抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分離方法，具體按照以下步驟實施：(1)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備，透析及萃取獲得小分子量且極性在乙醇范圍的流份；(2)正相硅膠柱分離；(3)凝膠柱分離；(4)陰離子交換柱靜態(tài)吸附，最后獲得抑制多酚氧化酶的高活性流份。該流份活性好、穩(wěn)定性高、色澤淺、無風(fēng)味，能有效控制易褐變果蔬及海產(chǎn)品在保鮮與加工中的酶促褐變，同時宜用于化妝品中作為美白劑。
【專利說明】抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份， 本發(fā)明還涉及一種抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 食品體系，如蘋果、香蕉、梨、土豆、蓮藕、對蝦等，易發(fā)生酶促褐變。引起食品體系 酶促褐變的關(guān)鍵因子便是多酚氧化酶（PPO)。多酚類底物與多酚氧化酶（PPO)的區(qū)室化被 破壞之后，在有氧的情況下，多酚氧化酶（PPO)便催化發(fā)生酶促褐變，使食品體系變黑。在 食品體系中直接添加褐變抑制劑因方便有效、應(yīng)用范圍廣而歷來被采用。亞硫酸鹽等含硫 制劑是系列高效且低廉的褐變抑制劑。多年來，其在食品工業(yè)廣泛被采用。然而，因其潛在 的安全性問題，F(xiàn)DA已經(jīng)禁止了其在食品中的應(yīng)用。因此，尋找適宜的替代物正成為熱點。
[0003] 從作用機理的角度來講，目前已被篩選的褐變抑制劑一般分為以下幾種類型：（1) 自身具有還原作用的一類，如抗壞血酸及其類似物、含硫制劑。其通過自身被氧化而達到遏 制體系褐變的目的。（2)EDTA、DIECA等螯合劑。其能螯合PPO所需的Cu2+從而抑制PPO的 活性。（3)能和反應(yīng)體系中的一些物質(zhì)形成復(fù)合物的復(fù)合劑，如環(huán)糊精、殼聚糖等。環(huán)糊精 的疏水腔能與疏水基團的多酷氧化酶底物形成包合物，而殼聚糖自身帶的負電荷能與帶正 電荷的物質(zhì)形成復(fù)合物，半胱氨酸等硫醇化合物和醌結(jié)合形成穩(wěn)定的無色化合物。（4)抗 壞血酸、檸檬酸、磷酸等酸化劑。通過降低體系pH，使多酚氧化酶遠離最適pH。（5)酶抑制 劑。酶抑制劑又分為兩種，競爭性抑制劑和非競爭性抑制劑。如苯甲酸和4-己基間苯二酚 是競爭性抑制劑，而蜂蜜中的多肽以及大蒜提取物對多酚氧化酶活性具有非競爭性抑制作 用。有一些抑制劑的作用機理有幾種，如曲酸既能和醌結(jié)合，又能起到抑制多酚氧化酶活性 的作用?？箟难?、4-羥基己基間苯二酚等非硫抗褐變劑在商業(yè)應(yīng)用上已取得了一定的成 功。然而，抗壞血酸屬于消耗性的，其有效作用時間有限，4-羥基己基間苯二酚已被確證安 全性有問題。
[0004] 總體來說，目前尚無焦亞硫酸鹽等含硫制劑的有效替代劑。最新研宄顯示，部分美 拉德產(chǎn)物具有極強（效果和焦亞硫酸鹽等含硫制劑等同或接近）的抑制食品體系酶促褐變 的作用（Billaud，etal.，2005)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是復(fù)雜的混合物，包含很多有色和無色的 物質(zhì)，這些物質(zhì)具有很寬廣的極性范圍和分子量范圍。Wu，etal(2008)指出，美拉德產(chǎn)物作 為褐變抑制劑時還存在一些局限性，如活性流份不穩(wěn)定、色澤偏深、風(fēng)味較強等特點。因此， 通過對美拉德產(chǎn)物中活性流份進行分離純化，去除其中的不良流份，富集、純化其中的活性 流份已成為一個研宄熱點。針對上述問題，已有一些針對性研宄開展。Wijewickreme,et al(1997)采用制備型反向HPLC對美拉德產(chǎn)物中的抗氧化成分進行了初步的分離，而mi，et al(2008)采用C18柱子對酪氨酸酶（多酚氧化酶的一種）具有抑制作用的流份進行了分離 而純化，發(fā)現(xiàn)得到的純化單流份不具有抑制活性，而部分具有活性的混合多流份因為極性 太高，未能進一步實現(xiàn)有效純化?；钚蕴己虲18膠柱（Sep-PakCartridgeC18)被用于美拉 德產(chǎn)物的脫色，同時結(jié)果顯示，脫好色的美拉德產(chǎn)物同時散失了大部分抑制草蝦中PPO的 能力（Matmaroh，etal.，2005)。從上述文獻不難看出，美拉德產(chǎn)物中的抑制PPO的高活性 流份的分離純化及表征是件非常具有挑戰(zhàn)性的工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供抑制多酚氧化酶的高活性美拉 德流份，同時對高活性流份進行相關(guān)表征。
