口蹄疫病毒衣殼蛋白串聯(lián)共表達(dá)和病毒樣顆粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及大腸桿菌來源的以單個質(zhì)粒串聯(lián)可溶共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP0(其為VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3，以及口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆粒的制備方法。口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆?？梢杂糜诳谔阋咭呙绲闹苽洹１景l(fā)明提供的方法，從多個方面對大腸桿菌可溶共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白進(jìn)行了研究，綜合運用串聯(lián)共表達(dá)和帶SUMO標(biāo)簽的技術(shù)可溶共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP0(其為VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3，最終獲得的目的蛋白占到菌體總蛋白的約20％，純化獲得的口蹄疫病毒衣殼蛋白成功組裝成病毒樣顆粒。
【專利說明】口蹄疫病毒衣殼蛋白串聯(lián)共表達(dá)和病毒樣顆粒的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種口蹄疫病毒衣殼蛋白基因及載 體、菌株及其表達(dá)方法，和含該病毒樣顆粒的疫苗及其在預(yù)防口蹄疫感染的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄動物共患病，個別口蹄疫病毒的變種可傳 染給人?？谔阋甙Y狀表現(xiàn)為蹄冠、趾間、蹄踵皮膚發(fā)生水泡和爛斑，部分動物口腔黏膜和鼻 盤也有同樣病變。口蹄疫的傳染性極強，傳播迅速，感染和發(fā)病率很高，可引起大量死亡，造 成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，在國際上被劃分為一類烈性傳染病。在上世紀(jì)50-60年代英、法等國都 曾爆發(fā)過大規(guī)模的口蹄疫疫情。在中國也出現(xiàn)過多次大規(guī)模流行，成為畜牧業(yè)的"頭號殺 手"。
[0003] 口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)屬于小 RNA 病毒科，口蹄 疫病毒屬，該病毒有七個血清型（〇、A、C、SATl (南非I)、SAT2 (南非2)、SAT3 (南非3)和 Asial (亞洲1型），65個亞型，各型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)，感染了一個血清型的口蹄疫的動 物仍可感染另一血清型的口蹄疫病毒。FMDV基因組RNA全長約8. 5kb，依次為5' UTR、ORF 和3' UTR組成。期中ORF約6. 5kb長，由L基因、Pl結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基 因以及其始密碼子和終止密碼子組成。口蹄疫病毒病毒外殼為對稱的20面體，由衣殼蛋白 VP1，VP2，VP3和VP4組成。這些衣殼蛋白決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學(xué)反應(yīng)能力。
[0004] 目前英美等發(fā)達(dá)國家都已全面消滅了口蹄疫。在中國，口蹄疫疫苗被列為強制免 疫品種，執(zhí)行嚴(yán)格的疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在我國主要有三種口蹄疫病毒亞型流行：亞洲I型、A 型、和0型。
[0005] 目前，中國市場上占主導(dǎo)地位的是針對0型和亞洲I型的傳統(tǒng)滅活苗。滅活疫苗 等傳統(tǒng)疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制口蹄疫的過程中發(fā)揮著重要作用。但由于 滅活疫苗存在病毒毒力返強、病毒滅活不徹底、活病毒逃逸等不安全因素，滅活疫苗中殘存 的活病毒有可能會造成口蹄疫病毒的泛濫。
[0006] 理想的口蹄疫疫苗必須安全、有效、同時還應(yīng)具備價廉、易于推廣等優(yōu)點?？谔阋?滅活疫苗除了存在潛在的不安全性影響其使用外，滅活疫苗的高制備成本限制了該疫苗的 推廣。因此研制生產(chǎn)保護(hù)性和安全性俱佳的口蹄疫基因工程疫苗，同時可以根據(jù)需要制備 多價病毒疫苗，大幅度節(jié)約生產(chǎn)成本成為口蹄疫疫苗研發(fā)的主要方向。
[0007] 基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的以病毒樣顆粒為主的基因工程疫苗已經(jīng)成功運用于現(xiàn)代 疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)。但是基因工程疫苗通常采用真核表達(dá)系統(tǒng)。生產(chǎn)成本偏高，不適合大 規(guī)模推廣。
