包括多核苷酸劑的細胞靶向納米顆粒及其應用的制作方法
【專利摘要】公開了一種產生顆粒的方法，所述顆粒用于輸送多核苷酸至靶細胞。所述方法包括(a)使多核苷酸與包括陽離子分子的組合物接觸，其中陽離子分子通過靜電相互作用凝聚多核苷酸，以產生復合體，其中陽離子分子不包括在脂質體中；和(b)使復合體在等于或小于約4.5的pH下共價結合至靶向部分，從而產生用于輸送多核苷酸劑至靶細胞的顆粒。也公開了所述顆粒和包含所述顆粒的組合物的應用。
【專利說明】包括多核苷酸劑的細胞靶向納米顆粒及其應用
[0001] 本申請是分案申請，原申請的申請日為2010年7月29日，申請?zhí)枮?201080037976. 6 (PCT/IL2010/000614)，發(fā)明名稱為"包括多核苷酸劑的細胞靶向納米顆粒 及其應用"。
[0002] 發(fā)明的領域和背景
[0003] 本發(fā)明，在其一些實施方式中，涉及包括多核苷酸劑的細胞靶向納米顆粒及其應 用。
[0004] 大部分癌是不一致的并包含相對抗化療/放療的細胞亞群。這些細胞不被治療消 除并可能是癌復發(fā)的根源。一種最主要的理論是，瘤由瘤中的稱為癌干細胞或瘤引發(fā)細胞 (T-IC)的這類稀少抗藥細胞引起，這類抗藥細胞具有與正常組織干細胞一樣的性質。這些 細胞可自我更新并可在體外和體內不確定地傳代并可分化為多種細胞系。重要地，在免疫 缺陷小鼠中，它們比瘤細胞的大部分惡性得多，形成具有許多較少數(shù)細胞的瘤，并通常瘤是 更具轉移性的。 ^
[0005] 所有T-IC的一個共同特征是高表達⑶44,稱為（⑶44s )。具有或沒有幾個其他 標記（諸如⑶133、⑶24ffi或OT24+、⑶166和EpCAM)的⑶44*出現(xiàn)在血液瘤和實體瘤，其中 有乳腺癌、胰腺癌、白血病、腦癌和黑素瘤。
[0006] 大部分癌干細胞相對抗藥并比瘤細胞的大部分惡性得多。所以有必要開發(fā)解決該 亞群的療法，以成功治療不同類型的癌干細胞。
[0007] 盡管只在最近RNA干擾（RNAi)才展示在哺乳動物中，但是利用RNAi用于人類療 法的前景發(fā)展迅速。使用siRNA治療黃斑變性和呼吸道合胞體病毒感染的I期和II期臨 床研究令人鼓舞。
[0008] 但是，許多這些有希望的療法通過局部注射siRNA進入異種移植瘤中實現(xiàn)。利用 RNAi用于癌療法的最大障礙是不僅在原發(fā)性瘤中而且在隱匿性轉移和播散性疾病中全身 性輸送siRNA至沉默基因表達。
[0009] 已經(jīng)開發(fā)了全身性靶向白細胞的顆粒。通過將SiRNA與由細胞靶向部分（對內 在化白細胞整合蛋白的抗體片段或細胞表面受體配體）和諸如魚精蛋白的RNA結合肽組 成的融合蛋白混合形成這種顆粒[Peer等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104,4095-4100(2007)]。siRNA 融合蛋白 納米顆粒的靜脈注射特別靶向并抑制肺部造血細胞瘤。另外，已經(jīng)顯示抗-整合蛋白抗 體修飾的脂基納米顆?？蛇x擇性地輸送siRNA至參與腸炎癥的白細胞[Peer等，Science 319, 627-630 (2008)]。通過改變修飾顆粒表面的抗體，該平臺可用于靶向不同的細胞表面 受體。但是，這是一個不能解決靶向癌干細胞能力的復雜策略。
[0010] 國際申請 W02009/020270 和 Jiang 等[Biopolyers, ν01· 89，Νο· 7, 2008]教導了一 種使用包括聚乙烯亞胺和透明質酸的組合物的核酸輸送系統(tǒng)。該組合物在高于4. 5的pH 下產生。產生的顆粒具有3. 6、13. 2和24. 9的ζ電位，大小為21nm。
[0011] Taetz 等[Oligonucleotides, Vol. 19, No. 2, Epub Apr 2009]教導了使在先附著 于透明質酸的脂質體與siRNA反應，產生脂復合物（lipoplex)，用于治療癌。脂復合物的大 小在100-200nm之間，ζ電位約-40mV。
[0012] Surace 等[Molecular Pharmaceutics, Vol. 6, No. 4, 1062-73 頁]教導了使用在先 附著于透明質酸的脂質體與質粒DNA-起形成脂復合物。該脂復合物顯示負的ζ電位并 且平均直徑在250-300nm之間。
[0013] Han Su-Eun 等[Journal of Drug Targeting, Vol. 17, No. 2, Feb 2009]教導了使 用包括聚乙烯亞胺和透明質酸的組合物的核酸輸送系統(tǒng)。該組合物在高于4. 5的pH下產 生。產生的顆粒的ξ電位在45-70mV之間并且直徑約為185nm。
[0014] Herringson等[Journal of Controlled Release, Vol. 139, No. 3, 229-238 頁]教 導了將siRNA封裝入中性隱性脂質體（stealth liposome)并結合⑶4配體。該脂質體平 均直徑為243nm并且ζ電位為-11. 5mV和-I. 5mV。
[0015] Chono 等，Journal of Controlled Release,第 131 卷，第 1，期，2008 年 10 月 6 日，64-69頁，教導了包括脂質體、魚精蛋白和透明質酸的納米顆粒制劑，用于全身性輸送 siRNA進入瘤。
[0016] 另外的【背景技術】包括美國專利號7, 544, 374和美國專利申請?zhí)?0090155178,其 教導了作為基因輸送材料的非均勻的脂化糖胺聚糖顆粒群。
【發(fā)明內容】
[0017] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了產生顆粒的方法，所述顆粒用于輸送多 核苷酸至靶細胞，所述方法包括：
[0018] (a)使多核苷酸與包括陽離子分子的組合物接觸，其中所述陽離子分子通過靜電 相互作用凝聚多核苷酸，以產生復合體，其中所述陽離子分子不包括在脂質體中；和
[0019] (b)使復合體在等于或小于約4. 5的pH下共價結合至靶向部分，從而產生用于輸 送多核苷酸劑至靶細胞的顆粒。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了根據(jù)本發(fā)明任何一種方法產生的顆粒。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了包括多個本發(fā)明顆粒的組合物。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了包括基本上均勻顆粒群的組合物，所述 顆粒包括SiRNA和陽離子分子的核心以及包括靶向部分的外殼，
[0023] 其中顆粒群的每個顆粒包括約_40mV的ζ電位并且其中顆粒群的每個顆粒當在 溶液中時直徑約為100_300nm。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了包括基本上均勻顆粒群的組合物，所述 顆粒包括miRNA和陽離子分子的核心以及包括靶向部分的外殼，
[0025] 其中顆粒群的每個顆粒當在溶液中時直徑約為30_50nm。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了下調靶細胞中感興趣基因的方法，該方 法包括使顆粒與靶細胞接觸，其中顆粒根據(jù)本發(fā)明的方法產生并且靶細胞表達CD44,從而 下調靶細胞中感興趣基因。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一方面提供了治療有需要的對象中癌的方法，該方法 包括給該對象施用治療有效量的顆粒，所述顆粒根據(jù)本發(fā)明的方法產生，從而治療癌。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，多核苷酸包括DNA。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，多核苷酸包括RNA。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，多核苷酸為單鏈的。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，多核苷酸為雙鏈的。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，多核苷酸包括RNA沉默劑。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，RNA沉默劑選自siRNA、miRNA、反義寡核苷酸和核糖 核酸酶。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，RNA沉默劑包括siRNA或miRNA。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，陽離子分子選自陽離子多肽、陽離子脂質、陽離子表 面活性劑和合成聚合物。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，陽離子脂質選自1，2_二月桂酰-sn-甘油基 (Glicero)-3-磷酸乙醇胺（DLPE)和1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇）（DLPG)，二油 酰-1,2-二?；?3-三甲基銨-丙烷（D0TAP，以 18:1、14:0、16:0、18:0)和 N-[l-(2, 3-二 油烯氧基）丙基]_N，N，N-三甲基氯化銨（DOTMA);二甲基雙十八基銨（DDAB) ;1，2-二月桂 酰-sn-丙三醇-3-乙基磷酸膽堿（乙基 PC，以 12:0、14:0、16:0、18:0、18 :1、16:0-18:1); 1，2-二-(92-十八碳烯酰）-3-二甲基銨-丙烷和鹽酸3 0-[^"'，^-二甲基氨基乙 烷）_氨基甲酰]膽固醇（DC-膽固醇）。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，組合物進一步包括中性脂質。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，中性脂質包括二油烯基磷脂酰乙醇胺（DOPE)。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，組合物進一步包括陰離子磷脂。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，陰離子磷脂選自磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰膽堿 和磷脂酰甘油。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，組合物進一步包括膽固醇。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，合成聚合物包括聚乙烯亞胺（PEI)或聚-L-賴氨酸。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，靶向部分包括多肽靶向部分。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，靶向部分選自抗體、抗體片段、適配體和受體配體。