基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法及其產(chǎn)品，具體方法是將丙烯酰胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯酰胺溶解于PBS溶液或水中，超聲，得混合液A；再用烯鍵修飾二氧化硅脂質(zhì)體，然后將蛋白分子分散于烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體溶液中攪拌，真空脫氣得混液B；氮氣保護下將混合溶液A滴加入混合溶液B中，吹氮氣，攪拌預(yù)聚合，然后氮氣保護下滴加過硫酸銨和四甲基乙二胺引發(fā)聚合，繼續(xù)攪拌，透析，得基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體；制得的基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體由二氧化硅修飾的脂質(zhì)體作為核，丙烯酰胺類化合物和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺作為殼，能主動識別病灶部位的靶蛋白，能用于介導(dǎo)主動靶向遞藥。
【專利說明】基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法及其產(chǎn)品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法，還涉及由該方法制得的產(chǎn)品。

【背景技術(shù)】
[0002]分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，MIT)，亦稱分子印記技術(shù)、分子烙印技術(shù)或分子模板技術(shù)，是一種新興的分子識別技術(shù)，其目的是制備對模板分子具有特異選擇性識別能力的聚合物，即分子印跡聚合物(MIPs)。分子印跡技術(shù)發(fā)展至今，相較于小分子印跡技術(shù)的日趨成熟，蛋白質(zhì)等生物大分子印跡技術(shù)還相對滯后。分子印跡材料與模板蛋白的結(jié)合類似“抗原一抗體”的特異性結(jié)合，印跡材料在高溫、高壓、極端PH條件和有機試劑中可保持穩(wěn)定，便于儲存，所以研發(fā)可以在生理條件下識別蛋白質(zhì)、從而模擬自然過程的分子印跡“人造抗體”具有很大的潛在應(yīng)用價值。
[0003]與傳統(tǒng)印跡技術(shù)相比，表面分子印跡因制備所得聚合物的識別位點處于材料表面，能有效改善傳統(tǒng)方法導(dǎo)致的模板分子過度包埋、不易脫除等問題，這對于蛋白質(zhì)等大分子印跡有著重要意義。為使所得印跡聚合物粒子化、均一化(微球、納米粒等)，研宄者們往往采用核-殼結(jié)構(gòu)材料來實現(xiàn)表面印跡的目標，即:用預(yù)先制備好的微球或納米粒作為支撐基質(zhì)(“核”)，其上形成的印跡聚合物覆蓋表面為“殼”。這種核-殼結(jié)構(gòu)的印跡策略在通常印跡所需的功能單體之外又引入了一類新的材料，即支撐基質(zhì)材料。二氧化硅材料具有表面易于修飾、穩(wěn)定性強、化學(xué)/生物惰性、粒徑和分散性可控等特點且其早已被應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，因此，二氧化硅是一類較為理想的支撐基質(zhì)材料，依托二氧化硅粒子開展表面印跡有望實現(xiàn)對模板蛋白的有效識別并具有較好的潛在應(yīng)用價值。
[0004]通過在藥物載體表面修飾針對特定疾病組織靶分子(多為蛋白質(zhì))的配體來介導(dǎo)并提高載藥系統(tǒng)對靶區(qū)的識別是實現(xiàn)主動靶向遞藥的重要途徑。由于生物類分子(如多肽、抗體、核酸適配體等)往往面臨體內(nèi)穩(wěn)定性的問題，而表面分子印跡具有“人工抗體”/ “人工配體”的潛力且印跡位點穩(wěn)定性強，因此，針對疾病相關(guān)靶蛋白開展表面印跡有可能為主動靶向遞藥提供新的手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法，該制備方法簡單、快捷、成本低；本發(fā)明的目的之二在于提供由上述方法制得的基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟:取丙烯酰胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯酰胺按質(zhì)量比為I?5:1溶解至pH6.8?7.4、濃度為0.02?0.1M的PBS溶液或水中，超聲，得混合液A ;再用烯鍵修飾二氧化硅脂質(zhì)體，然后將蛋白分子分散于烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體溶液中攪拌，真空脫氣得混合液B ;氮氣保護下將混合液A按體積比為1:1?1:10滴加入混合液B中，吹氮氣，攪拌預(yù)聚合，然后氮氣保護下滴加過硫酸銨和四甲基乙二胺引發(fā)聚合，繼續(xù)攪拌，透析，得基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體。