[0006] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種上述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份 的分離方法。
[0007] 本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，一種抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其 以葡萄糖或木糖與半胱氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液為原料。
[0008] 本發(fā)明所采用的第二技術(shù)方案是，一種上述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流 份的分離方法，具體按照以下步驟實施：
[0009] (1)調(diào)節(jié)原料的pH值為1?3,在溫度105?115°C條件下反應(yīng)Ih?2. 5h，反應(yīng) 結(jié)束，進行透析得到低分子量的美拉德產(chǎn)物，冷凍干燥后以乙醇萃?。?br> [0010] ⑵將步驟⑴中得到的美拉德產(chǎn)物進行硅膠柱層析，收集對多酚氧化酶的抑制 率最強的流份；
[0011] (3)將步驟（2)中得到的流份進行葡聚糖凝膠柱層析，收集對多酚氧化酶的抑制 率最強的流份；
[0012] (4)將步驟3中的組份進行陰離子交換樹脂的靜態(tài)吸附，連續(xù)用PH8?1的水溶液 進行連續(xù)解吸，得到PH為4、3、2、1時解吸下來的流份或其任意合并液皆具有高活性。
[0013] 本發(fā)明的特點還在于，
[0014] 優(yōu)選使用透析袋或超濾膜進行透析，孔徑小于或等于3500U。
[0015] 硅膠柱層析的洗脫劑選自不同比例的氯仿、甲醇、水以及它們的組合。
[0016] 硅膠柱層析的洗脫劑為梯度溶劑，具體為氯仿：甲醇=1:1?8,純甲醇，甲醇：水 =9?1:1 ;或者，洗脫劑為甲醇：水=4?1:1。
[0017] 葡聚糖凝膠柱層析的洗脫劑選自甲醇、乙醇或水以及它們的組合。
[0018] 葡聚糖凝膠柱層析的洗脫劑為甲醇：水=3?1:1 ;或者洗脫劑采用梯度溶劑，具 體為氯仿：甲醇=1:1?5,純甲醇，甲醇：水=4?1:1。
[0019] 上述美拉德流份或分離方法制備得到的美拉德流份用于抑制果蔬、海產(chǎn)品等褐變 的用途。
[0020] 上述美拉德流份或分離方法制備得到的美拉德流份用于化妝品添加劑的用途。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：通過本發(fā)明中提到的方法，能將美拉德產(chǎn)物中的高活性、穩(wěn) 定性好、色澤淺、無風(fēng)味的高效流份進行有效的分離和純化，得到的高活性流份的IC5tl(按 摩爾濃度算）要遠低于焦亞硫酸鹽等含硫制劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明實施例1中正相硅膠柱不同流份的薄層層析；
[0023] 圖2是本發(fā)明實施例1中正相硅膠柱不同流份的濃縮狀；
[0024] 圖3是本發(fā)明實施例1中SephadexLH-20層析柱不同流份的薄層層析；
[0025] 圖4是本發(fā)明實施例1中S印hadexLH-20層析柱不同流份的濃縮狀；
[0026] 圖5是本發(fā)明實施例1中不同濃度的pH=2解吸液對PPO的抑制率；
[0027] 圖6是本發(fā)明實施例1中pH=2解吸液的MRPs對PPO的抑制類型和抑制常數(shù)的 測定；
[0028]圖7是本發(fā)明實施例1中pH=2解吸液的分析型高效液相色譜圖；
[0029] 圖8是本發(fā)明實施例1中pH=2解吸液的質(zhì)譜圖。

【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0031] 本發(fā)明提供一種抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其以葡萄糖或木糖與半胱 氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液為原料。通過實施例1-3分離得到目 標(biāo)流份，改變了分離純化順序的案例為實施案例4。
[0032] 實施例1 :
[0033] 步驟1、美拉德產(chǎn)物的制備
[0034] 配制濃度均為lmol/L的葡萄糖與半胱氨酸鹽酸鹽溶液，兩種溶液等體積混合，用 NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值為2。然后將混合液置于壓力反應(yīng)釜中，在溫度為IKTC條件下 反應(yīng)Ih。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻，采用截留分子量為3500u的透析袋對對MRPs進行 透析，4°C下放置24h，中間換三次水，得到兩種物質(zhì)分別為MW>3500u和MW〈3500u的MRPs， 冷凍干燥以備待用。選擇MW〈3500u的MRPs，料液比為1:50,用無水乙醇，搖床提取，提取次 數(shù)為3次，冷凍干燥以備用；