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，靶向部分包括糖胺聚糖。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，糖胺聚糖選自透明質酸（HA)、硫酸角質素、硫酸軟骨 素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、鹽，和其混合物。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，糖胺聚糖包括HA。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，方法進一步包括在步驟（b)之前活化糖胺聚糖。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，活化通過在酸性緩沖液中溫育糖胺聚糖實現(xiàn)。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，組合物包括氫化磷脂酰膽堿（HSPC)、膽固醇和二油 酰三甲基銨丙烷（DOTAP)。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，組合物包括α，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙 醇胺（DLPE)和1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇（DLPG)。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，靶向部分包括HA和多核苷酸劑包括siRNA或miRNA。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在步驟（b)之前不擠出復合體。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，當在硅表面上干燥時顆粒直徑是約100nm。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，當在硅表面上干燥時顆粒直徑是約30nm。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在溶液中顆粒直徑在約30_300nm之間。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒為圓形。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒包括約_40mV的ζ電位。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒是帶電的。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒是中性的。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒是納米顆粒。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，靶向部分包括ΗΑ。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒進一步包括至少一個另外的靶向部分，該另外 的靶向部分選自抗體、抗體片段、受體配體和適配體。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，顆粒包括大于約6, 000個的siRNA或miRNA分子。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，組合物是基本上均勻的。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，施用在體內實現(xiàn)。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，施用在體外實現(xiàn)。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，選擇RNA沉默劑以下調致癌基因的表達。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，選擇RNA沉默劑以下調與生存能力相關基因的表 達。
[0070] 除非另外定義，本文使用的所有技術術語和/或科技術語具有與本發(fā)明所涉及領 域技術人員通常理解相同的意思。盡管與本文描述的這些類似或相同的方法和材料可用于 實施或測試本發(fā)明的實施方式，但下面描述示例性的方法和/或材料。在抵觸的情況，以專 利說明書為準，包括定義。另外，材料、方法和實施例僅是說明性的且不意味必然是限制性 的。
[0071] 附圖簡述
[0072] 僅通過舉例，參照附圖和圖像，本文描述了本發(fā)明的一些實施方式。現(xiàn)具體詳細參 照附圖，強調一下，顯示的細節(jié)是通過舉例的方式并且是為了闡明性討論本發(fā)明實施方式 的目的。就此而言，結合附圖的描述使得本領域技術人員明白可以如何實施本發(fā)明的實施 方式。
[0073] 在附圖中：
[0074] 圖IA-B是圖解本發(fā)明實施方式顆粒的表面形貌的照片。圖IA :在乙酸鹽緩沖液 (AB)中由DOTAP與HA制造的顆粒的表面形貌。
[0075] 通過環(huán)境掃描電子顯微鏡（E-SEM)使H-mers形貌成像。當在硅表面干燥時顆粒 為離散的球形，并且大小是直徑約100nm。圖IB :由DOTAP與HA在DDW(雙蒸餾水）中制造 的顆粒具有不確定的結構并且沒有離散的形狀。存在纖維片圍繞的核心顆粒。
[0076] 圖2A-F是圖解在PANC-I (人胰腺癌）中用根據(jù)本發(fā)明實施方式在AB (圖2B、2D 和2F)或DDW (圖2A、2C和2E)中產生的顆粒轉染Cy3-siRNA的照片。
[0077] 圖3圖解使用本發(fā)明實施方式的顆粒選擇性敲落白血病干細胞中CyDl的條形圖。
[0078] 圖4是圖解使用經(jīng)本發(fā)明實施方式的顆粒輸送的抗致癌基因 SiRNA混合物根除癌 干細胞的條形圖。
[0079] 圖5是圖解本發(fā)明實施方式的攜帶SiRNA的顆粒不誘導干擾素反應的條形圖。
[0080] 圖6是根據(jù)本發(fā)明實施方式的攜帶miRNA的顆粒的圖像。
[0081] 圖7是圖解本發(fā)明實施方式顆粒的表面形貌的照片，其通過環(huán)境掃描電子顯微鏡 (E-SEM)成像。當在硅表面干燥時，顆粒為球形，并且大小為直徑約lOOnm。
[0082] 圖8A-C是圖解使用本發(fā)明的顆粒選擇性輸送siRNA至人白血病干細胞的照片。圖 8A-僅siRNA ;圖8B-〇ligofectamine?;圖8C-根據(jù)本發(fā)明實施方式的顆粒。
[0083] 圖9A-C是圖解根據(jù)本發(fā)明實施方式的顆粒能夠輸送siRNA至人AML初級細胞的 圖像。
[0084] 圖10是圖解經(jīng)根據(jù)本發(fā)明實施方式的顆粒輸送的細胞周期蛋白Dl-SiRNA(50nM) 在人初級AML細胞中誘導有效的基因沉默的條形圖。
[0085] 圖11是圖解流式細胞計量分析結果的圖表，該結果表明在人卵巢癌細胞系 (NCI-ADR/RES)中P-糖蛋白（Pgp)表達減少。
[0086] 本發(fā)明【具體實施方式】描述
[0087] 本發(fā)明，在其一些實施方式中，涉及包括多核苷酸劑的細胞靶向納米顆粒、其產生 方法及其應用。
[0088] 在詳細解釋本發(fā)明至少一種實施方式之前，應當理解本發(fā)明沒有必要限制它的應 用于下面的描述所闡述的或通過實施例例證的細節(jié)。本發(fā)明能夠有其他實施方式或能夠以 不同方式實施或進行。
[0089] 高度表達表面受體CD44的瘤引發(fā)細胞（T-IC)或癌干細胞，被認為是癌復發(fā)的主 要原因并且高度抗化療和放療。需要開發(fā)一種策略以輸送可選擇性靶向所有類型癌細胞 (包括癌干細胞）的藥物（其中有新類型抑制劑諸如siRNA或miRNA模擬物）。本發(fā)明人 已經(jīng)設計了一種策略，其通過產生納米顆粒（也稱為hyalumers或H-mers)，利用⑶44與它 的配體--乙酰透明質酸（HA)之間的相互作用，并且顯示它們可用于選擇性輸送siRNA進 入T-IC，誘導有效的基因沉默，其可導致根除這些細胞。
[0090] 納米顆?？捎扇魏侮栯x子分子組成，條件是它們能夠通過電荷-電荷相互作用凝 聚多核苷酸。
[0091] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在低于4. 5的pH下靶向部分（例如乙酰透明質酸；HA)與陽離 子分子交聯(lián)產生的納米顆粒比如果在更高PH下進行交聯(lián)更均勻并可攜帶更大量的多核苷 酸劑。產生顆粒的方法基本上在一個步驟中實現(xiàn)--即不需要進一步的能量以在添加多核 苷酸劑之后以及在與靶向部分交聯(lián)之前縮小顆粒的尺寸--例如不需要產生脂質體。
[0092] 因此，由本發(fā)明人產生的封裝多核苷酸劑的納米顆粒群顯示高度均勻（圖1A，6和 7)。本發(fā)明的顆粒也顯示選擇性輸送它們的多核苷酸負載至具有⑶44表面受體的細胞（圖 3和4)。本發(fā)明的顆粒被保護免于血清降解并因此在體內療法中有用。另外，本發(fā)明人已 經(jīng)顯示封裝多核苷酸劑的納米顆粒不誘導干擾素反應--用于全身性siRNA應用的安全和 有效輸送載體的先決條件（圖5)。
[0093] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面提供了產生用于輸送多核苷酸至靶細胞的納米顆粒 的方法，所述方法包括：
[0094] (a)使多核苷酸劑與包括陽離子分子的組合物接觸，其中所述陽離子分子通過靜 電相互作用凝聚多核苷酸劑，產生復合體，其中所述陽離子分子不包括在脂質體中；和
[0095] (b)使復合體在小于約4. 5的pH下共價結合至靶向部分，從而產生用于輸送多核 苷酸劑至祀細胞的納米顆粒。
[0096] 根據(jù)一種實施方式，實現(xiàn)共價結合的酸性pH為約4. 5、4、3. 5、3、2. 5或更低。
[0097] 如本文所使用，措辭"陽離子分子"指陽離子聚合物、陽離子脂質、陽離子表面活性 劑和陽離子多肽。根據(jù)本發(fā)明的該方面，陽離子分子不是脂質體的形式。
[0098] 示例性陽離子脂質包括但不限于1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (DLPE)和1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇（DLPG)、二油?；?1，2-二?；?3-三甲基 銨-丙烷（D0TAP，以 18:1 ;14:0 ;16:0，18:0)和 N-[l-(2,3-二油烯氧基）丙基]-N，N，N-三 甲基氯化銨（DOTMA);二甲基雙十八基銨（DDAB) ;1，2-二月桂酰-sn-丙三醇-3-乙基磷 酸膽堿（乙基 PC，以 12:0 ;14:0 ;16:0 ;18:0 ;18:1 ;16:0-18:1) ;1，2_ 二-(9Z-十八碳烯 酰）-3_二甲基銨-丙烷和鹽酸3 β-[N-(Ν'，Ν'-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰]膽固醇 (DC-膽固醇）。