[0008]本發(fā)明中丙烯酰胺類化合物優(yōu)選為N-異丙基丙烯酰胺或丙烯酰胺，丙烯酰胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯酰胺質(zhì)量比優(yōu)選為2:1 ；PBS溶液優(yōu)選為pH 7.4、濃度為0.02M的PBS溶液。
[0009]優(yōu)選的，所述二氧化硅脂質(zhì)體的制備方法為:先采用薄膜分散超聲法制備脂質(zhì)體，然后向脂質(zhì)體中加入經(jīng)乙醇溶液分散的正硅酸乙酯，攪拌下用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8?10.4，攪拌過夜，透析，得二氧化硅脂質(zhì)體。
[0010]更優(yōu)選的，所述正硅酸乙酯的加入量按磷脂:正硅酸乙酯:H20的摩爾比為1:8:344。
[0011]更優(yōu)選的，所述乙醇溶液的體積分數(shù)為5%?25%。
[0012]優(yōu)選的，所述薄膜分散超聲法制備脂質(zhì)體的方法是將磷脂和膽固醇溶于體積比為1:1的氯仿與甲醇的混合溶液中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，形成透明脂質(zhì)薄膜，加水水化，超聲，得脂質(zhì)體。
[0013]更優(yōu)選的，所述磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為7:3，在此比例下形成的脂質(zhì)體更利于后續(xù)修飾。
[0014]本發(fā)明中磷脂優(yōu)選為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂。
[0015]優(yōu)選的，所述超聲的條件為在800W條件下超聲50次，每次超聲10s，間隔1s后繼續(xù)超聲。
[0016]優(yōu)選的，所述水化的條件是在37°C條件下水化I小時。
[0017]更優(yōu)選的，所述蛋白分子為金黃色葡萄球菌蛋白A或基質(zhì)金屬蛋白MMPs。
[0018]2、由所述的制備方法制得的基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法，制備方法簡單，成本低，快捷，制得的蛋白分子印跡聚合物以脂質(zhì)體作為中心支撐物，利用脂質(zhì)體原有的載藥與遞藥優(yōu)勢，且粒徑易控制；由于在脂質(zhì)體的外周修飾了一層二氧化硅薄膜，能夠提高藥物的穩(wěn)定性，減少酸度、溫度及酶等不利因素的影響并具有藥物緩釋能力，此外在硅材料表面通過引入烯鍵，能使蛋白與單體材料共聚交聯(lián)于殼表面，使投入的單體材料量低，還能避免聚合后分散體易出現(xiàn)的凝膠化，而使未團聚的印跡顆粒更易收集，以更好的實現(xiàn)表面印跡，將印跡后的脂質(zhì)體用于載藥，能夠提高脂質(zhì)體的靶向性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0021]圖1為紅外光譜測定二氧化硅修飾的脂質(zhì)體(S-LIP)、烯鍵修飾后的二氧化硅脂質(zhì)體(MS-LIP)及金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)的結(jié)構(gòu)特征峰(a為SPA-MIPs, b 為 MS-LIP，c 為 S-LIP)。
[0022]圖2為金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)及非印跡聚合物(NIPs)動態(tài)吸附實驗結(jié)果圖。
[0023]圖3為金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)及非印跡聚合物(NIPs)等溫吸附實驗結(jié)果圖。
[0024]圖4為金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)的非特異性吸附實驗結(jié)果圖。
[0025]圖5為金黃色葡萄球菌對包載6-氨基熒光素的SPA印跡聚合物(FAM_SPA_MIPs)、包載6-氨基熒光素非印跡聚合物(FAM-NIPs)和6-氨基熒光素出-FAM)的攝取實驗結(jié)果圖。
[0026]圖6為金黃色葡萄球菌對包載6-氨基熒光素的SPA印跡聚合物(FAM_SPA_MIPs)、包載6-氨基熒光素非印跡聚合物(FAM-NIPs)和6-氨基熒光素出-FAM)對金黃色葡萄球菌的抑菌實驗結(jié)果圖。
