本發(fā)明涉及一種提取大黃中有效成分的方法，尤其涉及一種提取大黃中總蒽醌的方法。

背景技術(shù)：
大黃為蓼科植物唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.exBalf.)、掌葉大黃(RheumpalmatumL.)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根及根莖。大黃中含有多種成分，包括蒽醌類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、苯丁酮類(lèi)、二苯乙烯等，其中蒽醌類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)成分含量較高。大黃蒽醌類(lèi)成分分游離型和結(jié)合型兩種，統(tǒng)稱(chēng)大黃總蒽醌，大黃中總蒽醌的含量約為2％～5％，其中游離型蒽醌僅占10～20％，游離型蒽醌主要為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，結(jié)合型蒽醌主要為上述5個(gè)游離型蒽醌與葡萄糖結(jié)合的苷，即游離型蒽醌與結(jié)合型蒽醌是苷元和苷的關(guān)系(大黃炮制前后物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律研究[D].李麗.北京：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，2011)。大黃蒽醌類(lèi)成分具有多種藥理活性，但游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌具有不同藥理活性(RP-HPLC-DAD同時(shí)測(cè)定大黃中9種有效成分的含量[J].程小麗，魏勝利，劉春生，等.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(18)：99-102)。近年來(lái)的研究也表明，長(zhǎng)期過(guò)量應(yīng)用大黃可引起肝腎損害，其毒性成分也可能是其所含的蒽醌類(lèi)成分，但結(jié)合型蒽醌和游離型蒽醌的毒性也不一樣，前者大于后者(炮制對(duì)大黃化學(xué)成分和肝腎毒性的影響及其典型相關(guān)分析[J].王伽伯，馬永剛，張萍，等.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(8)：885-890)。因此，從大黃中提取總蒽醌或分別提取結(jié)合型蒽醌和游離型蒽醌對(duì)研究大黃的藥效、毒性及毒-效關(guān)系更有意義。目前從大黃中提取蒽醌類(lèi)成分的文獻(xiàn)報(bào)道或公開(kāi)的專(zhuān)利可分為提取總游離蒽醌和提取總蒽醌兩大類(lèi)。從大黃中提取總蒽醌需分游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌兩個(gè)部分進(jìn)行。游離型蒽醌的提取較為簡(jiǎn)單。結(jié)合型蒽醌的提取存在兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。第一，結(jié)合型蒽醌和鞣質(zhì)均為水溶性成分，需要經(jīng)特殊處理才能去除鞣質(zhì)。通常去除鞣質(zhì)的方法有：(1)大孔樹(shù)脂吸附結(jié)合型蒽醌；(2)聚酰胺吸附鞣質(zhì)；(3)明膠法或改良明膠法沉淀鞣質(zhì)等。第二，結(jié)合型蒽醌容易水解，提取過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌?，F(xiàn)有技術(shù)中提取分離工藝較為復(fù)雜，容易導(dǎo)致結(jié)合型蒽醌脫糖轉(zhuǎn)化為其苷元(游離型蒽醌)，最終得到的產(chǎn)物大部分為游離型蒽醌，導(dǎo)致提取大黃總蒽醌中的結(jié)合型蒽醌占比低。從目前涉及大黃總蒽醌提取的技術(shù)來(lái)看，多存在工藝繁瑣、不易操作，結(jié)合型蒽醌破壞嚴(yán)重，或者兩者兼有等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種提取大黃中總蒽醌的方法，包括如下步驟：(A)取大黃粗粉，用乙醇提取，得乙醇提取液；(B)濃縮乙醇提取液至無(wú)醇味，得浸膏；(C)浸膏加水混勻產(chǎn)生沉淀，分離沉淀，得到沉淀物和上清液；(D)沉淀物采用鹽酸/氯仿回流，冷卻后分離氯仿層，氯仿層除去氯仿得游離型蒽醌；(E)濃縮上清液，加入濃乙醇至含醇量80％，加堿調(diào)節(jié)PH至不再產(chǎn)生沉淀，除去沉淀，調(diào)節(jié)剩余溶液PH至6.0-7.0，除去乙醇，調(diào)節(jié)剩余溶液PH值至1.0-2.0，低溫冷藏得沉淀，除去溶劑，得到的固體即為結(jié)合型蒽醌；(F)混合游離型蒽醌與結(jié)合型蒽醌，得大黃總蒽醌。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案。作為優(yōu)選，步驟(A)中所述乙醇提取為乙醇加熱回流提取，乙醇濃度為55％-95％，乙醇用量為藥材量的3-5倍，提取次數(shù)為3-5次，提取時(shí)間為30-60分鐘/次。作為優(yōu)選，步驟(B)中所述濃縮為減壓濃縮。作為優(yōu)選，步驟(C)中所述加水的加水量為浸膏體積的10-15倍。作為優(yōu)選，步驟(D)中所述鹽酸/氯仿的體積為所述沉淀物體積的4-5倍。作為優(yōu)選，所述鹽酸濃度為8％。作為優(yōu)選，步驟(E)中所述堿為強(qiáng)堿，所述低溫為2-4℃。