[0035] 步驟2、硅膠柱層析
[0036] 稱取95%乙醇萃取的MRPs與等重的粗硅膠攪拌均勾，所得干粉即為上樣樣品。再 稱取細硅膠，氯仿裝柱，干法上樣，采用梯度溶劑（氯仿：甲醇=1:2,氯仿：甲醇=1:4,純 甲醇，甲醇：水=9:1，甲醇：水=4:1，甲醇：水=3:2)洗脫，分管收集不同的流份，顯色 合并及活性追蹤。
[0037] 步驟3、葡聚糖凝膠柱層析
[0038] 甲醇溶劑溶脹葡聚糖凝膠24小時后待用，將從步驟2中得到的最高活性（同時兼 具高穩(wěn)定性）的樣品用少量溶劑溶解，過濾除去雜質(zhì)，以甲醇：水=3:2作為洗脫劑，常壓 過柱，分管收集不同的流份，顯色合并及活性追蹤。
[0039] 步驟4、陰離子靜態(tài)吸附
[0040] 稱取一定量陰離子樹脂置于50mL錐形瓶中，加入濃度為5mg/mL的從步驟3中得 到的高活性流份（兼具高穩(wěn)定性），控溫搖床中震蕩至平衡狀態(tài)。抽干，收集所得濾液。然 后依次用pH為8、7、6、5、4、3、2、1的水溶液解吸，置于恒溫搖床中振蕩。將各個所得濾液真 空濃縮，稱其質(zhì)量，并進行多酚氧化酶抑制活性的測定?；钚约胺€(wěn)定性測試結(jié)果見表1。
[0041] 表1實施案例1中流份的活性及穩(wěn)定性
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其特征在于，其以葡萄糖或木糖與半胱 氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液為原料。
2. -種如權(quán)利要求1所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法，其特征 在于，具體按照以下步驟實施： (1) 調(diào)節(jié)原料的pH值為1?3,在溫度105?115°C條件下反應(yīng)lh?2. 5h，反應(yīng)結(jié)束， 采用透析袋對其進行透析，得到低分子量的美拉德產(chǎn)物，冷凍干燥后以20-100%的乙醇萃 ??； (2) 將步驟1中得到得低分子量及極性一定的美拉德產(chǎn)物進行硅膠柱層析，得到對多 酚氧化酶的抑制率最強的流份； (3) 將步驟2中得到的流份進行葡聚糖凝膠柱層析，得到對多酚氧化酶的抑制率最強 的流份； (4) 將步驟3中的組份進行陰離子交換樹脂的靜態(tài)吸附，連續(xù)用7. 1?8、6. 1?7、 5. 1?6、4. 1?5、3. 1?4、2. 1?3、1. 1?2、0. 1?1的水溶液進行連續(xù)解吸，最后用pH 值小于或等于4的解析液得到的流份或者其合并液皆具有高活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法，其特征在 于，所述的透析袋或超濾膜孔徑小于或等于3500U。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法，其特征在 于，所述的硅膠柱層析的洗脫劑為不同比例的氯仿、甲醇、水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法，其特征在 于，所述的硅膠柱層析的洗脫劑為梯度溶劑，氯仿：甲醇=1:1?8，純甲醇，甲醇：水=9? 1:1 ;或者，洗脫劑為甲醇：水=4?1:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法，其特征在 于，所述的葡聚糖凝膠柱層析的洗脫劑為甲醇、乙醇、水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分離方法，其特征在 于，所述的葡聚糖凝膠柱層析的洗脫劑甲醇：水=3?1:1 ;或者洗脫劑采用梯度溶劑，具 體為氯仿：甲醇=1:1?5,純甲醇，甲醇：水=4?1: 1。
8. 權(quán)利要求1所述的美拉德流份、2至7任一項所述分離方法制備得到的美拉德流份 用于抑制果蔬、海產(chǎn)品褐變的用途。
9. 權(quán)利要求1所述的美拉德流份、2至7任一項所述分離方法制備得到的美拉德流份 用于化妝品添加劑的用途。
【文檔編號】A61K8/44GK104472669SQ201410610802
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】袁德保, 李奕星, 李芬芳, 王朝政, 周婭, 金志強 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站