[0027]圖7為基質(zhì)金屬蛋白酶印跡的靶向脂質(zhì)體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的動態(tài)吸附實驗結(jié)果圖。
[0028]圖8為基質(zhì)金屬蛋白酶印跡的靶向脂質(zhì)體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的等溫吸附實驗結(jié)果圖。
[0029]圖9為基質(zhì)金屬蛋白酶印跡的靶向脂質(zhì)體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的特異性吸附實驗結(jié)果圖。
[0030]圖10為U937細胞對包載阿霉素的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡聚合物(DOX-MMP-2-MIPs)與包載阿霉素的非印跡聚合物(DOX-NIPs)的攝取實驗熒光顯微鏡結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0031]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0032]實施例1、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)印跡的靶向脂質(zhì)體的制備及其評價
[0033]SPA印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟:
[0034](I)采用薄膜分散超聲法制備脂質(zhì)體，具體方法為:稱取大豆卵磷脂10.5mg，膽固醇4.5mg，用體積比為1:1的氯仿與甲醇混合溶液ImL溶解，然后在37°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，形成一層均勻的透明脂質(zhì)薄膜，加純水ImL于37°C水化lh，利用超聲細胞粉碎儀在800W超聲50次，每次超聲1s后間隔1s繼續(xù)超聲，得脂質(zhì)體(LIP)；
[0035](2)采用溶膠法制備表面修飾二氧化硅的脂質(zhì)體，具體方法為:按磷脂:正硅酸乙酯(TEOS):H20摩爾比為1:8:344 (mol/mol)向脂質(zhì)體中緩慢加入經(jīng)體積分數(shù)為10%乙醇分散的TE0S，然后在攪拌條件下用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8?10.4，室溫(18-25? )攪拌過夜，將混合物透析除去體系中未沉積的二氧化硅前驅(qū)體，得表面修飾二氧化硅的脂質(zhì)體，命名為二氧化硅脂質(zhì)體(S-LIP);
[0036](3)烯鍵修飾二氧化硅脂質(zhì)體，具體方法為:將50 μ L的3-巰基_1_丙烷磺酸鈉(MPS)緩慢滴加到250 μ L的乙醇中分散半小時后，然后取10 μ L分散液滴加到2ml 二氧化硅的脂質(zhì)體中室溫(18-25? )攪拌過夜，即得烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體(MS-LIP);
[0037]⑷SPA印跡的靶向脂質(zhì)體的制備，具體方法為:取丙烯酰胺(AAM) 4mg和N-N亞甲基雙丙烯酰胺(MAA) 2mg溶解到20ml pH為7.4、濃度為0.02M的PBS中，超聲溶解，得混合溶液A，然后將2mg SPA分散在ImL烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體溶液中并放置于室溫攪拌0.5h，再將混合物進行真空脫氣lOmin，得混合溶液B，在氮氣保護下取200 μ L混合溶液A滴加入混合溶液B中，并吹氮氣lOmin，室溫(18_25°C )攪拌下預(yù)聚合lh，氮氣保護下滴加7 UL過硫酸銨(APS，10%，ff/ff)和4.5 yL四甲基乙二胺(TEMED，5%，W/V)于混合物中引發(fā)聚合，然后再放置于室溫(18-25? )攪拌24h，用純水透析一周，除去模板分子及未反應(yīng)的試劑，凍干至恒重即金葡菌表面蛋白SPA印跡聚合物(簡稱為SPA-MIPs)。
[0038]本實施例中丙烯酰胺可以直接替換為N-異丙基丙烯酰胺，并且N-異丙基丙烯酰胺與N-N亞甲基雙丙烯酰胺的質(zhì)量比在I?5:1，并使混合溶液A中N-異丙基丙烯酰胺和N-N亞甲基雙丙烯酰胺的總濃度為I?5mg/ml ;分散TEOS時乙醇的體積分數(shù)為5%?25%;PBS溶液為pH6.8?7.4、濃度為0.02?0.1M范圍內(nèi)均能實現(xiàn)發(fā)明目的。
[0039]非印跡聚合物(NIPs)的合成除不加入模板蛋白分子外，其他制備方法同上。
