激光的作用下金納米粒子將光能轉(zhuǎn)化為熱能，殺死人肝細胞性肝癌細胞。
[0051]當核酸適配體未識別到人肝細胞性肝癌細胞株861-7404時，金納米粒子對二氧化硅納米粒子所產(chǎn)生的熒光具有很強的猝滅效應(yīng)，同時金納米粒子的吸收譜帶和二氧化硅熒光納米粒子的發(fā)光譜帶可以很好的重疊，從而調(diào)控熒光能量轉(zhuǎn)移效率，使其不會發(fā)出強熒光。
[0052]在實際應(yīng)用中，醫(yī)生可以根據(jù)熒光來判斷人肝細胞性肝癌細胞株861-7404的位置，并輸出合適的頻譜和波段的激光來殺死人肝細胞性肝癌細胞，并根據(jù)治療后的熒光效果判斷診療效果，實現(xiàn)細胞成像、同步治療、實時監(jiān)測治療響應(yīng)三種功能。
[0053]實施例2
[0054]另一種靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物通過以下步驟制備:
[0055]步驟1:直徑為50110的二氧化硅熒光納米粒子的制備:向50此圓底燒瓶中加入7.5111[環(huán)己烷，1.771111 1^-100，1.8齓正己醇和340 V I重蒸水。均勻攪拌200111后，反應(yīng)體系形成了油包水的微乳體系，然后再向混合物中緩慢滴加80 V I 0.3111^/1綠色熒光碳點水溶液(最大發(fā)射波長52011111)以及100 V [四甲氧基硅氧烷，反應(yīng)30-11后，加入60 VI 28%氨水使娃氧燒水解。室溫下反應(yīng)2411以后，再加入30 VI四甲氧基娃氧燒和30 VI (3123(羧基乙基娃燒二醇)，隨后再在室溫下反應(yīng)1811。待反應(yīng)完成，向反應(yīng)體系中加入201111^丙酬破乳，接著超聲，渦旋，80001'即離心。按照以上方法再用乙醇洗兩次，水洗一次后，將得到的二氧化硅熒光納米粒子分散于重蒸水中待用。
[0056]步驟2:直徑為511111的金納米粒子的制備:將70111[蒸館|水和10111[質(zhì)量分數(shù)為0.1%氯金酸，加入到250??！^三頸燒瓶中，并在劇烈攪拌的條件下加熱至沸騰。然后，迅速將新鮮配制的4此質(zhì)量分數(shù)為1%檸檬酸鈉和5此質(zhì)量分數(shù)為1%單寧酸的混合溶液加到上述沸騰溶液中，反應(yīng)10-=后，繼續(xù)攪拌使溶液冷卻至室溫，于41:保存。
[0057]步驟3:將能特異性識別人急性淋巴白血病細胞的核酸適配體修飾于金納米粒子上:將序列為 5,^10 0X6 0X6 060 060 066 6^ 八八丁^0X61^ 066 11八6^-3 ；的核酸適配體配制成濃度10 ^1，取100 V I上述0嫩溶液與50^1金納米顆粒混合孵育1611后，加21 ^01使其最終濃度為0.11，陳化2處后，用0.1I^88(^11081)1181:6 811打61*6(1 8^11116,磷酸鹽緩沖液)(￠117.2)離心洗3次后，得到的紅色物質(zhì)溶解在200仏0.1I ？88 (￠117.2)緩沖溶液中。
[0058]步驟4:將與能特異性識別人急性淋巴白血病細胞的核酸適配體互補配對的0嫩序列修飾于二氧化硅熒光納米粒子上:將0.18制備的羧基修飾的二氧化硅熒光納米粒子分散在20此的123(2-^-嗎啡啉乙磺酸緩沖溶液)緩沖溶液中(邱=5.5)，加入20[含有211)1(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(￡00和5禮^羥基琥珀酰亞胺(順3)的123緩沖液，反應(yīng)30-11使二氧化硅表面的羧基活化，離心除去未反應(yīng)的小分子，重新分散在？83緩沖液中(1)? = 7.4)。將序列為:
[0059]5 丨-順2-丁?: I'八八 006 1^0 ^61 八丁丁 1X0 006 606 606 0^6 0^6 I'丁八以!-3丨的0嫩序列配制成濃度10 V1，取50 V [上述0嫩溶液與100 V [二氧化硅熒光納米粒子混合孵育6匕待反應(yīng)完成以后，將所得到的納米復(fù)合物用離心機在500011)111離心10分鐘后除去上清液，然后用去離子水洗滌3次后其分散于0.1I ^88(^7.2)緩沖液中備用。