[0099] 示例性陽離子聚合物包括但不限于聚乙烯亞胺（PEI)和聚-L-賴氨酸。
[0100] 用于產生本發(fā)明的顆粒納米的陽離子分子也可包括其他非陽離子成分，如本文下 面所描述。
[0101] 尤其感興趣的是結合膽固醇使用的陽離子脂質。這種化合物，尤其是二甲基雙 十八基溴化銨（DDAB)或D0HM，優(yōu)選地與膽固醇1:1使用，可與多核苷酸一起配制以產生具 有相對低的體內毒性的復合體。因此，已經(jīng)合適地與陽離子基團混合或衍生為陽離子基團 的膽固醇基團尤其非常適合實施本文描述的發(fā)明。
[0102] 適合的膽固醇脂質的陽離子成分可由在PH5至PH8之間保持正電荷的任何各種 化學基團組成，包括但不限于氨基團（或寡聚胺或聚胺，例如，精胺、亞精胺、五亞乙基己胺 (PEHA)、二亞乙基三胺、亞戊基己胺、五亞丙基己胺等）、酰胺基團、脒基團、帶正電荷的氨 基酸（例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸）、咪唑基、胍基、或其混合物和衍生物。另外，已證 實任何一個上述基團的陽離子聚合物（通過多糖或其他化學連接體聯(lián)接）在基因輸送中 是有用的并可并入本文描述的脂質復合體中。用于制備這種聚合物的交聯(lián)劑優(yōu)選地是生 物相容的或生物可容忍的，并且一般可包括至少兩個化學基團（即，交聯(lián)劑是雙官能的）， 其每個能夠與陽離子上的合適化學基團形成鍵。為了本公開的目的，術語生物相容的意思 應當是該化合物在考慮的劑量下不顯示明顯的毒性或不利的免疫作用，并且術語生物可 容忍的意思應當是與給定的化合物相關的不利生物后果可通過適當?shù)慕o藥方案或反療法 (counter-thrapy)控制。交聯(lián)劑基團可以是同雙官能的（相同的化學基團）或異雙官能的 (不同的化學基團）。任選地，為了便于從復合體中釋放載體，在交聯(lián)基團和陽離子部分之 間形成的化學聯(lián)接可優(yōu)選地在生理條件下是可水解的（即，PH不穩(wěn)定的，或以其他方式在 靶細胞中易于斷裂）。另外，交聯(lián)劑可包含在交聯(lián)基團之間在生理條件下可水解的鍵。
[0103] 任選地，交聯(lián)劑可與另外的允許形成分支聚合物的交聯(lián)劑結合。通過改變分支交 聯(lián)分子與聚合交聯(lián)劑的比率，產生具有各種化學性質的陽離子聚合物。
[0104] 適當?shù)臅r候，按照需要任何或多種（即，混合物）其他"助劑（helper) "脂質部分可 添加至本文描述的脂質或聚合物/多核苷酸輸送載體以向復合體提供期望的特性。因此， 可添加任何數(shù)量的熟知的磷脂類，其包括但不限于二硬脂酰磷脂酰-丙三醇（DSPG)、氫化 大豆、磷脂酰膽堿、磷脂酰丙三醇、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、鞘磷 月旨、單?；肌⒍；己腿；?、神經(jīng)酰胺、腦苷脂、磷脂酰甘油（HSPG)、 二油酰基-磷脂酰膽堿（DOPC)、二月桂酰磷脂酰-乙醇-胺（DLPE)、心磷脂和類似物。典型 地，助劑或其他中性脂質應占多核苷酸輸送復合體的脂質成分的約15%至約70%，優(yōu)選地 在約15%和約60%之間，更優(yōu)選地在約30%和60%之間，和更典型地至少約60%，尤其至 少約50%。相反地，陽離子脂質的百分數(shù)優(yōu)選地占復合體凈脂質成分的約30%至約70%， 更優(yōu)選地約40 %至約60 %，和尤其約50 %。
[0105] 包括陽離子分子的示例性組合物包括氫化磷脂酰膽堿（HSPC)、膽固醇和二油酰 基三甲基銨丙烷（D0TAP)。包括陽離子分子的另一種示例性組合物包括（1，2_二月桂 酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DLPE)和1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇（DLPG)。 [0106] 在裝配期間，陽離子分子通常以對于給定的應用已經(jīng)優(yōu)化的陽離子/磷酸鹽比率 與多核苷酸劑結合。通常，DNA磷酸鹽：陽離子比率在約1:8(. mu. g DNA:nmol陽離子脂質） 之間，對于靜脈施用，優(yōu)選地在約2:1和約1:16之間，對于i. p.(腹膜內）或氣霧劑應用約 1:1，等等。
[0107] 因為離子配對在陽離子/多核苷酸復合體的形成中起作用，在復合體形成期間可 改變PH以優(yōu)化或穩(wěn)定具體成分的相互作用。例如，使用非pH敏感陽離子脂質時，可優(yōu)選低 至約5的pH，以復合給定的多核苷酸（例如，RNA)或可與多核苷酸一起并入的其他化學劑。 另外，對堿水解基本上不敏感的多核苷酸（例如，DNA)，環(huán)境可決定在復合體形成期間使用 高至約10的pH。一般而言，在復合體形成和轉染期間保持pH在約5至約9的范圍內，優(yōu)選 地約7。
[0108] 類似地，可改變鹽（例如，似(：1、1((：1、1%(：12等）的濃度以優(yōu)化復合體形成，或增強 多核苷酸劑輸送和表達的效率。另外，可改變諸如陽離子脂質復合至多核苷酸劑時的溫度 等因素以優(yōu)化所得復合體的結構和功能性質。另外，可通過調整鹽或其他稀釋劑濃度改變 形成復合體的溶液的同滲濃度。
[0109] 因為中等濃度的鹽可妨礙復合體形成，也可通過添加或替換合適的賦形劑調整同 滲濃度，諸如，但不限于葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、麥芽糖、甘露糖和類似物。在復合 體形成期間可存在的糖（葡萄糖、蔗糖等）的數(shù)量一般應在約2%和約15%之間，優(yōu)選地約 3 %和約8 %之間，和更優(yōu)選地約5 %。
[0110] 可選地，通過鹽和糖或其他稀釋劑的混合物，也可調整溶液的同滲濃度，其他稀釋 劑包括葡聚糖40、白蛋白、血清、脂蛋白和類似物。本領域技術人員清楚地知道如何適當?shù)?改變鹽和糖的濃度以優(yōu)化基因輸送的效率?？勺鳛檫M一步優(yōu)化的起點的鹽和糖的典型濃度 是約250mM(葡萄糖）和約25mM鹽（NaCl)。復合體形成的另外特征是溫度調節(jié)。典型地， 陽離子脂質與多核苷酸在約4°C和約65°C之間，更典型地在約KTC和約42°C之間，優(yōu)選地 在約15°C和約37°C之間和更優(yōu)選地約室溫的溫度下進行復合。在許多情況下，在復合體形 成期間精確調節(jié)溫度（例如，+/_1°C )對于使產品變化最小化是重要的。
[0111] 措辭"凝聚多核苷酸"指減少多核苷酸所占的體積。本發(fā)明人已經(jīng)顯示根據(jù)本發(fā) 明的實施方式產生的單個納米顆粒可并入多達6000個siRNA或miRNA分子。
[0112] 根據(jù)一種實施方式，凝聚多核苷酸以便它占它初始體積的20%、它初始體積的 30 %、它初始體積的40 %、它初始體積的50 %、它初始體積的60 %、它初始體積的70 %、它 初始體積的80 %或它初始體積的90 %。
[0113] 復合體中的多核苷酸劑可包括DNA劑或RNA劑。多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。
[0114] 公開的方法可用于輸送編碼抗瘤劑的基因至患者。例如，免疫刺激劑；瘤抑制基 因；或阻礙瘤細胞生長、局部擴散、或轉移性蔓延的基因可被輸送至瘤細胞和其他靶細胞， 包括但不限于血管內皮細胞和免疫效應器和調節(jié)器細胞，其隨后表達基因至瘤破壞。這類 基因的具體例子包括但不限于：血管生成抑制劑、p53、GM-CSF、IL-2、G-CSF、BRCA1、BRCA2、 RAD51、內皮抑制素（O' Reilly 等，1997, Cell, 88(2) :277-285)、--ΜΡ 1、--ΜΡ-2、Bcl-2 和 ΒΑΧ。此外，可采用類似的方法產生與Dranoff等的美國專利號5, 637, 483--其通過引用 并入本文--公開的那些類似的癌疫苗。
[0115] 根據(jù)另一種實施方式，多核苷酸包括RNA沉默劑。在該上下文中，可理解，根據(jù)希 望在靶細胞中下調哪種感興趣的基因，選擇多核苷酸劑。
[0116] 根據(jù)一種實施方式，選擇RNA沉默劑以下調致癌基因的表達。根據(jù)另一種實施方 式，選擇RNA沉默劑以下調與生存能力相關基因的表達。
[0117] 如本文所使用，術語"RNA沉默"指由RNA分子介導的一組序列特異性調節(jié)機制（例 如RNA干擾（RNAi)、轉錄基因沉默（TGS)、轉錄后基因沉默（PTGS)、壓抑、共抑制和翻譯阻遏 作用），其導致相應的蛋白編碼基因表達的抑制或"沉默"。已經(jīng)在許多類型生物中發(fā)現(xiàn)了 RNA沉默，包括植物、動物和真菌。
[0118] 如本文所使用，術語"RNA沉默劑"指能夠抑制或"沉默"靶基因表達的RNA。在某 些實施方式中，RNA沉默劑通過轉錄后沉默機制能夠阻止mRNA分子的徹底處理（例如，完 整的翻譯和/或表達）。RNA沉默劑包括非編碼RNA分子，例如包括成對鏈的RNA雙鏈體， 以及可產生這種小的非編碼RNA的前體RNA。示例性RNA沉默劑包括諸如siRNA、miRNA和 shRNA的dsRNA。在一種實施方式中，RNA沉默劑能夠誘導RNA干擾。在另一種實施方式中， RNA沉默劑能夠介導翻譯阻遏作用。
[0119] RNA干擾指動物中由短干擾RNA(siRNA)介導的序列特異性轉錄后基因沉默的過 程。植物中相應的過程通常稱作轉錄后基因沉默或RNA沉默并且在真菌中也稱作壓抑。轉 錄后基因沉默的過程被認為是進化上保守的細胞防御機制，用于防止外源基因的表達并通 常被不同的植物群和門所共享。這種免于外源基因表達的保護可響應于雙鏈RNA(dsRNA) 的產生而發(fā)展，雙鏈RNA(dsRNA)源自病毒感染、或源自轉座子元件經(jīng)由特異性破壞同源單 鏈RNA或病毒基因組RNA的細胞反應隨機整合入宿主基因組。
[0120] 細胞中長dsRNA的存在刺激稱為切酶（dicer)的核糖核酸酶III的活性。切酶參 與將dsRNA處理為稱為短干擾RNA(siRNA)的dsRNA短片。源于切酶活性的短干擾RNA長 度典型地為約21至約23個核苷酸并且包含約19個堿基對的雙鏈體。RNAi反應的特點也 是通常稱為RNA-誘導沉默復合體（RISC)的核酸內切酶復合體，其介導具有與該siRNA雙 鏈體的反義鏈互補序列的單鏈RNA的切割。靶RNA的切割發(fā)生在與該siRNA雙鏈體的反義 鏈互補的區(qū)域的中間。
[0121] 因此，本發(fā)明考慮使用dsRNA下調從mRNA的蛋白表達。
[0122] 根據(jù)一種實施方式，dsRNA大于30bp。長dsRNA (即大于30bp的dsRNA)的使用 很受限制，這是由于認為這些更長區(qū)域的雙鏈RNA可導致誘導干擾素和PKR反應。但是，長 dsRNA的使用可提供許多優(yōu)勢：細胞可選擇最佳的沉默序列，減少測試大量siRNA的需要； 長dsRNA允許沉默庫比siRNA所需的具有更小的復雜度；并且，或許最重要地，當用作治療 時，長dsRNA可防止病毒突變。