[0040]對本發(fā)明所構(gòu)建的靶向制劑進行了初步表征:稱取制備好的S-LIP和SPA-MIPs在25°C下，采用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑大小及分布情況，并重復(fù)測定三次。結(jié)果顯示，S-LIP的平均粒徑為147.9 + 40.5nm，PI值為0.214±0.015，其分散性比較好，經(jīng)印跡聚合后SPA-MIPs的平均粒徑為200.5±60.5nm，PI值為0.22±0.018，表明SPA-MIPs制劑粒徑較小，分布均勻。另外，采用紅外光譜測定S-LIP、MS-LIP、SPA-MIPs的結(jié)構(gòu)特征峰，具體為:首先將S-LIP、MS-LIP、SPA-MIPs分別經(jīng)冷凍干燥處理，然后將KBr分別與S-LIP、MS-LIP、SPA-MIPs按質(zhì)量比為100:1置于瑪瑙研缽中混合均勻，最后碾壓，壓片后采用傅立葉紅外光譜儀進行測定，測定結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，S-LIP(圖1中c)在1087CHT1處出現(xiàn)了
S1-O-Si鍵的特征吸收峰；MS-LIP (圖1中b)在1712CHT1處的出現(xiàn)了是S1-C = C特征吸收峰，表明二氧化硅的表面成功地接枝了烯鍵。SPA-MIPs(圖1中a)經(jīng)印跡聚合后，1712CHT1處的吸收峰消失，表明印跡型脂質(zhì)體SPA-MIPs制備成功。
[0041]SPA印跡的靶向脂質(zhì)體的吸附實驗:為考察制備得到的SPA-MIPs對SPA的特異性吸附能力，采用以下方法對其進行驗證。
[0042]動態(tài)吸附實驗:先對SPA進行FITC熒光標記，具體是取4mg SPA溶于0.2M Na2PO4溶液中，另取0.16mg FITC溶于0.2M Na2PO4溶液中，使FITC與SPA的摩爾比為1.2:1，磁力攪拌下，將含SPA的溶液滴加入含F(xiàn)ITC的溶液中，避光反應(yīng)1.5h ;反應(yīng)結(jié)束后，在8000r/min條件下離心1min以除去沉淀SPA，取上清液用Sephadex G-50凝膠柱進行分離純化，凍干，即得 FITC-SPAo 然后將 5mg SPA-MIPs 和 NIPs 分別與 5ml 的 0.2mg/ml FITC-SPA 溶液于37°C振蕩孵育，分別于0.25h、0.5h、lh、2h和4h取出lmL，以4500r/min離心1min,?!定上清液的熒光強度，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，SPA-MIPs及NIPs對FITC-SPA的吸附隨著時間的增加而增加，在2h達到動態(tài)平衡。并且，動態(tài)吸附平衡時，SPA-MIPs對FITC-SPA的吸附量為NIPs的5倍左右，說明本發(fā)明構(gòu)建的分子印跡靶向聚合物載體對蛋白具有很好的重吸附能力。
[0043]等溫吸附實驗:精確稱取Img SPA-MIPs和NIPs分別置于離心管中，分別與Iml的0.05mg/ml、0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml 的 FITC-SPA 溶液在 37°C條件下振蕩孵育2h，孵育后以4500r/min離心lOmin，吸取上清液測定熒光強度，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，聚合物對模板分子的吸附比例與FITC-SPA濃度成正比，當FITC-SPA的濃度達到0.4mg/ml時，吸附比例達到平衡；與NIPs相比，SPA-MIPs對FITC-SPA有較高的吸附容量和較好的選擇性。
[0044]非特異吸附性實驗:選取基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、溶菌酶(LYZ)、牛血清白蛋白(BSA)、鏈霉親和素(SA)為競爭蛋白，按照上述方法進行FITC熒光標記，分別得FITC-MMP-2、FITC-LYZ、FITC-BSA、FITC-SA，然后稱取 Img SPA-MIPs 和 NIPs 分別置于離心管中，加入 Iml 的 0.2mg/ml 的 FITC-MMP-2、FITC-LYZ、FITC-BSA、FITC_SA 和 FITC-SPA 溶液于37°C置于振蕩器上振蕩吸附2h后，分別測定上清液中的熒光強度，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，SPA-MIPs只對SPA具有較高的吸附性能，而對其他四種競爭蛋白的吸附性能相對較低，與NIPs對SPA的吸附性能相當。這說明本發(fā)明所構(gòu)建的印跡聚合物SPA-MIPs對模板分子SPA具有較高的特異選擇性。