[0008] 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因工程表達(dá)系統(tǒng)之一。由于該表達(dá)系 統(tǒng)具有易于培養(yǎng)，不需要復(fù)雜設(shè)備，安全性高的顯著特點，因此被廣泛應(yīng)用于生物制藥行業(yè) 中。糖基化修飾是真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)的主要區(qū)別之一，但是沒有報道提到口蹄 疫病毒的衣殼蛋白，包括VPl，VP2, VP3和VP4,含有任何糖基化位點，因此用兩種系統(tǒng)表達(dá) 的衣殼蛋白在糖基化修飾方面并沒有區(qū)別?？谔阋卟《镜耐鈿な怯?個衣殼蛋白有規(guī)律的 組裝成的20面體。大量的研究表明，在大腸桿菌中單獨表達(dá)口蹄疫病毒外殼蛋白或用不同 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大腸桿菌獲得的基因工程菌，表達(dá)的口蹄疫病毒外殼蛋白表達(dá)量非常低而且常 常不可溶，失去了大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用的可能。
[0009] 綜上所述，針對口蹄疫的防治需要，迫切需要建立一種生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低， 蛋白產(chǎn)量高的大腸桿菌來源的口蹄疫病毒衣殼蛋白串聯(lián)可溶共表達(dá)和病毒樣顆粒的制備 方法，本發(fā)明因此而來。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的第一方面的技術(shù)問題，在于克服現(xiàn)有技術(shù)中口蹄疫病毒衣殼蛋 白在大腸桿菌中的表達(dá)量非常低而且不可溶的情況，提供一種在大腸桿菌中串聯(lián)可溶共表 達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和VPO (VP4和VP2的基因融合），最終獲得的目的蛋白約 占菌體可溶總蛋白的20%。
[0011] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種串聯(lián)可溶共表達(dá)口蹄疫衣殼蛋白VP3， VPl和VPO (VP4和VP2的基因融合）和病毒樣顆粒組裝制備方法，包括如下步驟。
[0012] (1)將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的口蹄疫病毒衣殼蛋白VPO基因（VP4和VP2的基因融合）， VPl和VP3的全長基因分別克隆入質(zhì)粒pETSUMO,分別獲得pETSUMO-VPO, pETSUMO-VPl和 PETSUM0-VP3三個質(zhì)粒，口蹄疫病毒衣殼蛋白VPO核苷酸序列如Seq ID No. Ia所示，口蹄疫 病毒衣殼蛋白VPl核苷酸序列如Seq ID No. Ib所示，口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3的核苷酸序 列如Seq ID No. Ic所示；
[0013] (2)用 PCR 方法從 pETSUM0-VP3, pETSUMO-VPl 和 pETSUMO-VPO 三個質(zhì)粒中分別擴 增出 RBS-SUM0-VP3, RBS-SUM0-VP1 和 RBS-SUM0-VP0 DNA 片段，按一定順序克隆入同一個 pET28b質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-TRI-Asial-VP310,其中RBS指核糖體結(jié)合位點；
[0014] (3)將所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET-TRI-Asial-VP310轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得基因工程菌；
[0015] (4)所述基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)串聯(lián)可溶共表達(dá)帶有SUMO標(biāo)簽的口 蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和VPO (VP4和VP2的基因融合）；
[0016] (5)回收基因工程菌菌體破碎后的上清液，色譜層析分離純化帶有SUMO標(biāo)簽的口 蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和VPO混合物，口蹄疫病毒衣殼蛋白VPO的氨基酸序列如Seq ID No. 2a所示，口蹄疫病毒衣殼蛋白VPl的氨基酸序列如Seq ID No. 2b所示，口蹄疫病毒 衣殼蛋白VP3的氨基酸序列如Seq ID No. 2c所示；
[0017] (6)酶切去除SUMO標(biāo)簽后，分子篩色譜層析分離純化獲得的口蹄疫病毒衣殼蛋白 VP3, VPl和VPO組裝成病毒樣顆粒。
[0018] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有權(quán)利要求1步驟（2)所述重組表達(dá)質(zhì)粒串聯(lián) 可溶共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP〇, VPl和VP3。
[0019] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有權(quán)利要求1步驟（3)所述基因工程菌為 BL21(DE3)/pET-TRI-Asial-VP310〇
