本發(fā)明涉及造影劑的制備，具體涉及一種納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑、其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
腫瘤的預(yù)后欠佳一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。由于腫瘤早期體積較小且無明顯癥狀，通常只有當(dāng)機(jī)體發(fā)生明顯的病理或解剖結(jié)構(gòu)改變時才能靠傳統(tǒng)的成像手段檢出異常。因此，發(fā)展一種能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的診斷方法具有非常重要的臨床價值。大量的臨床研究顯示血管生成是侵襲性實(shí)體瘤的重要特征。腫瘤新生血管與正常血管相比具有獨(dú)特之處，其血管結(jié)構(gòu)排列紊亂且具有明顯的滲漏性，內(nèi)皮間隙有380-780nm的孔道。腫瘤血管這種獨(dú)特的性質(zhì)為開發(fā)診斷及化療藥物制劑提供了可能。目前，腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)很大程度上依賴于影像技術(shù)的發(fā)展，它們?yōu)檠芯咳藛T和臨床醫(yī)生獲取解剖學(xué)和生理學(xué)信息提供了強(qiáng)有力的手段，其自身也從單一依靠形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行診斷逐漸發(fā)展成為集形態(tài)、功能和治療為一體的綜合診療體系。在眾多的醫(yī)學(xué)影像技術(shù)中，超聲診斷以其突出的許多優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高、直觀、無輻射、價廉和可實(shí)時顯像等，成為當(dāng)前最常用的影像學(xué)手段。超聲造影劑的出現(xiàn)彌補(bǔ)了常規(guī)超聲診斷的缺陷和不足，為腫瘤的診斷和治療提供了更多依據(jù)。然而常規(guī)的超聲造影劑是一種微米級氣泡，可自由通過肺濾但不能透過血管，僅能進(jìn)行血池顯影。因此，尋找小型化、穿透力強(qiáng)的聲學(xué)造影劑便成為超聲影像領(lǐng)域重要的研究方向。另一方面，各種醫(yī)學(xué)影像技術(shù)在時空分辨率等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)，到目前為止還沒有任何一種成像方式可以獲取完整的生物學(xué)信息。雖然超聲造影劑在一定程度上改善了超聲圖像的質(zhì)量，但是低的圖像分辨率卻限制了它在微小腫瘤鑒別方面的應(yīng)用。相比于超聲造影成像，熒光成像是以探針的熒光信號進(jìn)行示蹤，具有成像快速、分辨率高、價格低廉、無創(chuàng)無毒等優(yōu)點(diǎn)，是分子影像技術(shù)中強(qiáng)有力的手段。熒光染料、量子點(diǎn)以及稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料等的發(fā)展，使它們越來越廣泛地被用于醫(yī)學(xué)及生物成像研究領(lǐng)域。鑒于超聲診斷和熒光成像在成像靈敏度和圖像分辨率方面具有互補(bǔ)優(yōu)勢，如果能實(shí)現(xiàn)兩者聯(lián)用，將具有重大的臨床實(shí)際意義。然而這兩種成像模式分別是基于各自的成像原理獨(dú)立發(fā)展起來的，要真正實(shí)現(xiàn)軟硬件的兼容以及診斷圖像的融合，還有很多技術(shù)問題需要解決。除了成像設(shè)備的聯(lián)用，醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的另一種聯(lián)用手段是通過造影劑將兩者聯(lián)合起來，通過在一種造影劑平臺上同時耦合多種造影劑，利用現(xiàn)有的成像設(shè)備，既能進(jìn)行超聲造影，又可進(jìn)行熒光成像，通過對所得圖像的配準(zhǔn)和融合互補(bǔ)，得到更多有關(guān)病灶部位的信息，這種多模式造影劑是實(shí)現(xiàn)疾病早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早治療的必要前提。