[0045]在SPA印跡的靶向脂質(zhì)體分子水平上的考察基礎(chǔ)上，還對其細菌水平上進行考察。由于印跡的SPA蛋白是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)，是細胞壁抗原的主要成分。因此，首先對本發(fā)明所構(gòu)建的分子印跡靶向系統(tǒng)進行包載6-氨基熒光素(6-FAM)，通過流式細胞來測定細菌對不同的幾種制劑的攝取來評價他們的靶向作用。包載6-氨基熒光素的印跡聚合物(FAM-SPA-MIPs)與非印跡聚合物(FAM-NIPs)的方法參照SPA印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的制備方法，區(qū)別在于制備脂質(zhì)體時，用Iml含有Img 6-FAM的PBS溶液代替水化液即可，其余步驟與SPA-MIPs和NIPs的制備方法相同。然后將FAM-SPA-MIPs、FAM-NIPs和6-FAM(三者的6-FAM濃度相同)用生理鹽水分別稀釋5倍，金黃色葡萄球菌菌液(lX108CFU/mL)稀釋100倍；再將FAM-SPA-MIPs, FAM-NIPs或6-FAM分別與金黃色葡萄球菌菌液按體積比為1:1混合，置于37°C恒溫水箱中，同時以相同濃度的細菌作為對照組，孵育6h后于7000r/min條件下離心1min,除去上清液，保留沉淀，向沉淀中加入滅菌的新鮮培養(yǎng)基5mL混勾，用流式細胞儀測熒光強度值，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌分別與FAM-SPA-MIPs、FAM-NIPs和6-FAM孵育6h后，攝取包載熒光素制劑的熒光強度不同，細菌結(jié)合FAM-SPA-MIPs的量顯著高于FAM-NIPs和6-FAM，熒光強度分別是FAM-NIPs和6-FAM的2.2倍和2.8倍。表明FAM-SPA-MIPs對金黃色葡萄球菌具有更強的體外結(jié)合能力。
[0046]其次，對本發(fā)明所構(gòu)建的分子印跡靶向系統(tǒng)進行紅霉素載藥，通過考察其對金黃色葡萄球菌的抑制作用來進一步驗證其靶向性。包載紅霉素的印跡聚合物(EM-SPA-MIPs)與非印跡聚合物(EM-NIPs)的制備方法參照SPA印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的制作方法，區(qū)別在于在制備脂質(zhì)體時，按紅霉素與脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1:15稱取紅霉素Img溶于200 μ I乙醇中，稱取大豆卵磷脂10.5mg、膽固醇4.5mg溶于氯仿:甲醇(I:1)的混合溶液800 μ I中，將三者均加入茄形瓶中，余下步驟與SPA印跡的靶向脂質(zhì)體(SPA-MIPs)和非印跡聚合物(NIPs)的制備方法一致。紅霉素的濃度測定采用高效液相色譜法(HPLC)，檢測條件如下:色譜柱:C18柱；柱溫:25°C ;檢測波長:21nm ;流動相:0.lmol/L磷酸二氫銨緩沖液(三乙胺調(diào)pH 6.5):乙腈體積比為70:30 ;流速:1.0mL/min ；進樣量50yL。檢測結(jié)果顯示，在紅霉素濃度為100?500 μ g 范圍內(nèi)紅霉素濃度(X)與HPLC色譜峰面積⑴間有良好的線性關(guān)系。標準曲線方程為:Y = 30054X+56254(R2 =0.9991)，低、中、高質(zhì)量濃度測定精密度RSD分別為3.46%、2.18%和1.52%，回收率分別為 96.54±2.05%,98.73±2.59%、100.26±3.02%。
[0047]最后，測定紅霉素脂質(zhì)體包封率:取紅霉素脂質(zhì)體均分為兩份，一份經(jīng)SephadexG-50凝膠柱純化收集，另一份直接稀釋到同樣體積，兩者均加入甲醇破乳，分別測定兩份樣品中的紅霉素濃度C和Q。計算包封率(EE):EE = C/QX10^。經(jīng)檢測，紅霉素脂質(zhì)體EM-LIP的包封率均值(η = 3)為91.25±1.48%，紅霉素印跡聚合物(EM-SPA-MIPs)的包封率均值(η = 3)為 86.25 ± 2.53 %。
[0048]在測定EM-SPA-MIPs對金黃色葡萄球菌的抑菌效果時，按照金黃色葡萄球菌攝取實驗中采用的孵育方法，先將EM-SPA-MIPs、EM-NIPs, EM(三者的EM濃度相同)用生理鹽水分別稀釋5倍，金黃色葡萄球菌菌液(IX 108CFU/mL)稀釋100倍；再將EM-SPA-MIPs、EM-NIPs, EM分別與金黃色葡萄球菌菌液按體積比為1:1混合，置于37°C恒溫水箱中，相同濃度的細菌作為對照組，孵育6h后在7000r/min條件下離心lOmin，除去上清液，保留沉淀，向沉淀中加入滅菌的新鮮培養(yǎng)基5mL混勻。將樣品混懸液于96孔板點樣，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于0h、lh、2h、4h、6h、8h測其OD值，實驗結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，EM-SPA-MIPs組和EM-NIPs組的OD值均低于非給藥組(Control組)的OD值，與NIL組相比，EM-SPA-MIPs組的OD明顯低于EM-NIPs組，說明EM-SPA-MIPs對細菌的抑制作用強于EM-NIPs，進一步說明本發(fā)明所構(gòu)建的分子印跡靶向制劑的靶向效果明顯。