[0020] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有權(quán)利要求1步驟（3)所述大腸桿菌為 BL21(DE3) 〇
[0021] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有權(quán)利要求1步驟（4)所述基因工程菌串聯(lián)可 溶共表達(dá)帶有SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和VPO (VP4和VP2的基因融合）。
[0022] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有權(quán)利要求1步驟（5)所述分離純化的蛋白是 帶有SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和VPO (VP4和VP2的基因融合）的混合物。
[0023] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有權(quán)利要求1步驟（6)所述分離純化的酶切去 除SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和VPO (VP4和VP2的基因融合）的混合物。
[0024] 本發(fā)明的另一方面為使用本發(fā)明所述方法制備的口蹄疫病毒衣殼蛋白（VP0(VP4 和VP2的基因融合），VPl和VP3)組成的病毒樣顆粒。
[0025] 本發(fā)明的另一方面為使用本發(fā)明所述方法制備用于預(yù)防口蹄疫感染的疫苗，其包 括：前述組裝得到的口蹄疫病毒樣顆粒，及疫苗用賦形劑或載體。本發(fā)明的另一方面為使用 本發(fā)明所述方法構(gòu)建的基因工程菌，其特點在于，所述基因工程菌串聯(lián)可溶共表達(dá)口蹄疫 病毒衣殼蛋白VP3基因，VPl基因和VPO基因（為VP4和VP2的基因融合）；VP0核苷酸序 列如SeqID No. Ia所示；VPl基因核苷酸序列如SeqID No. Ib所示；VP3基因核苷酸序列如 SeqID No. Ic 所示。
[0026] 本發(fā)明提供一種基于大腸桿菌來源的串聯(lián)可溶共表達(dá)在中國流行的口蹄疫病毒 的衣殼蛋白的高效方法?；诒緦嶒炇业募夹g(shù)，從多個方面對大腸桿菌可溶共表達(dá)口蹄疫 病毒衣殼蛋白進(jìn)行了研究，綜合運用串聯(lián)共表達(dá)和帶SUMO標(biāo)簽的技術(shù)可溶共表達(dá)口蹄疫 病毒衣殼蛋白VP3, VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合），最終獲得的目的蛋白占到菌體總蛋 白的約20%。然后通過色譜層析分離獲得帶有SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl 和VP0,酶切去除SUMO標(biāo)簽后，色譜層析分離純化獲得的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VPl和 VPO組裝成病毒樣顆粒。
[0027] 色譜層析分離方法條件溫和，沒有使用諸如尿素等變性劑，目的蛋白的活性得到 了最大程度的保護(hù)，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)沒造成破壞，這保證了純化獲得的口蹄疫衣殼蛋白保 持了天然活性，各口蹄疫衣殼蛋白之間最大程度保持了天然的結(jié)合活性。而且，在色譜純化 過程中，整個工藝流程簡單，無需進(jìn)行緩沖液置換等步驟，不需要使用超離心等復(fù)雜工藝， 并且兩步色譜的回收接近30%，使得以工業(yè)化規(guī)?？扇苄员磉_(dá)純化口蹄疫病毒衣殼蛋白成 為可能，而且整個工藝過程中，均未涉及到變性劑，純化過程和組裝過程均不會對蛋白的構(gòu) 象產(chǎn)生影響和破壞病毒樣顆粒的中和表位，這樣生產(chǎn)的病毒樣顆粒具有高度的免疫原性， 免疫機體后會誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，對免疫動物起到很好的保護(hù)性效果。
[0028] 本發(fā)明的技術(shù)方案為在大腸桿菌中串聯(lián)可溶共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3， VP1，VPO (VP4和VP2的基因融合），并在此基礎(chǔ)上，建立了一套高效、適宜放大的口蹄疫疫苗 中試生產(chǎn)工藝。建立了一套口蹄疫疫苗質(zhì)量研究體系，并通過動物實驗對大腸桿菌來源的 口蹄疫疫苗的有效性，穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。
[0029] 本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋
[0030] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)"是指由大腸桿菌（菌株）與載體組成，其 中大腸桿菌（菌株）來源于市場上可得到的，在此舉例但不限于：BL21(DE3)，Β834ΦΕ3)， BLR (DE3)，JM109, XLlBlue，ER2566, Rosetta，GI698。優(yōu)選 BL21 (DE3)。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"載體"一詞指的是，可將某編碼蛋白的多聚核苷酸插入其中并 使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運載工具。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜 帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。舉例來說，載體包括：質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒 等等。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"串聯(lián)共表達(dá)"一詞指的是把多個基因插入到同一個載體中共 表達(dá)。串聯(lián)共表達(dá)順序包括但不限于VP3, VP1，VPO (為VP4和VP2的基因融合）之間的各 種可能組合以及VPI，VP2，VP3，VP4之間的各種可能組合，例如可以是VPI-VP3-VP0的串聯(lián) 順序，VP3-VP0-VP1的串聯(lián)順序，VP1-VP0-VP3的串聯(lián)順序，VP3-VP1-VP2-VP4的串聯(lián)順序， VP1-VP2-VP3-VP4的串聯(lián)順序等等，優(yōu)選VP3-VP1-VP0的串聯(lián)順序。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"疫苗用賦形劑或載體"是指選自一種或多種，包括但不限于：pH 調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液， 表面活性劑包括陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。舉例但不限于：Tween-80。佐劑 舉例但不限于氫氧化鋁，氟氏完全佐劑。離子強度增強劑舉例但不限于氯化鈉。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"色譜層析"包括但不限于：離子交換色譜（例如陽離子交換色 譜）、疏水相互作用色譜、吸附層析法（例如羥基磷灰石色譜）、凝膠過濾（凝膠排阻）層析 法、親和層析法、分子篩層析法。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1，VP0(VP4和VP2的基 因融合）的方法中，緩沖液是指可在一定范圍內(nèi)維持PH值穩(wěn)定的溶液，包括但不限于，Tris 緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明，所述原核宿主細(xì)胞破碎包括但不限于通過勻漿器破碎、均質(zhì)機破碎、 超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理中的一項或者多項方法來實現(xiàn)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1，VP0(VP4和VP2的基 因融合）蛋白的方法中，所用的鹽包括但不限于是中性鹽，特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、 硫酸鹽,硫酸鹽,碳酸氫鹽,磷酸鹽或磷酸氫鹽,特別是NaCl、KC1、NH 4C1、（NH4) 2S04中的一種 或幾種。優(yōu)選NaCl。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆粒如下獲得：將酶切去除SUMO標(biāo)簽的 口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合）的蛋白溶液通過例如色譜層 析進(jìn)一步分離，得到純化的口蹄疫衣殼蛋白VP3, VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合）的蛋白 溶液?？谔阋卟《疽職さ鞍撞《緲宇w粒組裝的方式包括但不限于本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如，透 析，超濾或者層析等。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明獲得的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1，VP0(VP4和VP2的基因 融合）包括來源于蛋白序列高度相似的不同口蹄疫病毒血清型，亞型，突變株的衣殼蛋白 VPO (為VP4和VP2的基因融合），VPl和VP3,以及這些蛋白的蛋白片段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
[0041] 圖1為本發(fā)明帶SUMO標(biāo)簽表達(dá)的口蹄疫衣殼蛋白VP3, VPl和VPO (VP4和VP2的 基因融合）的SDS-PAGE結(jié)果。M:分子量Marker ;1 :誘導(dǎo)前全菌；2 :誘導(dǎo)后裂解全菌后的 上清；結(jié)果顯示，口蹄疫病毒衣殼蛋白在大腸桿菌中以帶SUMO標(biāo)簽的方式可溶共表達(dá)，且 目的蛋白約占菌體可溶總蛋白的20%左右。