作為優(yōu)選，所述游離型蒽醌包括：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚；所述結(jié)合型蒽醌包括：蘆薈大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黃酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷。作為優(yōu)選，所述大黃總蒽醌中總蒽醌含量超過(guò)50％，其中總蒽醌中結(jié)合型蒽醌占比超過(guò)30％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：簡(jiǎn)化了總蒽醌提取的工藝，操作簡(jiǎn)便，縮短了生產(chǎn)周期；能較大程度保留結(jié)合型蒽醌，提高了大黃總蒽醌提取物中的結(jié)合型蒽醌占比。附圖說(shuō)明圖1是對(duì)照品高效液相色譜圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例3制備的大黃總蒽醌的高效液相色譜圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3制備的大黃總蒽醌的高效液相色譜圖中20個(gè)色譜峰紫外吸收光譜圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1取產(chǎn)自甘肅禮縣掌葉大黃粗粉50g，加5倍量55％的乙醇，加熱回流提取5次，每次30分鐘，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，并適當(dāng)濃縮得浸膏，浸膏冷卻后加入10倍量去離子水，攪拌均勻，每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，得上清液A和沉淀A。上清液A適當(dāng)濃縮，放冷后加入95％乙醇，使含醇量達(dá)80％，加10％氫氧化鈉溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液用鹽酸調(diào)PH至6.0～7.0，減壓回收乙醇，冷卻后用鹽酸調(diào)PH至1.0～2.0，至4℃冰箱冷藏24～48小時(shí)，抽濾，濾餅真空干燥，得結(jié)合型蒽醌；沉淀A中加入4～5倍8％鹽酸及4～5倍氯仿加熱回流1小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液分取氯仿層，濾餅加固體8％鹽酸及氯仿重復(fù)操作5次，合并氯仿提取液，減壓回收氯仿后真空干燥，得游離型蒽醌。將游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌混合均勻，得大黃總蒽醌。定性定量分析結(jié)果：所得大黃總蒽醌高效液相色譜圖標(biāo)定主要色譜峰20個(gè)，均具有大黃蒽醌類(lèi)成分的紫外吸收特征，其中8個(gè)成分分別被鑒定為蘆薈大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黃酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。大黃總蒽醌中總蒽醌的含量為54.78％，結(jié)合型蒽醌占比為33.88％。實(shí)施例2取掌葉大黃粗粉50g，加3倍量75％的乙醇，加熱回流提取4次，每次45分鐘，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，并適當(dāng)濃縮得浸膏，浸膏冷卻后加入10倍量去離子水，攪拌均勻，每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，得上清液A和沉淀A。上清液A適當(dāng)濃縮，放冷后加入95％乙醇，使含醇量達(dá)80％，加10％氫氧化鈉溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液用鹽酸調(diào)PH至6.0～7.0，減壓回收乙醇，冷卻后用鹽酸調(diào)PH至1.0～2.0，至4℃冰箱冷藏24～48小時(shí)，抽濾，濾餅真空干燥，得結(jié)合型蒽醌；沉淀A中加入4～5倍8％鹽酸及4～5倍氯仿加熱回流1小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液分取氯仿層，濾餅加固體8％鹽酸及氯仿重復(fù)操作5次，合并氯仿提取液，減壓回收氯仿后真空干燥，得游離型蒽醌。將游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌混合均勻，得大黃總蒽醌。定性定量分析結(jié)果：所得大黃總蒽醌高效液相色譜圖標(biāo)定主要色譜峰20個(gè)，均具有大黃蒽醌類(lèi)成分的紫外吸收特征，其中8個(gè)成分分別被鑒定為蘆薈大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黃酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。大黃總蒽醌中總蒽醌的含量為56.27％，結(jié)合型蒽醌占比為31.37％。實(shí)施例3取掌葉大黃粗粉50g，加4倍量95％的乙醇，加熱回流提取3次，每次60分鐘，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，并適當(dāng)濃縮得浸膏，浸膏冷卻后加入10倍量去離子水，攪拌均勻，每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，得上清液A和沉淀A。