[0123] 各種研究表明長dsRNA可用于沉默基因表達而不用誘導應激反應或 引起明顯的脫革巴作用-見例如[Strat等，Nucleic Research, 2006, Vol. 34， No. 133803 - 3810 ;Bhargava A 等，Brain Res. Protoc. 2004 ;13:115 - 125 ;Diallo M.等，01igonucletides.2003;13:381_ 392;Paddison P.J.等，Proc.Natl Acad.Sci. USA. 2002 ;99:1443 - 1448 ;Tran N.等，F(xiàn)EBS Lett. 2004 ;573:127 - 134]。
[0124] 尤其，本發(fā)明也考慮將用于基因沉默的長dsRNA(超過30堿基的轉錄體）引入干 擾素通路未激活的細胞（例如胚胎細胞和卵母細胞），見例如Billy等，PNAS 2001，Vol 98, 14428-14433 頁和 Diallo 等，Oligonucletides, 2003 年 10 月 1 日，13 (5) : 381-392。 doi:10.1089/154545703322617069。
[0125] 本發(fā)明也考慮引入特定設計以不誘導干擾素和PKR通路的長dsRNA，用于下調基 因表達。例如，Shinagwa 和 Ishii [Genes & Dev. 17 (11) : 1340-1345, 2003]已經(jīng)開發(fā)了一種 名為pDECAP的載體以從RNA聚合酶II (Pol II)啟動子表達長雙鏈RNA。因為來自pDECAP 的轉錄體缺少利于ds-RNA輸出至細胞質的5' -帽結構和3' -聚（A)尾部，來自pDECAP的 長ds-RNA不誘導干擾素反應。
[0126] 在哺乳動物系統(tǒng)中逃避（evade)干擾素和PKR通路的另一種方法是經(jīng)轉染或內源 性表達引入小的抑制性RNA(siRNA)。
[0127] 術語"siRNA"指誘導RNA干擾（RNAi)通路的小的抑制性RNA雙鏈體（一般在 18-30堿基對之間）。典型地，siRNA是化學合成的21mer (二i^一聚體），其具有中心19bp 雙鏈體區(qū)域和對稱的末端上2-堿基的3' -突出端，雖然最近已經(jīng)描述當與在相同位點的 21mer相比較時，化學合成的長度為25-30堿基的RNA雙鏈體的效價可具有多至100倍的增 力口。觀察到的使用更長RNA引發(fā)RNAi獲得的增加效價推測來自向切酶提供底物（27mer) 而不是產物（21mer)并且這提高了 siRNA雙鏈體進入RISC的比率或效率。
[0128] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3' -突出端的位置影響siRNA的效價并且在反義鏈上具有3' -突出端的 不對稱雙鏈體通常比在有義鏈上有3' -突出端的那些更有效（Rose等，2005)。這可歸因于 載入RISC中的不對稱鏈，因為當靶向反義轉錄體時觀察到相反的效果模式。
[0129] 雙鏈干擾RNA (例如，siRNA)的鏈可連接形成發(fā)夾或莖-環(huán)結構（例如，shRNA)。 因此，如所提到的，本發(fā)明的RNA沉默劑也可以是短發(fā)夾RNA(shRNA)。
[0130] 術語"shRNA"，如本文所使用，指具有莖-環(huán)結構的RNA劑，其包括互補序列的第 一和第二區(qū)域，區(qū)域的互補性程度和朝向足夠使在所述區(qū)域間發(fā)生堿基配對，第一和第二 區(qū)域通過環(huán)區(qū)域連接，所述環(huán)源自環(huán)區(qū)域內核苷酸（或核苷酸類似物）之間堿基配對的缺 失。環(huán)中核苷酸的數(shù)量是下列之間并包括它們的數(shù)字：3至23,或5至15,或7至13,或4 至9,或9至11。環(huán)中的一些核苷酸可參與和其他環(huán)中核苷酸的堿基配對作用。可用于形 成環(huán)的寡核苷酸序列的例子包括5'_UUCAAGAGA_3'（Brummelkamp，T. R.等（2002)Science 296:550)和 5'-UUUGUGUAG-3'（Castanotto，D.等（2002)RNA8:1454)。本領域技術人員可 認識到所得單鏈寡核苷酸形成包括能夠與RNAi系統(tǒng)（machinery)相互作用的雙鏈區(qū)域的 莖-環(huán)或發(fā)夾結構。
[0131] 根據(jù)另一種實施方式，RNA沉默劑可以是miRNA。將理解，術語"miRNA"也包括修 飾的miRNA和miRNA模擬物（antagomirs (抗mRNA寡核苷酸））。
[0132] miRNA是由編碼各種大小初級轉錄體的小RNA基因組成。在動物和植物中都鑒定 出了它們。初級轉錄體（稱作"pri-miRNA"）通過各種溶核步驟處理為更短的前體miRNA或 "pre-miRNA"。Pre-miRNA以折疊的形式存在，以便最后（成熟的）miRNA以雙鏈體存在，兩 條鏈被稱為miRNA (最終與靶堿基配對的鏈）。Pre-miRNA是一種切酶形式的底物，所述切酶 從前體除去miRNA雙鏈體，其后，與siRNA類似，雙鏈體可進入RISC復合體。已經(jīng)表明通過 前體形式而不是整個初級形式的表達，miRNA可被轉基因表達并且是有效的（Parizotto等 (2004)Genes &Development 18:2237-2242 和 Guo 等（2005)Plant Cell 17:1376-1386)。
[0133] 與siRNA不同，miRNA只結合至具有部分互補性的轉錄體序列（Zeng 等，2002, Molec. Cell 9:1327-1333)并抑制翻譯而不影響穩(wěn)定狀態(tài)的RNA水平（Lee 等，1993,Cell 75:843-854 ;Wightman 等，1993,Cell75:855-862)。miRNA 和 siRNA 二 者都被切酶處理并與RNA-誘導沉默復合體的成分相關（Hutvagner等，2001，Science 293:834-838 ;Grishok 等，2001，Cell 106:23-34 ;Ketting 等，2001，Genes Dev. 15:2654-2659 ;WiIIiams 等，2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6889-6894 ;Hammond 等，2001，Science 293:1146-1150 ;Mourlatos 等，2002, Genes Dev. 16:720-728)。一篇最 近的報導（Hutvagner等，2002, Sciencexpress297:2056_2060)假定，僅通過與祀轉錄體的 互補程度確定通過miRNA通路相比于siRNA通路的基因調節(jié)。據(jù)推測，與miRNA類似，與 mRNA靶僅具有部分同一性的siRNA可在翻譯抑制中起作用，而不是引發(fā)RNA降解。
[0134] 可如下實現(xiàn)適合用在本發(fā)明中的RNA沉默劑的合成。首先，從AUG起始密碼子往 下游掃描mRNA序列的AA雙核苷酸序列。每個AA的出現(xiàn)和靠近3'的19個核苷酸記錄為 可能的siRNA靶位點。優(yōu)選地，siRNA靶位點選自開放閱讀框，因為非翻譯區(qū)域（UTR)在調 節(jié)蛋白結合位點更豐富。UTR-結合蛋白和/或翻譯起始復合體可干擾siRNA核酸內切酶 復合體的結合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]?？墒?，應理解，指向非翻譯區(qū)域的siRNA 也可以是有效的，如GAPDH所表明的，其中指向5' UTR的siRNA介導約90%的細胞GAPDH mRNA 的減少并完全消除了蛋白水平（www. ambion. com/techlib/tn/91/912. html)。
[0135] 其次，使用任何序列比對軟件，諸如從NCBI服務器（www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/)獲得的BLAST軟件，將可能的靶位點與適當?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫（例如，人、小鼠、大鼠 等）比對。易齡展示與其他編碼序列明顯同源的推定靶位點。
[0136] 選擇合格的靶序列作為用于siRNA合成的模板。優(yōu)選的序列是包括低G/C含量的 那些，因為這些已經(jīng)被證實與G/C含量高于55%的那些相比介導基因沉默更有效。沿著靶 基因的長度優(yōu)選地選擇幾個靶位點用于評估。為了更好地評估所選擇的siRNA，優(yōu)選地結合 使用陰性對照。陰性對照siRNA優(yōu)選地包括與siRNA相同的核苷酸組成，但缺乏與基因組 的明顯同源性。因此，優(yōu)選地使用siRNA的合成核苷酸序列，條件是它不顯示與任何其他基 因明顯的同源性。
[0137] 可理解，本發(fā)明的RNA沉默劑沒必要限于只包含RNA的分子，而是進一步包括化學 修飾的核苷酸和非核苷酸。
[0138] 在一些實施方式中，本文提供的RNA沉默劑可以功能上與"細胞-滲透肽"相關。 如本文所使用，"細胞-滲透肽"是這樣一種肽，其包括短的（約12-30殘基）氨基酸序列 或功能模體（functional motif),其賦予不依賴能量（即，非胞吞）的轉運性質，該性質與 轉運膜可滲透復合體跨過細胞的質膜和/或核膜相關。本發(fā)明膜可滲透復合體中使用的細 胞-滲透肽優(yōu)選地包括至少一種非功能半胱氨酸殘基，其是游離的或衍生的，以與雙鏈核 糖核酸形成二硫連接，該雙鏈核糖核酸已經(jīng)為了這種連接進行了修飾。賦予這種性質的代 表性氨基酸模體列在美國專利號6, 348, 185中，其內容通過引用明確地并入本文。本發(fā)明 的細胞-滲透肽優(yōu)選地包括但不限于，穿膜肽（penetratin)、轉運肽（transportan)、plsl、 TAT(48-60)、pVEC、MTS 和 MAP。
[0139] 將使用RNA沉默劑靶向的mRNA包括但不限于其表達與不期望的表型特征相關的 那些?？杀话邢虻氖纠詍RNA是編碼截短的蛋白質即包含缺失的那些。因此，本發(fā)明的 RNA沉默劑可靶向在缺失任一側的橋連區(qū)域。將這種RNA沉默劑引入細胞會造成突變蛋白 下調而非突變蛋白不受影響。
[0140] 因此，可靶向與癌、風濕性關節(jié)炎和病毒有關的基因。癌相關的基因包括致癌基因 (例如，K_ras、c_myc、bcr/abl、c_myb、c-fms、c-fos 和 cerb-B)、生長因子基因（例如，編 碼表皮生長因子和其受體、成纖維細胞生長因子-結合蛋白的基因）、基質金屬蛋白酶基因 (例如，編碼MMP-9的基因）、粘附分子基因（例如，編碼VLA-6整合蛋白的基因）、瘤抑制基 因（例如，bcl-2和bcl-Xl)、血管發(fā)生基因和轉移性基因。風濕性關節(jié)炎相關的基因包括， 例如，編碼溶基質蛋白酶和腫瘤壞死因子的基因。病毒基因包括人乳頭瘤病毒基因（例如， 與宮頸癌有關）、乙肝和丙肝基因以及巨細胞病毒（CMV)基因（例如，與視網(wǎng)膜炎有關）。也 可以靶向與這些疾病或其他有關疾病的許多其他基因。
[0141] 必須實現(xiàn)可用于有效下調感興趣基因的反義分子的設計，同時考慮對于反義方法 重要的兩個方面。第一方面是輸送寡核苷酸進入適當細胞的細胞質，而第二方面是設計一 種寡核苷酸，其以抑制其翻譯的方式特異性與細胞內指定mRNA結合。