[0042] 圖2為帶SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白經(jīng)過親和色譜純化后的SDS-PAGE結(jié) 果。M:分子量Marker ;1，經(jīng)本發(fā)明純化所得帶SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白上樣2μ 1 ; 2,經(jīng)本發(fā)明純化所得帶SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白上樣3μ 1。結(jié)果顯示，經(jīng)過純化的 帶SUMO標(biāo)簽的口蹄疫衣殼蛋白上樣純度達(dá)到了 70 %以上。
[0043] 圖3為帶SUMO標(biāo)簽的口蹄疫衣殼蛋白，經(jīng)酶切去除SUMO標(biāo)簽后分子篩色譜純化 的SDS-PAGE結(jié)果。1，經(jīng)本發(fā)明純化所得口蹄疫病毒衣殼蛋白上樣1 μ 1 ;2,經(jīng)本發(fā)明純化 所得口蹄疫病毒衣殼蛋白上樣2μ 1。結(jié)果顯示，經(jīng)過純化的口蹄疫病毒衣殼蛋白純度達(dá)到 了 90%以上。
[0044] 圖4為本發(fā)明所得的口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆粒透射電鏡觀察結(jié)果。視野中 可見大量均勻半徑為15nm左右的病毒樣顆粒，顆粒實際大小與理論大小相符，表觀狀態(tài)均 勻一致。
[0045] 圖5為本發(fā)明所得的口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆粒的動態(tài)光散射觀測結(jié)果。結(jié) 果顯示，口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆粒的水化分子動力學(xué)半徑為23. 37nm，顆粒組裝百分 比約為100%。
[0046] 圖6為本發(fā)明所得的口蹄疫病毒衣殼蛋白病毒樣顆粒接種小鼠后不同階段血清 總抗體滴度。圖中箭頭所示為免疫時間。在初免一月后，總抗滴度即有明顯上升，在經(jīng)過一 次加強免疫后，抗體的滴度即能達(dá)到IO 7的高水平。
[0047] 序列表說明：
[0048] Seq ID No. Ia為本發(fā)明口蹄疫衣殼蛋白VPO基因（VP4和VP2的基因融合）的核 苷酸序列。
[0049] Seq ID No. Ib為本發(fā)明口蹄疫衣殼蛋白VPl基因的核苷酸序列。
[0050] Seq ID No. Ic為本發(fā)明口蹄疫衣殼蛋白VP3基因的核苷酸序列。
[0051] Seq ID No. 2a為本發(fā)明口蹄疫衣殼蛋白VPO基因（VP4和VP2的基因融合）對應(yīng) 的氨基酸序列。
[0052] Seq ID No. 2b為本發(fā)明口蹄疫衣殼蛋白VPl基因?qū)?yīng)的氨基酸序列。
[0053] Seq ID No. 2c為本發(fā)明口蹄疫衣殼蛋白VP3基因?qū)?yīng)的氨基酸序列。

【具體實施方式】
[0054] 以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做 進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0055] 材料及試劑：本發(fā)明中涉及基因合成的由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成， pETSUMO質(zhì)粒購于Invitrogen公司，50L發(fā)酵罐購于上海保興生物公司，其它試劑及藥品為 普通市售產(chǎn)品。pET28b質(zhì)粒購自購于Novagen公司，大腸桿菌BL21 (DE3)購自New England Biolabs。
[0056] 實施例I :具有序列l(wèi)(la，lb，lc)的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2 的基因融合）串聯(lián)可溶共表達(dá)
[0057] I. 1用做模板之口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1，VPO基因片段的制備
[0058] 經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化的口蹄疫病毒衣殼蛋白基因全長（VP3, VP1，VP0)由 蘇州金唯智生物科技有限公司合成。所合成的基因片段全長分別為909 bp(VP0)，657 bp (VP3)，627 bp (VPl)。在此人工合成的口蹄疫病毒衣殼蛋白基因片段的基礎(chǔ)上制備本發(fā) 明口蹄疫病毒衣殼蛋白的模板。
[0059] 1. 2帶SUMO標(biāo)簽口蹄疫病毒衣殼蛋白基因（VP3, VP1，VP0)串聯(lián)共表達(dá)載體的構(gòu) 建
[0060] 以前一步驟所合成的口蹄疫病毒衣殼蛋白基因全長（VP3, VP1，VP0)基因片段 分別用做PCR反應(yīng)的模板。以Asial-VPOF為正向引物，以Asial-VPOR為反向引物，以 VPO為PCR模板擴增獲得口蹄疫病毒衣殼蛋白VPO基因；以Asial-VPlF為正向引物，以 Asial-VPlR為反向引物，以VPl為PCR模板擴增獲得口蹄疫病毒衣殼蛋白VPl基因；以 Asial-VP3F為正向引物，以Asial-VP3R為反向引物，以VP3為PCR模板擴增獲得口蹄疫病 毒衣殼蛋白VP3基因。正向引物的5'端引入限制性內(nèi)切酶BamH I位點及保護(hù)性堿基，其 中BamHI位點序列為GGATCC ;反向引物的5'端引入限制性內(nèi)切酶Not I位點，兩個終止密 碼子及保護(hù)性堿基，其中Not I位點序列為GCGGCCGC。在PCR儀按照如下條件進(jìn)行PCR反 應(yīng)：