[0049]實施例2、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體的制備及其評價
[0050]基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的革El向脂質(zhì)體的制備，具體步驟如下:
[0051](I)采用薄膜分散超聲法制備脂質(zhì)體，具體方法為:稱取大豆卵磷脂10.5mg，膽固醇4.5mg，用氯仿和甲醇體積比為1:1的溶液Iml溶解，然后在37°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，形成一層均勻的透明脂質(zhì)薄膜，加純水ImL于37°C水化lh，利用超聲細胞粉碎儀超聲5min(800W，50次，每次超聲1s后間隔1s)，得脂質(zhì)體(LIP)；
[0052](2)采用溶膠法制備表面修飾二氧化硅的脂質(zhì)體，具體方法為:按磷脂:正硅酸乙酯(TEOS):H20摩爾比為1:8:344向脂質(zhì)體中緩慢加入經(jīng)體積分數(shù)為10%乙醇分散的TE0S，然后在攪拌條件下用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.50，室溫(18_25°C )攪拌過夜，再將混合物透析除去體系中未沉積的二氧化硅前驅(qū)體，得表面修飾二氧化硅的脂質(zhì)體，命名為二氧化娃脂質(zhì)體(S-LIP)；
[0053](3)烯鍵修飾二氧化硅脂質(zhì)體，具體方法為:將50 μ L的3-巰基_1_丙烷磺酸鈉(MPS)緩慢滴加到250 μ L的乙醇中分散半小時后，然后取其10 μ L分散液滴加到2ml 二氧化硅的脂質(zhì)體中室溫(18-25? )攪拌過夜，即得烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體(MS-LIP);
[0054](4)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡聚合物的制備，具體方法為:取丙烯酰胺(AAM)4mg和N-N亞甲基雙丙烯酰胺(MAA) 2mg溶解到pH為7.4、濃度為0.02M的PBS中，超聲溶解，得混合溶液A，然后將2mg基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2分散在ImL烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體溶液中并放置于室溫攪拌0.5h，再將混合物進行真空脫氣lOmin，得混合溶液B，在氮氣保護下取200 μ L混合溶液A滴加入混合溶液B中，并吹氮氣lOmin，室溫(18_25°C )攪拌下預(yù)聚合lh，氮氣保護下滴加7 yL過硫酸銨(APS，10%，W/W)和4.5 yL四甲基乙二胺(TEMED，5%，W/V)于混合物中引發(fā)聚合，然后再放置于室溫攪拌24h，用純水透析一周，除去模板分子及未反應(yīng)的試劑，凍干至恒重即基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡聚合物命名為MMP-2-MIPs。用純水透析一周，除去模板分子及未反應(yīng)的試劑。凍干至恒重即得基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體(MMP-2-MIPs)。
[0055]非印跡聚合物(NIPs)的合成除不加入模板蛋白分子外，其他制備方法同上。
[0056]基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體的吸附實驗:為考察制備得到的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的特異性吸附能力，采用以下方法對其進行驗證。