[0142] 現(xiàn)有技術教導了許多輸送策略，其可用于有效地輸送寡核苷酸進入寬范圍的細胞 類型[見，例如，Luft J Mol Med 76:75-6(1998) ;Kronenwett等Blood 91:852-62(1998); Rajur 等 Bioconjug Chem 8:935-40 (1997) ;Lavigne 等 Biochem Biophys Res Commun 237:566-71(1997) ;Aoki 等（1997)Biochem Biophys Res Commun 231:540-5(1997)和 Peer 等，Science 2008, 319 (5863) : 627-30]。
[0143] 另外，可獲得識別對它們的靶mRNA具有最高預測結合親和力的那些序列的算法， 其基于說明靶mRNA和寡核苷酸二者中結構變化熱力學的熱力學循環(huán)[見，例如，Walton等 Biotechnol Bioeng 65:1-9(1999)]。
[0144] 這種算法已經(jīng)成功地在細胞中用于執(zhí)行反義方法。例如，Walton等開發(fā)的算法使 得科學家能夠成功地為兔β_球蛋白（RBG)和小鼠腫瘤壞死因子-a (TNF α)轉錄體設計 反義寡核苷酸。該同一研究組最近已報道，在細胞培養(yǎng)中合理選擇的寡核苷酸抗三種模型 靶mRNA (人乳酸脫氫酶A和B以及大鼠 gpl30)的反義活性，如通過動力學PCR技術評價， 證實在幾乎所有情況下有效，包括用磷酸二酯和硫代膦酸酯寡核苷酸化學在兩種細胞類型 中抗三種不同靶的測試。
[0145] 另外，也公開了使用體外系統(tǒng)的設計和預測具體寡核苷酸效率的幾種方法 (Matveeva 等，Nature Biotechnology 16:1374 - 1375(1998)]。
[0146] 因為本文描述的陽離子脂質/多核苷酸或陽離子聚合物/多核苷酸復合體可配制 成具有特定大小范圍的穩(wěn)定泡狀體，靶向劑可附著（共價結合）于復合體，以引導復合體至 特定的細胞和/或組織。因此，靶向部分或靶向部分的組合可附著在復合體上。
[0147] 根據(jù)本發(fā)明的該方面，復合體形成或分離后，在酸性條件下，靶向部分共價結合至 復合體。這樣，就靶向劑也能夠識別細胞表面上的分子或被細胞表面上的分子識別而言，它 可起到橋分子的作用，有效地將復合體與細胞表面緊密接觸放置。
[0148] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在低于4. 5的pH下添加靶向部分（例如乙酰透明質酸；HA)至 陽離子分子產生的納米顆粒，比如果在更高的PH下進行交聯(lián)，其更加均勻并且可攜帶更大 量的多核苷酸劑。根據(jù)一種實施方式，實現(xiàn)共價結合的酸性PH為約4. 5、4、3. 5、3、2. 5或更 低。
[0149] 為了本公開的目的，術語"靶向部分"指可并入復合體的任何和所有的配體或配 體受體。這種配體可包括但不限于，諸如IgM、IgG、IgA、IgD和類似的抗體或其任何部分或 亞組，細胞因子，諸如整合蛋白、蛋白聚糖、唾液酸殘基等的細胞表面受體及其配體，MHC或 HLA標記，病毒包膜蛋白，肽或小有機配體，其衍生物，和類似物。
[0150] 對于靶向基因輸送應用尤其感興趣的是編碼各種細胞表面標記和受體的蛋白 質。作為這種蛋白質的示例的簡短列表包括但不限于：⑶I (a-C)、⑶4、⑶8-11 (a-C)、⑶15、 〇0界17、0)18、0)21-25、0)27、0)3〇-45〇?(0、4和8))、0)46-48、〇〇￥49〇3，(1，〇、〇〇￥50、0)51、 CD53-54、CDw60、CD61-64、CDw65、CD66-69、CDw70CD71、CD73-74、CDw75、CD76-77、LAMP-I和 LAMP-2,以及T-細胞受體、整合蛋白受體、用于增殖內皮的內皮因子、或它們的抗體。
[0151] 根據(jù)具體的實施方式，靶向部分是糖胺聚糖，包括但不限于透明質酸（HA)、硫酸角 質素、硫酸軟骨素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、鹽和其混合物。
[0152] 在糖胺聚糖的情況下，典型地這些分子在它們并入本發(fā)明的納米顆粒之前被活 化?；罨前肪厶堑氖纠苑椒ㄊ窃谒嵝跃彌_液中溫育它們，如在實施例1和2中所描述 的。
[0153] 如此，對于基因輸送，可靶向各種細胞的任一種，諸如內皮細胞、干細胞、癌干細 胞、生殖系細胞、上皮細胞、胰島、神經(jīng)元或神經(jīng)組織、間皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、造血細 胞、免疫細胞、主要腺體或器官（例如，肺、心、胃、胰腺、腎、皮膚等）的細胞、外分泌和/或 內分泌細胞和類似細胞。
[0154] 連接靶向部分之后，合適的配體或抗體，或其混合物，可附著在適合的固體載體即 乳膠珠、微載體珠、膜或過濾器和類似物上，并用于選擇性結合并入靶向受體或配體的納米 顆粒和將并入靶向受體或配體的納米顆粒與制劑的剩余部分分離。因此，提供了用于在使 用之前分離期望的多核苷酸復合體的方法。
[0155] 如本文所使用，術語"納米顆粒"指具有在各個原子和肉眼可見塊狀固體之間的 中等尺寸的顆?；蚨鄠€顆粒。一般而言，納米顆粒的特征尺寸（例如，大致球形納米顆粒 的直徑，或大致細長納米顆粒的長度）在亞微米范圍內，例如，從約Inm至約500nm，或從 約Inm至約200nm,或IOnm的數(shù)量級，例如，從約Inm至約100nm。其他示例性尺寸包括約 30nm - 250nm 或 50nm-300nm。
[0156] 測量顆粒大小的方法是本領域已知的并且在本文下面實施例部分進一步描述。
[0157] 納米顆?？梢詾槿魏涡螤?，除了更加規(guī)則的形狀，諸如大致球形、六方和立方納米 顆粒，還包括但不限于細長顆粒形狀，諸如納米絲，或不規(guī)則形狀。根據(jù)一種實施方式，納米 顆粒為大致球形。
[0158] 圓形顆粒典型地定量表征為稱為球形度的幾何量，其一般量化具體幾何形狀與完 美球形的偏差。
[0159] 理想地，通過將物體的體積除以圍繞該物體的球的體積，計算三維物體的球形度。 但是，對于一些物體，確定體積是困難的并且時常是不可能的。因此，由于實際的原因，使用 可選的球形度的"二維"定義。根據(jù)該選擇，球形度定義為物體投影在某一參考平面上的面 積和圍繞該投影的圓的面積的比率。例如，假設物體的圖像顯示在平面顯示器上，那么平面 顯示器可認為是參考平面而物體的圖像可被認為是物體在參考平面上的投影。
[0160] 因此，用A表示圖像的面積，和P表示圖像的周長，球形度s可定義為s = 4π A/ Ρ2。本領域技術與人員將理解，當圖像時完美圓形時，A = π(Ρ/2π)2=Ρ2/4π和s = l。 當圖像的面積是〇( S卩，圖像是直線或曲線）時s = 0。
[0161] 除非另外定義，"球形度"，如本文所使用，指二維球形度。
[0162] 應認識到，"二維"球形度非常近似等于"三維"球形度（體積比），條件是它經(jīng)過 許多顆粒（比如10或更多）或許多不同的參考平面進行計算并且平均。在這種情況下，從 "二維"球形度S開始，"三維"球形度可定義為S 2的立方根。
[0163] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，顆粒的球形度至少為80%，更優(yōu)選地至少為85%。
[0164] 本發(fā)明納米顆粒的ζ電位范圍可為-IOmV至-75mV和更優(yōu)選地從-25mV至-50mV。 因此，本發(fā)明的納米顆?？蓭ж撾?。
[0165] 根據(jù)本發(fā)明方法產生的顆?；旧鲜蔷鶆虻模此芯哂芯坏男螤詈痛笮?。根 據(jù)一種實施方式，納米顆粒群不包含與群中平均納米顆粒的大小相差超過5 %、10 %、20 % 或30 %的納米顆粒。
[0166] 本發(fā)明考慮的示例性均勻顆粒群如下：
[0167] 顆粒，其包括SiRNA和陽離子分子的核心和包含靶向部分（例如HA)的外殼，
[0168] 其中顆粒群的每個顆粒包括約_40mV的ζ電位并且其中顆粒群的每個顆粒當在 溶液中時直徑約為100_300nm。
[0169] 本發(fā)明考慮的另一種示例性均勻顆粒群如下：
[0170] 顆粒，其包括miRNA和陽離子分子的核心，和包含靶向部分（例如HA)的外殼，
[0171] 其中顆粒群的每個顆粒當在溶液中時直徑約為30_50nm。
[0172] 如所提到的，可改造本發(fā)明的顆粒以便它們靶向癌細胞和/或癌干細胞。
[0173] 因此，根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了治療有需要的對象中癌的方法，所述方法包括 給對象施用治療有效量的顆粒，所述顆粒是根據(jù)本文所描述的方法產生的，從而治療癌。
[0174] 如本文所使用，術語"癌"指源于致癌性轉化細胞增殖的疾病或病癥。
[0175] 根據(jù)本發(fā)明可治療的示例性癌包括但不限于胃腸道瘤（結腸癌、直腸癌、肛區(qū) 癌、結直腸癌、小和/或大腸癌、食道癌、胃癌（stomach cancer)、胰腺癌、胃癌（gastric cancer)、小腸癌、發(fā)生于小腸的腺癌、發(fā)生于小腸的良性瘤、發(fā)生于小腸的淋巴瘤、發(fā)生于 小腸的間充質瘤、胃腸間質瘤）、膽囊癌、膽道瘤、前列腺癌、腎（腎臟）癌（例如，Wilms 瘤）、肝癌（例如，肝母細胞瘤（hepatoblastoma)、肝細胞癌）、肝膽癌、膽道樹癌（biliary tree cancer)、膽囊瘤、膀胱癌、胚性橫紋肌肉瘤（embryonal rhabdomyosarcoma)、生殖細 胞瘤、滋養(yǎng)層瘤、睪丸生殖細胞瘤、卵巢不成熟畸胎瘤（teratoma)、子宮不成熟畸胎瘤、上 皮卵巢不成熟畸胎瘤、骶尾瘤、絨毛膜癌、胎盤部位滋養(yǎng)細胞瘤、上皮成人瘤（印ithelial adult tumor)、卵巢癌、宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、肺癌（例如，小細胞和非小細胞肺癌）、鼻 咽癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌（例如，頭頸中）、神經(jīng)性瘤、星形細胞癌、惡性神經(jīng)節(jié)癌、成神經(jīng) 細胞瘤、淋巴瘤（例如，霍奇金疾病、非霍奇金淋巴瘤、B細胞瘤、伯基特氏瘤、皮膚T細胞瘤、 組織細胞瘤、成淋巴細胞瘤、T細胞瘤、胸腺瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋 巴瘤）、神經(jīng)膠質瘤、甲狀腺髓樣癌、睪丸癌、腦和頭/頸癌、婦科癌、子宮內膜癌、生殖細胞 瘤、間充質瘤、神經(jīng)性瘤、膀胱癌、輸尿管癌、腎盂癌、尿道癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮體癌、子 宮內膜癌、子宮肉瘤、腹膜癌和輸卵管癌、卵巢生殖細胞瘤、性索間質瘤（sex cordstromal tumor)、內分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺瘤、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺淋巴瘤、副甲狀腺瘤、腎上腺瘤、胰 腺內分泌瘤、軟組織和骨肉瘤、良性和惡性間皮瘤、惡性腹膜間皮瘤、睪丸鞘膜惡性間皮瘤、 心包惡性間皮瘤、皮膚癌、皮膚黑素瘤、眼內黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、腦 膜瘤、外周神經(jīng)瘤、松果體區(qū)瘤、垂體腺瘤、顱咽管瘤、聽神經(jīng)瘤、頸靜脈球瘤、脊索瘤和軟骨 肉瘤、成血管瘤、脈絡叢乳頭狀瘤和癌、脊髓瘤、白血病和慢性白血病。