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 口蹄疫病毒衣殼蛋白串聯(lián)可溶共表達(dá)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的口蹄疫病毒衣殼蛋白VPO基因，VP1和VP3的全長基因分別 克隆入質(zhì)粒pETSUMO,分別獲得pETSUM0-VP0，pETSUM0_VPl和pETSUM0-VP3三個質(zhì)粒，其中 VP0基因為VP4和VP2的基因融合而成，其核苷酸序列如Seq ID No. la所示，VP1基因的核 苷酸序列如Seq ID No. lb所示，VP3基因的核苷酸序列如Seq ID No. lc所示； (2) 用PCR方法從pETSUM0-VP3，pETSUM0-VPl和pETSUMO-VPO三個質(zhì)粒中分別擴增出 RBS-SUM0-VP3, RBS-SUM0-VP1 和 RBS-SUM0-VP0DNA 片段，按一定順序克隆入同一個 pET28b 質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-TRI-Asial-VP310,其中RBS指核糖體結(jié)合位點； (3) 將所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET-TRI-Asial-VP310轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得基因工程菌； (4) 所述基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)串聯(lián)可溶共表達(dá)帶有SUMO標(biāo)簽的口蹄疫 病毒衣殼蛋白VP3, VP1和VP0 ; (5) 回收基因工程菌菌體破碎后的上清液，親和色譜層析分離純化帶有SUMO標(biāo)簽的口 蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1和VP0蛋白混合物； (6) 酶切去除SUMO標(biāo)簽后，分子篩色譜層析分離純化獲得口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3， VP1和VP0蛋白混合物，并組裝成病毒樣顆粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)在所述重組表達(dá)質(zhì)粒中串聯(lián)可溶 共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白基因VP3, VP1和VP0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述大腸桿菌為BL21(DE3)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述基因工程菌為BL21(DE3)/ pET-TRI-Asial-VP310〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4)在所述基因工程菌中串聯(lián)可溶共 表達(dá)帶有SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白為VP3, VP1和VP0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5)所述分離純化獲得的蛋白是帶有 SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1和VP0的蛋白混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（6)所述分離純化獲得的蛋白是酶切 去除SUMO標(biāo)簽的口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3, VP1和VP0的蛋白混合物。
8. 由權(quán)利要求1-7任意一項所述方法制備得到口蹄疫病毒衣殼蛋白VPO, VP1和VP3組 成的病毒樣顆粒，所述VP0蛋白為VP4和VP2的基因融合表達(dá)產(chǎn)物，VP0氨基酸序列如SeqlD No. 2a2所示，VP1氨基酸序列如SeqlD No. 2b所示，VP3氨基酸序列如SeqlD No. 2c所示。
9. 一種用于預(yù)防口蹄疫感染的疫苗，其包括：權(quán)利要求8的口蹄疫病毒樣顆粒，及疫苗 用賦形劑或載體。
10. -種由權(quán)利要求1-5任意一項所述方法構(gòu)建得到的基因工程菌，其特征在于，所述 基因工程菌串聯(lián)可溶共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3基因，VP1基因和VP0基因；所述VP0 基因為VP4和VP2的基因融合，其核苷酸序列如SeqlD No. la所示；VP1基因核苷酸序列如 SeqlD No. lb所示；VP3基因核苷酸序列如SeqlD No. lc所示。
【文檔編號】A61K39/135GK104404074SQ201410609214
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】袁于人 申請人:斯澳生物科技（蘇州）有限公司