[0057]首先，對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2進行了 FITC熒光標記:取4mg基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2溶于0.2M Na2PO4S液中，另取0.16mgFITC溶于0.2M Na孑04溶液中，使FITC與基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的摩爾比為1.2:1。磁力攪拌下，將含有基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的溶液加入含F(xiàn)ITC的溶液中，避光反應(yīng)1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，8000r/min條件下離心lOmin，以除去沉淀基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2。取上清液用Sephadex G_50凝膠柱進行分離純化，凍干，即得FITC標記的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2。
[0058]動態(tài)吸附實驗:將5mg MMP-2-MIPs 和 NIPs 分別與 5ml 的 0.2mg/ml FITC-MMP-2 溶液于37°C振蕩孵育，分別于0.25h、0.5h、lh、2h、4h取出1ml，以4500r/min離心lOmin，測定上清液的熒光強度，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，MMP-2-MIPs及NIPs對FITC-MMP-2的吸附隨著時間的增加而增加，在2h的時候即達到動態(tài)平衡。并且，動態(tài)吸附平衡時，MMP-2-MIPs對FITC-MMP-2的吸附量為NIPs的5倍左右，說明本發(fā)明構(gòu)建的分子印跡靶向聚合物載體對蛋白具有很好的吸附能力。
[0059]等溫吸附實驗:精確稱取Img MMP-2-MIPs和NIPs分別置于離心管中，分別與Iml的 0.05mg/ml、0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml 的 FITC-MMP-2 溶液在 37 °C 條件下振蕩孵育，2h后取出，以4500r/min離心lOmin，吸取上清液測定熒光強度，結(jié)果如如圖8所示。等溫吸附實驗表明，聚合物對模板分子的吸附隨著FITC-MMP-2濃度的變化而變化，當FITC-MMP-2的濃度低于0.2mg/ml時，吸附比例快速上升，當FITC-MMP-2的濃度達到0.2mg/ml時，吸附比例達到平衡，與NIPs相比，MMP-2-MIPs對FITC-MMP-2有較高的吸附容量和較好的選擇性。
[0060]特異吸附實驗:具體選取了金黃色葡萄球菌表面蛋白SPA、溶菌酶(LYZ)、牛血清白蛋白(BSA)，鏈霉親和素(SA)為競爭蛋白，競爭蛋白的FITC標記參照FITC-MMP-2的制備方法，分別得FITC-SPA、FITC-LYZ、FITC-BSA，F(xiàn)ITC-SA。特異性吸附試驗的具體操作為:稱取一系列的Img MMP-2-MIPs和NIPs分別置于離心管中，加入Iml的0.2mg/ml的FITC-SPA、FITC-LYZ、FITC-BSA、FITC-SA和FITC-MMP-2溶液于37°C置于振蕩器上振蕩吸附2h后，分別測定上清液中的熒光強度，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示，MMP-2-MIPs只對MMP-2具有較高的吸附性能，而對其他競爭蛋白的吸附性能相對較低，與NIPs對MMP-2的吸附性能差不多。這說明本發(fā)明所構(gòu)建的印跡聚合物MMP-2-MIPs對模板分子MMP-2具有較高的特異選擇性。
[0061]在此基礎(chǔ)上，對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體進行了細胞水平上的檢驗，由于MMP-2型基質(zhì)金屬蛋白酶酶是腫瘤細胞外部基質(zhì)金屬蛋白酶酶的一種，因此，通過驗證MMP-2印跡聚合物對腫瘤細胞的靶向性來評價其印跡能力。在這個實驗中，選用腫瘤細胞U937，熒光探針為阿霉素。
[0062]載阿霉素的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體(DOX-MMP-2-MIPs)與包載阿霉素的非印跡聚合物(DOX-NIPs)的制備方法同基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質(zhì)體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)，區(qū)別在于做脂質(zhì)體時，采用硫酸銨梯度法制備得到包阿霉素的脂質(zhì)體:稱取大豆卵磷脂10.5mg，膽固醇4.5mg，用氯仿和甲醇體積比為I:1的溶液Irnl溶解，然后在37°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，形成一層均勻的透明脂質(zhì)薄膜，加純水ImL于37°C水化lh，利用超聲細胞粉碎儀超聲5min(800W，50次，每次超聲1s后間隔10s)，得脂質(zhì)體(LIP);將所得LIP對水透析4h。用0.9%生理鹽水配制10mg/ml的阿霉素溶液，然后將透析過后的LIP與150 μ I的阿霉素溶液在60°C條件孵育20min，孵育完成后經(jīng)S印hadex G-50凝膠柱除去游離的阿霉素，即得包載阿霉素的脂質(zhì)體(DOX-LIP) ο