[0176] 術語"對象"指動物，典型地是包括人在內的哺乳動物。
[0177] 本發(fā)明的顆?？梢砸云浔旧硎┯弥翆ο?，或以它與合適的載體或賦形劑混合的藥 物組合物施用至對象。
[0178] 如本文所使用，"藥物組合物"指一種或多種本文所描述的活性成分與諸如生理學 上合適的載體和賦形劑的其他化學成分的制劑。藥物組合物的目的是便于化合物施用至生 物。
[0179] 本文術語"活性成分"指包括負責生物作用的多核苷酸劑的顆粒。
[0180] 下文，可交替使用的措辭"生理學上可接受的載體"和"藥學上可接受的載體"指 不對生物造成明顯刺激并不削弱所施用化合物的生物活性和性質的載體或稀釋劑。這些措 辭之下包含佐劑。
[0181] 本文術語"賦形劑"指添加至藥物組合物以進一步促進活性成分施用的惰性物質。 賦形劑例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、凝膠、 植物油和聚乙二醇。
[0182] 配制和施用藥物的技術可在"Remington，s Pharmaceutical Sciences, "Mack Publishing Co. ,Easton, PA,最新版中找到，其通過引用并入本文。
[0183] 合適的施用途徑可例如包括口，直腸，跨粘膜，尤其是經(jīng)鼻、腸內，或腸胃外輸送， 包括肌內、皮下和髓內注射以及鞘膜內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。
[0184] 可選地，可以以局部而不是全身性的方式施用藥物組合物，例如，通過注射藥物組 合物直接進入患者的組織區(qū)域。
[0185] 按照本發(fā)明使用的藥物組合物因此可以常規(guī)方式配制，使用一種或多種生理學上 可接受的載體，包括賦形劑和助劑，其利于將活性成分處理進入可藥學上使用的制劑中。合 適的劑型取決于選擇的施用途徑。
[0186] 對于注射，可將藥物組合物的活性成分配制在水溶液中，優(yōu)選地在生理相容的緩 沖液諸如漢克斯溶液、林格溶液或生理鹽緩沖液中。對于跨粘膜施用，在劑型中使用適合于 要被滲透的屏障的滲透劑。這種滲透劑通常在本領域是知曉的。
[0187] 對于口服施用，通過結合活性化合物和本領域熟知的藥學上可接受的載體可容易 地配制藥物組合物。這種載體使得藥物組合物能夠配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝 膠、糖漿、膏劑、懸液和類似物，用于被患者口服吸收。可使用固體賦形劑，任選地研磨所得 混合物，并加工顆粒的混合物--在如果需要添加合適的助劑之后，以獲得片劑或錠劑核 心，從而制備口服使用的藥物制劑。合適的賦形劑尤其是填料，諸如糖類，包括乳糖、蔗糖、 甘露醇或山梨糖醇；纖維素制劑，諸如，例如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、 明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理學上可接受的 聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。如果需要，可添加崩解劑，諸如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、 瓊脂，或海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。
[0188] 可口服使用的藥物組合物包括由明膠制成的推合式（push-fit)膠囊和由明膠和 增塑劑諸如丙三醇或山梨糖醇制成的密封膠囊。推合式膠囊可包含與填料諸如乳糖；粘合 劑諸如淀粉；潤滑劑諸如滑石或硬脂酸鎂和任選地穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活 性成分可被溶解或懸浮在合適的液體中，諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可 添加穩(wěn)定劑?？诜┯玫乃袆┬蛻斠赃m合所選擇施用途徑的劑量。
[0189] 對于口腔施用，組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。
[0190] 對于通過鼻吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分可方便地以氣霧劑噴霧呈遞的 形式從加壓裝置或噴霧器輸送，其中使用適合的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氟氯甲烷、 二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥以輸送計量的量，確定劑 量單位。在分散劑中使用的例如明膠的膠囊和藥筒（catridge)可配制為包含化合物和合 適的粉末基質諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0191] 本文描述的藥物組合物可配制為腸道外施用，例如，通過單次注射（彈丸注射， bolus injection)或連續(xù)灌輸。注射的劑型可以單位計量形式例如以安剖或以多計量容器 呈現(xiàn)，任選地，添加防腐劑。組合物可以是油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳劑，并可包 含配制劑（formulatory agent),諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
[0192] 可選地，活性成分可以以粉末形式用于在使用之前與適合的載體例如無菌、無致 熱原的水基溶液結合。
[0193] 本發(fā)明的藥物組合物也可使用例如常規(guī)栓劑基質諸如可可脂或其他甘油脂類配 制在直腸組合物諸如栓劑或保留灌腸中。
[0194] 適合本發(fā)明情況使用的藥物組合物包括其中包含有效量的活性成分以實現(xiàn)期望 目的的組合物。更具體而言，治療有效量意思是活性成分（顆粒組合物）有效預防、緩解或 改善病癥（例如癌）的癥狀，或延長被治療對象生存的量。
[0195] 治療有效量的確定在本領域技術人員的能力范圍內，尤其是按照本文提供的詳細 公開。
[0196] 對于本發(fā)明方法中使用的任何制劑，治療有效量或劑量可從體外和細胞培養(yǎng)實驗 初步評估。例如，劑量可在動物模型中配制以實現(xiàn)期望的濃度或滴度。這種信息可用于更 精確地確定在人中有用的劑量。
[0197] 本文描述的活性成分的毒性和治療有效性可通過標準的藥學方法在體外、細胞培 養(yǎng)或實驗動物中測定。從這些體外和細胞培養(yǎng)試驗和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配制 在人中使用的劑量范圍。劑量可根據(jù)采用的劑量形式和使用的施用途徑而變化。根據(jù)患 者的情況，各個醫(yī)師可選擇精確的制劑、施用途徑和劑量。（見例如，F(xiàn)ingl等，1975, "The Pharcetuical Basis of Therapeutics"，Ch. I ρ· I) 〇
[0198] 可單獨調整劑量和間隔以提供活性成分的血漿或腦水平足夠誘導或抑制生物效 應（最低有效濃度，MEC)。MEC對每個制劑不同，但可從體外數(shù)據(jù)評估。獲得MEC所需的劑 量取決于個體性質和施用途徑。檢測試驗可用于確定血漿濃度。
[0199] 取決于被治療病情的嚴重性和響應性，可單次或多次施用劑量，療程從幾天持續(xù) 到幾周或直到實現(xiàn)痊愈或取得疾病減輕。
[0200] 當然，被施用的組合物的數(shù)量取決于被治療的對象、痛苦的嚴重性、施用的方式、 開處方醫(yī)生的判斷等。
[0201] 如果需要，本發(fā)明的組合物可以以包裝或分注器設備諸如FDA批準的試劑盒提 供，其可包含一種或多種包含活性成分的單位劑量形式。例如，包裝可包含金屬或塑料箔， 諸如泡罩劑。包裝或分注器設備可附帶有施用說明。包裝或分注器也可提供有與容器有關 的、以管理藥物的制造、使用或銷售的政府部門規(guī)定的形式的告示，該告示反映了政府部門 批準了該組合物形式或人或獸施用。例如，這種告示可以具有美國食品和藥品管理局為處 方藥批準的標簽或具有所批準產品的插頁。包括在相容藥學載體中配制的本發(fā)明制劑的組 合物也可制備、放置在合適的容器中并標出用于治療所指出的病癥，如上面進一步詳述的。
[0202] 如本文所使用，術語"方法"指完成給定任務的方式、手段、技術和程序，包括但不 限于化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領域從業(yè)人員已知的或從已知的方式、手段、技 術和程序容易發(fā)展的那些方式、手段、技術和程序。
[0203] 如本文所使用，術語"治療"包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉病癥的進程，基本 上改善病癥的臨床或美學癥狀或基本上預防病癥的臨床或美學癥狀的出現(xiàn)。
[0204] 如本文所使用，術語"約"指± 5 %。
[0205] 貫穿該申請，本發(fā)明的各種實施方式可以以范圍的形式呈現(xiàn)。應當理解，以范圍形 式的描述僅僅是為了方便和簡短，不應解釋為對本發(fā)明范圍的固定限制。因此，范圍的描述 應當被認為已具體公開了所有可能的子范圍以及在該范圍內的單個數(shù)值。舉例而言，諸如 從1至6范圍的描述應當被認為已具體公開了子范圍，諸如從1至3、從1至4、從1至5、從 2至4、從2至6、從3至6等，以及在該范圍內的單個數(shù)值，例如1、2、3、4、5和6。不管范圍 的寬度如何，這都適用。
[0206] 無論本文什么時候指出一個數(shù)值范圍，它意思是包括在所指出范圍內的任何所引 述的值（分數(shù)或整數(shù)）。措辭"范圍為/范圍在"第一指示數(shù)值和第二指示數(shù)值之間和"范 圍從/范圍由"第一指示數(shù)值"至"第二指示數(shù)值在本文中交換使用并且意思是包括第一和 第二所指示的數(shù)值和它們之間所有的分數(shù)值和整數(shù)值。應理解，在各單獨實施方式的情形 中為了清楚描述的本發(fā)明某些特征也可結合地提供在單個實施方式中。相反地，在單個實 施方式的情形中為了簡潔描述的本發(fā)明各特征也可分開或以任何合適的子組合或若合適 提供在本發(fā)明描述的任何其他實施方式中。在各種實施方式的情形中描述的某些特征將不 被認為是那些實施方式的必要特征，除非沒有那些要素實施方式不起作用。
[0207] 本發(fā)明的各種實施方式和方面，如上文中所描述和如在下面權利要求部分所要求 保護的，可在下面的實施例中找到實驗支持。 實施例
[0208] 現(xiàn)參照下面的實施例，其與上面的描述一起以非限制性方式闡明本發(fā)明的一些實 施方式。