上清液A適當(dāng)濃縮，放冷后加入95％乙醇，使含醇量達(dá)80％，加10％氫氧化鈉溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液用鹽酸調(diào)PH至6.0～7.0，減壓回收乙醇，冷卻后用鹽酸調(diào)PH至1.0～2.0，至4℃冰箱冷藏24～48小時(shí)，抽濾，濾餅真空干燥，得結(jié)合型蒽醌；沉淀A中加入4～5倍8％鹽酸及4～5倍氯仿加熱回流1小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液分取氯仿層，濾餅加固體8％鹽酸及氯仿重復(fù)操作5次，合并氯仿提取液，減壓回收氯仿后真空干燥，得游離型蒽醌。將游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌混合均勻，得大黃總蒽醌。定性定量分析結(jié)果：所得大黃總蒽醌高效液相色譜圖標(biāo)定主要色譜峰20個(gè)，均具有大黃蒽醌類(lèi)成分的紫外吸收特征，其中8個(gè)成分分別被鑒定為蘆薈大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黃酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。大黃總蒽醌中總蒽醌的含量為59.43％，結(jié)合型蒽醌占比為32.36％。定性定量分析方法：(1)色譜條件AgilentTC-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1％磷酸水(B)梯度洗脫(0～10min，5％～30％A；10～40min，30％～60％A；40～60min，60％A；60～70min：60％～100％A；70～80min，100％A)；流速1ml/min；柱溫30℃；二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，提取紫外吸收光譜圖定性，定量波長(zhǎng)430nm。(2)溶液制備對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取蘆薈大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黃酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚適量，置量瓶中加甲醇溶解，配成以上8種對(duì)照品含量分別為0.0315、0.0204、0.0098、0.0150、0.0098、0.0099、0.0263、0.0594mg/ml的混合對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取約相當(dāng)于大黃藥材0.2g的總蒽醌提取物，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30分鐘，使其溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液(剩余濾液備用)，即得?？傒祯┰嚻啡芤旱闹苽洌壕芰咳　肮┰嚻啡芤旱闹苽洹表?xiàng)下的剩余濾液10ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8％鹽酸溶液20ml，再加三氯甲烷20ml，加熱回流2小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷振搖提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。(3)定性分析分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按“色譜條件”測(cè)定，提取430nm波長(zhǎng)下的高效液相色譜圖，標(biāo)定主要吸收峰，并提取其紫外吸收管譜圖，參考相關(guān)文獻(xiàn)，判定其是否具有大黃蒽醌成分紫外吸收特征，進(jìn)一步通過(guò)與8個(gè)對(duì)照品色譜圖保留時(shí)間及紫外吸收光譜圖比對(duì)，判定是否存在蘆薈大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黃酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黃素‐8‐O‐葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚。(4)定量分析線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、30μL，注入高效液相色譜儀，按“色譜條件”進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積值Y對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行回歸處理，得8種成分的回歸方程及線性范圍，見(jiàn)下表。8種成分回歸方程及線性范圍樣品測(cè)定及含量計(jì)算：分別精密吸取供試品溶液、總蒽醌供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按“色譜條件”測(cè)定，將各成分峰面積代入回歸方程，計(jì)算各其在樣品中的含量?？傒祯浚娇傒祯┰嚻啡芤簻y(cè)得的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚含量之和。結(jié)合型蒽醌含量＝總蒽醌含量減去供試品溶液測(cè)得的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚含量之和。結(jié)合型蒽醌占比＝結(jié)合型蒽醌含量/總蒽醌含量×100％上述說(shuō)明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。