[0063]然后測定U937細胞對DOX-MMP-2-MIPs與DOX-NIPs的攝取實驗，來評價本發(fā)明所構(gòu)建的印跡的靶向脂質(zhì)體的靶向性。具體操作為:將1m的U937細胞培養(yǎng)過夜，分別與DOX-SPA-MIPs、DOX-NIPs ( 二者的DOX濃度相同)孵育2h，然后用PBS洗掉未被細胞攝取的藥液，然后用多聚甲醛固定30min，固定好后的細胞經(jīng)DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞的攝取結(jié)果，結(jié)果如圖10所示。結(jié)果顯示，與DOX-MMP-2-MIPs孵育的細胞核周圍可觀察到較強的紅色熒光，而與DOX-NIPs孵育的細胞觀察到的紅色熒光較弱，由此，可充分說明，DOX-MMP-2-MIPs對U937細胞有更好的體外結(jié)合能力。
[0064]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:取丙烯酰胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯酰胺按質(zhì)量比為I?5:1溶解至pH6.8?7.4、濃度為0.02?0.1M的PBS溶液或水中，超聲，得混合液A，所得混合液A中丙烯酰胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯酰胺的總濃度為I?5mg/ml ;再用烯鍵修飾二氧化硅脂質(zhì)體，然后將蛋白分子分散于烯鍵修飾的二氧化硅脂質(zhì)體溶液中攪拌，真空脫氣得混合液B ;氮氣保護下將混合液A按體積比為1:1?1:10滴加入混合液B中，吹氮氣，攪拌預(yù)聚合，然后氮氣保護下滴加過硫酸銨和四甲基乙二胺引發(fā)聚合，繼續(xù)攪拌，透析，得基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述二氧化硅脂質(zhì)體的制備方法為:先采用薄膜分散超聲法制備脂質(zhì)體，然后向脂質(zhì)體中加入經(jīng)乙醇溶液分散的正硅酸乙酯，攪拌下用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8?10.4，攪拌過夜，透析，得二氧化硅脂質(zhì)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述正硅酸乙酯的加入量按磷脂:正硅酸乙酯:H20的摩爾比為I:8:344o
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述乙醇溶液的體積分數(shù)為5%?25%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述薄膜分散超聲法制備脂質(zhì)體的方法是將磷脂和膽固醇溶于體積比為1:1的氯仿與甲醇的混合溶液中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，形成透明脂質(zhì)薄膜，加水水化，超聲，得脂質(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述磷脂和膽固醇的摩爾比為2?3:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述超聲的條件為在800W條件下超聲50次，每次超聲10s，間隔1s后繼續(xù)超聲。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述水化的條件是在37°C條件下水化I小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8任一項所述的制備方法，其特征在于:所述蛋白分子為金黃色葡萄球菌蛋白A或基質(zhì)金屬蛋白MMPs。
10.由權(quán)利要求1?9任一項所述的制備方法制得的基于蛋白分子印跡的靶向脂質(zhì)體。
【文檔編號】A61K47/42GK104492396SQ201410755690
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】李翀, 龍瑩瑩, 張焱, 陳章寶 申請人:西南大學(xué)