[0209] -般而言，本文使用的命名法則和在本發(fā)明中使用的實驗室方法包括分子 學、生物化學、微生物學和重組DNA技術。這些技術完整地描述在文獻中。見，例如， ''Molecular Cloning:A laboratory Manual〃Sambrook 等，（1989) /'Current Protocols in Molecular Biology^Volumes I-III Ausubel，R. M.，ed. (1994) ;Ausubel 等，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland(1989)； Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley & Sons,New York(1988) ;Watson 等，"Recombinant DNA〃，Scientific American Books, New York ； Birren 等（eds) "Genome Analysis:A Laboratory Manual Series"，Vols. 1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998);美國專利 4, 666, 828 ;4, 683, 202; 4, 801，531 ;5, 192, 659 和 5, 272, 057 中所述的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook"，I-III 卷，Cellis，J. Ε·，ed. (1994) ；Freshney 的"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"，Wiley-Liss，N. Y. (1994)，第三片反；〃Current Protocols in Immunology〃I-III 卷，Coligan J. E.，ed. (1994) ;Stites 等（eds)，''Basic 和 Clinical Immunology"(第八版），Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994); Mishell 和 Shiigi (eds)，"Selected Methods in Cells Immunology^,W. H. Freeman 和Co.，New York(1980);在專利和科技文獻中廣泛描述了可用的免疫試驗，見，例如， 美國專利 3, 791，932 ;3, 839, 153 ;3, 850, 752 ;3, 850, 578 ;3, 853, 987 ;3, 867, 517 ; 3, 879, 262 ;3, 901，654 ;3, 935, 074 ;3, 984, 533 ;3, 996, 345 ;4, 034, 074 ;4, 098, 876 ; 4,879,219;5,011，771 和5,281，521;"0118〇以1。16〇討(16 37扣1^818飛&^，]?.<1.，6(1· (1984) ;"Nucleic Acid Hybridization"Hames，B.D.和 Higgins S.J·，eds. (1985); ^Transcription 矛口 Translation〃Hames，B. D.矛口 Higgins S. J. , eds. (1984) ;〃Animal Cells Culture^Freshneyj R. I. , ed. (1986) ,Immobilized Cells and Enzymes^IRL Press， （1986) ;"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal，B·， （1984)和 "Methods in Enzymology^Vol. 1-317,Academic Press ;"PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications^, Academic Press, San Diego,CA (1990) ；Marshak 等，"Strategies for Proteins Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual〃CSHL Press (1996);其所有通過引用并入，如同本文充分闡述。其他一般參 考文獻遍及本文件提供。其中的方法被認為是本領域所熟知的并且為了讀者方便而提供。 其中包含的所有信息通過引用并入本文。
[0210] 實施例1
[0211] DOTAP 基顆粒
[0212] 材料和方法
[0213] 脂質（D0TAP 和膽固醇）購買自 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster，AL, USA); HSPC購買自LIP0ID，德國Oligofectamine?(來自Invitrogen);人重組魚精蛋白（來自 Abnova);線性聚乙烯亞胺（PEI)購買自Sigma。乙酰透明質酸，Mw 751KDa，特征粘度：16dL/ g(Genzyme cooperation，Cambridge，Μ) ;FITC_HA得自 Calbiochem(德國）? Cy3_siRNA得 自Qiagen;非標記（靶特異性抗細胞周期蛋白D1、RAS、HMGA2或MYC或零亂的（scannled)) siRNA得自Dhannacon。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC);硼酸和硼砂（四 硼酸鈉· IOH2O)購買自 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis，M0, USA)。3H-HA 購買自 American Radiolabled Chemicals Inc. (St.Louis，M0, USA)。細胞培養(yǎng)板來自 Corning Inc. (Corning，NY)。細胞培養(yǎng)用材料得自 Biological Industries Co. (Beit Haemek)。透析管 (12, 000-14, 000 的截留分子量）購買自 Spectrum Medical Industries (Los Angeles，CA) 〇 聚碳酸酯膜購買自Nucleopore (Pleasanton, CA)。所有其他試劑是分析級的。
[0214] 制備siRNA和miRNA模擬物（抗mRNA寡核苷酸）：
[0215] Cy3_siRNA 零亂序列（scrambled sequence)來自 Qiagen。細胞周期蛋白 Dl siRNA和陰性對照siRNA (零亂序列）購買自Dharmacon并且之前已報道[Peer 等，Science 319,627-630(2008)]。RAS、HMGA2 或 MYC siRNA 在之前被公開[Yu 等，Cell 131，1109-1123(2007)]并且購買自 Dharmacon。
[0216] 制備封裝siRNA的H-mers (透明質酸涂布的納米顆粒）-方法1
[0217] 制備DOTAP基顆粒：通過常規(guī)脂質膜方法[Peer, D.，等Biochim Biophys Acta 1612,76-82(2003) ；Peer, D. & Margalit, R. Archives of biochemistry and biophysics 383, 185-190(2000)]，以45:33:22的摩爾比在5mg/mL脂質濃度下制備氫化磷脂酰膽堿 (HSPC)、膽固醇和二油?；谆@丙烷（DOTAP)。簡單而言，60°C下將脂質溶解在乙醇中 20分鐘，接著在旋轉蒸發(fā)器（Buchi, Swizerland)中在減壓下蒸發(fā)至干燥。接著將薄的脂質 膜在7. 4的pH下用僅由緩沖液（PBS)組成的膨脹液（swelling solution)水合。然后，使 用旋風設備強力攪拌并在37°C下的振蕩浴中溫育2小時。通過在60°C和200psi至500psi 的氮壓下操作Lipex擠出設備，擠出MLV，獲得單層小脂泡（SUV)。使用孔大小逐漸變小的 膜，分階段進行擠出，每個孔大小循環(huán)數(shù)次，直至直徑最終大小為30nm。在1:1000稀釋的原 料中（即5g/mL)，大小分布為直徑25±4nm，ζ電位為+72. 3±6. lmV。
[0218] 制備oligofectamine?、PEI?和魚精蛋白復合體：根據(jù)制造商的推薦進行制備 oligofectamine或PEI復合體。簡而言之，將60皮摩爾的siRNA稀釋在50μ 1的沒有血 清的〇pti_MEM?血清減少的培養(yǎng)基中并輕輕混合。稀釋支化PEI或oligofectamine (3 μ 1 在12 μ 1的Opti-iffiM I培養(yǎng)基中）。輕輕混合并在室溫下溫育5分鐘。稀釋的siRNA與稀 釋的Oligofectamine?(總體積68 μ 1)結合，輕輕混合并在室溫下溫育20分鐘，使得形成 siRNA:oligofectamine復合體。對于魚精蛋白（人重組體），使用相同的方案,但是魚精蛋 白與siRAN的比率為5:1摩爾比。（將魚精蛋白管加到siRNA管中以產生復合體）。
[0219] 制備乙酸鹽活性透明質酸（HA):在玻璃瓶中稱量8mg的活性HA并溶解在8ml 0. IM pH4. 0的乙酸鹽緩沖液（lmg/ml)中。在37°C下攪拌混合物幾分鐘，直到HA完全溶解。 加入過量的40mg EDC(5mg EDC/mg HA)。在37°C下攪拌溶液2小時。
[0220] 制備脂質-siRNA懸浮液：將3 μ 1的顆粒（5 μ g/mL)添加至12 μ 1的DMEM中。輕 輕混合懸浮液并在室溫（RT)下溫育5分鐘。將3 μ 1的SiRNA(K)O μ Μ，300皮摩爾）添加 至5〇μ丨的DMEM。輕輕混合該溶液并在RT下溫育5分鐘。將顆粒溶液添加至siRNA溶液并 在輕輕攪動下、在RT下溫育20分鐘。
[0221] 組裝Hyaluromers (24孔板的每孔）：將13. 6 μ 1活性HA (1:5 ν/ν的比率（HA:復 合體））添加至68 μ 1的脂質-SiRN復合體并在輕輕攪動下在37°C下溫育2小時。將丨8.3μΙ 的DMEM添加至終體積100 μ 1 (每孔）。pH校正至ρΗ7. 0-7. 4。
[0222] 使用5mg/ml顆粒和多達0. 3微摩爾，將系統(tǒng)擴大1000倍。
[0223] 制備封裝siRNA的H-mers (透明質酸涂布的納米顆粒）-方法2
[0224] 制備DOTAP基顆粒：如本文上面所描述。
[0225] 制備DDW活性HA :在玻璃瓶中稱量8mg的HA并溶解在8ml的DDW中（lmg/ml)。 其在37°C下攪拌數(shù)分鐘直到HA完全溶解。添加過量的40mgEDC(5mg EDC/mg HA)。該溶液 在37°C下攪拌2小時。
[0226] 制備脂質-siRNA懸浮液：如本文上面所描述。
[0227] 組裝Hyaluromers (24孔板的每孔）：如本文上面所描述。
[0228] 不能將該系統(tǒng)擴大大于10倍，即顆粒濃度50 μ g/mL和siRNA僅僅3納摩爾。