[0060]步驟5:靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備:取200 V I修飾有能特異性識別人急性淋巴白血病細胞的核酸適配體的金納米粒子與20 VI修飾有能特異性識別人急性淋巴白血病細胞的核酸適配體互補配對的0嫩序列的二氧化硅熒光納米粒子在421:孵育箱混合反應(yīng)過夜。待反應(yīng)完成以后，將所得到的納米復(fù)合物用離心機在5000印111離心10分鐘后除去上清液，然后用5X88037X:各洗20111111 ；0丨2X880 37。〇洗100111 ；0丨之父撕與。.1I ？83各洗10-11后，分散于0.1I^88(^7.2)緩沖液中備用，得到含有靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的？83緩沖溶液。
[0061]實施例3
[0062]另一種靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物通過以下步驟制備:
[0063]步驟1:直徑為8011111的二氧化硅熒光納米粒子的制備:向50此圓底燒瓶中加入7.5111[環(huán)己烷，1.771111 1^-100,1.80[正己醇和340 重蒸水。均勻攪拌200111后，反應(yīng)體系形成了油包水的微乳體系，然后再向混合物中緩慢滴加80^1 0.308/1銥配合物([11- (132^) 2 (0?) 21101最大發(fā)射波長530=111)以及100 IXI四甲氧基娃氧燒，反應(yīng)30111111后，加入60 28%氨水使娃氧燒水解。室溫下反應(yīng)2411以后，再加入100 V [四甲氧基娃氧烷和100^1 (:123(羧基乙基硅烷三醇)，隨后再在室溫下反應(yīng)30卜。待反應(yīng)完成，向反應(yīng)體系中加入20此丙酮破乳，接著超聲，渦旋，80001'卹離心。按照以上方法再用乙醇洗兩次，水洗一次后，將得到的二氧化硅熒光納米粒子分散于重蒸水中待用。
[0064]步驟2:直徑為30110的金納米粒子的制備:將100?[質(zhì)量分數(shù)為0.01%氯金酸，加入到250！！^三頸燒瓶中，并在劇烈攪拌的條件下加熱至沸騰。然后，迅速將新鮮配制的11111質(zhì)量分數(shù)為1%檸檬酸鈉溶液加入到上述沸騰溶液中，反應(yīng)15-=后，繼續(xù)攪拌使溶液冷卻至室溫，于41:保存。
[0065]步驟3:將能特異性識別人肺腺癌細胞八549的核酸適配體修飾于金納米粒子上:將序列為 5,的核酸適配體配制成濃度10 V1，取100 VI上述0嫩溶液與50 金納米顆?；旌戏跤?6卜后，加21 ^01使其最終濃度為0.11，陳化2處后，用0.1I ^88(^1108^6 811打61*6(1 8^11116,磷酸鹽緩沖液)(邱7.2)離心洗3次后，得到的紅色物質(zhì)溶解在200 111 0.1I ？88 (邱7.2)緩沖溶液中。
[0066]步驟4:將與能特異性識別人肺腺癌細胞八549的核酸適配體互補配對的0嫩序列修飾于二氧化硅熒光納米粒子上:將0.18制備的羧基修飾的二氧化硅熒光納米粒子分散在20此的123(2-^-嗎啡啉乙磺酸緩沖溶液)緩沖溶液中(邱=5.5)，加入2此含有211)1(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(￡00和5禮^羥基琥珀酰亞胺(順3)的123緩沖液，反應(yīng)3001=使二氧化硅表面的羧基活化，離心除去未反應(yīng)的小分子，重新分散在？83緩沖液中(1)? = 7.4)。將序列為:
[0067]51 -順2—八丁?: ^6 006 八八?:益丁 IX八 000 ^ IX八 000 八IX 161 106 ^-31的0嫩序列配制成濃度10 V1，取50 “上述0嫩溶液與100 V I 二氧化硅熒光納米粒子混合孵育611，待反應(yīng)完成以后，將所得到的納米復(fù)合物用離心機在5000印111離心10分鐘后除去上清液，然后用去離子水洗滌3次后其分散于0.1I ^88(^7.2)緩沖液中備用。
[0068]步驟5:靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備:取200 V I修飾有能特異性識別人肺腺癌細胞八549的核酸適配體的金納米粒子與20 VI修飾有能特異性識別人肺腺癌細胞八549的核酸適配體互補配對的0嫩序列的二氧化硅熒光納米粒子在42。〇孵育箱混合反應(yīng)過夜。待反應(yīng)完成以后，將所得到的納米復(fù)合物用離心機在5000印111離心10分鐘后除去上清液，然后用4X3% (82111116 80(1111111。1廿社6，檸檬酸鈉緩沖液)、2 X 3%、1^880,0.5X880 371^^2011111^0.2^33(: 371^1011111^0.2^33(:^0.11 ？83 各洗10111111后，分散于0.1I ？88(￠117.2)緩沖液中備用，得到含有靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的？83緩沖溶液。