[0229] 顆粒表面形貌：通過以輕敲模式操作的Digital Instruments (USA)的NanoScope IIIa MultiMode AFM進行顆粒表面形貌測量。在AFM測量之前短時間內，將H-mers樣品 以1:10稀釋并且將小滴（?50 μ 1)放置在二氧化硅上。幾分鐘后，將樣品在細束氮中干 燥并取出用于拍攝（screen)。H-mers的測量在室溫和大氣壓下使用非接觸方法和三角形 硅尖（R〈20nm)以IHz的掃描速率進行。尖和和樣品之間的空隙為10-100A。在樣品區(qū)域 上的兩段掃描512條線，以形成二維范圍。
[0230] 也進行E-SEM (環(huán)境掃描電子顯微鏡）。
[0231] 顆粒流體動力直徑和ζ電位測量：在Malvern Zetasizer nano ZS ζ電位和動 態(tài)光散射儀（Malvern Instruments Ltd. ,Southborough, MA)上，使用自動算法模式測量 H-mers直徑并用PCS I. 32a分析。所有的測量在0. OlM NaCl、pH6. 7、室溫下進行。
[0232] 封裝效率：定義為攜帶的siRNA與系統(tǒng)中總siRNA的比率，封裝效率可通過離心 測定。全部H-mers制劑的樣品（S卩，包含封裝的和未封裝的siRNA二者）在小型超級離心 機（Sorval, Discovery 150M)中離心。除去包含未封裝siRNA的上清液，將包含封裝siRNA 顆粒的小球再懸浮在不含siRNA的緩沖液中。通過ribogreen試驗（invitrogen)測定上 清液和小球以及在全部制劑中的siRNA，通過其可計算封裝效率和物質守恒，如之前所描述 [Peer 等，Science 319, 627-630 (2008)]。
[0233] 體外研究用細胞系：乳腺T-IC(BT-IC)可作為非粘連球體在無血清培養(yǎng)基中（"乳 腺球細胞（mammosphere)"）被重復傳代，缺乏分化標記（細胞角蛋白、平滑肌肌動蛋白和粘 蛋白-1)的表達并且是CD44+CD24-。但是，這些標記不能從早期的祖先細胞（EPC)中區(qū)分 BT-IC。BT-IC對化療的相對抗性的原因可能是多種因素的，但仍然很大程度上未確定。一 種機制是增加的藥物流出物（如通過流式細胞計量術測量為藥物流出側群SP)。BT-IC和 EPC增強了 ABCG2多藥物運載蛋白的表達并且黑素瘤干細胞過度表達另一種多藥物運載蛋 白 ABCB5。
[0234] 在表柔比星選擇壓力下通過體內SKBR3細胞傳代產生高度富含BT-IC的人乳腺 癌細胞系（SK_3rd)。這些細胞穩(wěn)定地保持干細胞性質（自我更新、多效價），并可在形成 球體條件下在體外無限擴張以提供無限數(shù)量的細胞用于進一步研究。在N0D/SCID小鼠中 SK-3rd細胞形成瘤，其比SKBR3使用少100倍的細胞，并且不像SKBR3,瘤是轉移性的。而 且，這些細胞對化療是相對抗性的。
[0235] HL60人急性骨髓白血?。ˋML)細胞也用作白血病干細胞的模型。
[0236] 流式細胞計量研究：當使用熒光標記的siRNA時，使用BD FAC掃描系統(tǒng)量化Cy3+ 細胞的數(shù)量。
[0237] 圖像獲取和處理：使用Biorad Radiance 2000激光掃描共焦系統(tǒng)（Hercules，CA) 進行共焦圖像，所述系統(tǒng)并入了配備Olympus IOOX LUMPlanFL 1.0蘸水（water-dipping) 物鏡的Olympus BX50BWI顯微鏡。使用Laserscan 2000軟件進行圖像獲取并用Openlab 3. 1. 5 軟件（Improvision, Lexington, MA)處理圖像。
[0238] 干擾素實驗：對HL60細胞（I X IO6個細胞/ml)模擬處理或用攜帶1，000皮摩爾 對照（陰性）-siRNA或5 μ g/ml聚（I: C)的H-mers處理48小時。通過定量RT-PCT檢測 IFN或干擾素反應基因的表達。
[0239] siRNA的體外轉染：已經(jīng)在37°C、5% CO2下在24孔微量滴定板（200 μ 1培養(yǎng)基/ 孔中2. 5Χ IO5個細胞）中過夜預培養(yǎng)的細胞（SKBR3、SK-3 "*或HL-60)，被給予攜帶siRNA 或合適對照的等份（50 μ 1/孔）H-mers。將細胞在37°C、5% CO2下培養(yǎng)6至72小時并進 行流式細胞計量術和/或實時RT-PCR分析。
[0240] 定量RT-PCR :使用ABI -步以上設備進行定量RT-PCR，如之前所描述。人OASl和 IFN-β的引物如之前所描述的使用[Peer等，Science2008, 319(5863) :627-30]。引物序 列如下：
[0241] 人細胞周期蛋白Dl (CCNDl)
[0242] 正向：TGCTCCTGGTGAACAAGCTCAAGT(SEQ ID N0:1)
[0243] 反向：TGATCTGTTTGTTCTCCTCCGCCT(SEQ ID N0:2)
[0244] GAPDH
[0245] 正向：GACCCCTTCATTGACCTCAAC(SEQ ID N0:3)
[0246] 反向：CTTCTCCATGGTGGTGAAGA(SEQ ID N0:4)
[0247] STATl
[0248] 正向：GTGCATCATGGGCTTCATCAGCAA(SEQ ID N0:5)
[0249] 反向：TAGGGTTCAACCGCATGGAAGTCA(SEQ ID N0:6)
[0250] 結果
[0251] 攜帶siRNA的涂布透明質酸納米顆粒（H-mer)的制備和結構特征
[0252] 如在實驗部分詳細描述的，制備攜帶siRNA的H-mer。使用幾種帶正電的材料用于 siRNA與DOTAP、PEI、oligofectamine?和人重組魚精蛋白等的自組裝過程。
[0253] 用乙酸鹽緩沖液產生的DOTAP H-mers形成如它們的形貌學（圖1A)和它們的流 體動力直徑（表1)表明的均勻的球狀納米顆粒形狀。測量它們的ξ電位（表1)，表明它 們在生理pH下的穩(wěn)定性（在這些條件下未形成聚集體）。另外，H-mers攜帶大量的RNAi 有效負載（表1)。
[0254] 表 1
[0255]
【權利要求】
1. 一種用于輸送多核苷酸至靶細胞的顆粒，其包括多核苷酸和陽離子脂質之間的由包 含糖胺聚糖的外殼圍繞的復合體的核心，所述糖胺聚糖作為靶向部分共價結合至所述復合 體，其中所述復合體： (i) 不包括在脂質體中； (ii) 包括-25至-50mV的4電位；和 (iii) 當在溶液中時直徑約為100-300nm。
2. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，其中所述多核苷酸包括DNA、RNA、或其二者。
3. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，其中所述多核苷酸選自單鏈的和雙鏈的多核苷酸。
4. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，其中所述多核苷酸為RNA沉默劑。
5. 根據(jù)權利要求4所述的顆粒，其中所述RNA沉默劑選自siRNA、miRNA、反義寡核苷酸 和核糖核酸酶。
6. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，其中所述陽離子脂質選自1，2_二月桂酰-sn-甘 油基-3-磷酸乙醇胺（DLPE)、1，2_二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇（DLPG)、18 : 1TAP (ODTAP) 1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷、14 :OTAP (1，2-二肉豆蘧?；?3-三 甲基銨-丙烷）、16 :OTAP (1，2-二棕櫚酰基-3-三甲基銨-丙烷）、18 :OTAP (1，2-硬脂 ?；?3-三甲基銨-丙烷）、N-[l-(2,3-二油烯氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨 (DOTMA)、二甲基雙十八基銨（DDAB)、1，2-二-(9Z-十八碳烯酰）-3-二甲基銨-丙烷和鹽 酸3P-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰]膽固醇（DC-膽固醇）。
7. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，進一步包括中性脂質、陰離子磷脂、合成聚合物或膽固 醇的一種或多種。
8. 根據(jù)權利要求7所述的顆粒，其中所述中性脂質包括二油烯基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)。
9. 根據(jù)權利要求7所述的顆粒，其中所述陰離子磷脂選自磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂 酰膽堿和磷脂酰甘油。
10. 根據(jù)權利要求7所述的顆粒，其中所述合成聚合物包括聚乙烯亞胺（PEI)或 聚-L-賴氨酸。
11. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，其中所述糖胺聚糖選自透明質酸（HA)、硫酸角質素、 硫酸軟骨素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、鹽、和其混合物。
12. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，進一步包括至少一個另外的靶向部分，所述另外的靶 向部分選自抗體、抗體片段、受體配體和適配體。
13. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，是帶電的或中性的。
14. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，包括大于約6, 000個多核苷酸分子。
15. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，包括（1，2_二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (DLPE)和1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇（DLPG)。
16. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒，包括膽固醇和二油?；谆@丙烷（D0TAP)。
17. -種組合物，其包括權利要求1所述的多個顆粒并且基本上是均勻的。
18. 根據(jù)權利要求1所述的顆粒在制備用于下調靶細胞中感興趣基因的藥物中的用 途，所述靶細胞表達⑶44。
19. 根據(jù)權利要求18所述的用途，其中所述感興趣基因為致癌基因和/或與生存能力 相關的基因。
20.根據(jù)權利要求1所述的顆粒在制備用于治療有需要的對象中癌的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K31/7088GK104491872SQ201410727395
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2010年7月29日 優(yōu)先權日:2009年7月31日
【發(fā)明者】D·皮爾 申請人:特拉維夫大學拉莫特有限公司