[0069]在本發(fā)明中，“第一”、“第二”僅表示對不同的分子予以區(qū)別，并不代表為對其具體結(jié)構(gòu)的任何限制。
[0070]以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種革E向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的納米復(fù)合物是由第一生物分子修飾的金納米粒子和與所述第一生物分子互補的第二生物分子修飾的二氧化硅熒光納米粒子孵育反應(yīng)得到的復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的二氧化娃焚光納米粒子的粒徑為50?80nm，所述的金納米粒子的粒徑為5?30nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的二氧化硅熒光納米粒子為包埋有熒光染料的二氧化硅熒光納米粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的熒光染料為聯(lián)吡啶釕；或者所述的熒光染料為綠色熒光碳點；或者所述的熒光染料為銥配合物[Ir(bzq) Jbpy(OH)2]]Cl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的第一生物分子為可以識別特定細胞的核酸適配體，所述的第二生物分子為與所述核酸適配體互補的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的第一生物分子為能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株Bel-7404的核酸適配體，所述的第二生物分子為與能特異性識別人肝細胞性肝癌細胞株Bel-7404的核酸適配體互補配對的DNA序列；或者所述的第一生物分子為能特異性識別人急性淋巴白血病細胞CCRF-CEM的核酸適配體，所述的第二生物分子為與能特異性識別人急性淋巴白血病細胞CCRF-CEM的核酸適配體互補配對的DNA序列；或者所述的第一生物分子為能特異性識別人肺腺癌細胞A549的核酸適配體，所述的第二生物分子為與能特異性識別人肺腺癌細胞A549的核酸適配體互補配對的DNA序列。
7.一種如權(quán)利要求1至6任一所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述的制備方法為:將含有第一生物分子修飾的金納米粒子的緩沖溶液和含有第二生物分子修飾的二氧化硅熒光納米粒子的緩沖溶液混合后置于孵育箱中以37?47°C的溫度進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后進行離心并洗滌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述的含有第一生物分子修飾的金納米粒子的緩沖溶液通過以下步驟制備: 步驟1:將含有第一生物分子的溶液與粒徑為5?30nm的金納米粒子混合孵育10?20小時； 步驟2:向步驟I所得到的溶液中加入氯化鈉溶液，進行陳化20?30小時； 步驟3:將步驟2所得到的溶液離心分離出紅色固體； 步驟4:將步驟3得到的紅色固體用PBS緩沖溶液洗滌2?4次，最后保存在PBS緩沖溶液中。
9.一種如權(quán)利要求1?6任一所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物用于對腫瘤細胞進行錨定并向該腫瘤細胞輸送藥物以殺死該腫瘤細胞，同時用于評價藥物作用于該腫瘤細胞后的治療效果。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶向輸送藥物和監(jiān)測治療響應(yīng)的納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤細胞包括人肝細胞性肝癌細胞株Bel-7404、人急性淋巴白血病細胞 CCRF-CEM、人肺腺癌細胞A549。
【文檔編號】A61K47/48GK104491883SQ201410849424
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】易長青, 潘益, 張肇敏 申請人:中山大學