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑及其制備方法；得到的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑可以透過腫瘤血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入到腫瘤組織，同時具有超聲造影成像和熒光成像的功能，解決傳統(tǒng)臨床實(shí)踐中一種造影劑只能用一種影像學(xué)手段檢查帶來的種種不便。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的制備方法，包括以下步驟：（1）將高分子材料、熒光材料、表面活性劑加入到低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑中，混合得到油相體系；混合致孔劑與水，得到水相體系；然后將水相體系加入油相體系中，混合后進(jìn)行均質(zhì)乳化，得到乳化液；所述均質(zhì)乳化的條件為：轉(zhuǎn)速5000～35000轉(zhuǎn)/分，時間1～10分鐘；（2）將步驟（1）的乳化液進(jìn)行噴霧干燥，得到高分子微囊；所述噴霧干燥的條件為：噴霧網(wǎng)孔尺寸為4微米，進(jìn)風(fēng)溫度為50～60℃，氮?dú)饬魉?00～200L/min；（3）將步驟（2）得到的高分子微囊分散于賦形劑水溶液中，超聲分散，得到混合液；然后混合液經(jīng)液氮驟冷后置入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥，最后將氟碳?xì)怏w充入冷凍干燥機(jī)，即得到納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。本發(fā)明中，噴霧干燥時的參數(shù)對產(chǎn)品影響很大，決定產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)形態(tài)，參數(shù)如果不合適，無法制備出高分子微囊，而無法作為納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。本發(fā)明選用氮?dú)庾鳛楦稍餁怏w。上述技術(shù)方案中，高分子材料的分子量一般為10000~200000；可以選自透明質(zhì)酸、明膠、殼聚糖、海藻酸、白蛋白、聚乙交酯、聚丙交酯、聚乙交酯丙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯、聚羥丁酸中的一種或幾種的組合物。上述技術(shù)方案中，所述熒光材料為熒光染料、量子點(diǎn)、稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料中的一種或幾種的組合物；比如所述量子點(diǎn)為CdTexSe1-x、CdTexSe1-x@CdS、CdTexSe1-x@ZnS、Ag2S、PbS、PbSe/Te、CdHgTe中的一種或者幾種的組合物；所述稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料為Y2O3:Er3+、Y2O3:Er3+,Yb3+、Y2O3:Tm3+,Yb3+、Lu2O3:Er3+、Lu2O3:Er3+,Yb3+、Gd2O3:Er3+、Gd2O3:Er3+,Yb3+、Gd2O3:Tm3+,Yb3+、NaYF4:Er3+,Yb3+中的一種或者幾種的組合物；所述熒光染料為菁染料、酞菁染料、卟啉、熒光素、羅丹明、噁嗪、噻嗪中的一種或者幾種的組合物。上述技術(shù)方案中，所述表面活性劑為卵磷脂、脂肪酸甘油酯、聚山梨醇酯中的一種或幾種的組合物；所述致孔劑為碳酸銨、碳酸氫銨、氯化銨中的一種或幾種的組合物；所述賦形劑為甘露醇、聚山梨醇酯-80或者甘露醇和聚山梨醇酯-80的混合物，即甘露醇和/或聚山梨醇酯-80。上述技術(shù)方案中，所述低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑一般為沸點(diǎn)在30～50℃的有機(jī)溶劑，比如二氯甲烷。上述技術(shù)方案中，所述乳化液中，高分子材料濃度為0.1～10mg/mL，熒光材料濃度為0.001～0.05mg/mL，表面活性劑濃度為0.1～5mg/mL，致孔劑濃度為0.001～0.05mg/mL。優(yōu)選的技術(shù)方案中，均質(zhì)乳化的條件為：轉(zhuǎn)速15000～25000轉(zhuǎn)/分，時間5～8分鐘；噴霧干燥條件：噴霧網(wǎng)孔尺寸為4微米，進(jìn)風(fēng)溫度為55℃，氮?dú)饬魉?50～160L/min。由此得到的高分子微囊均勻性好，以此造影劑得到的超聲/熒光雙模態(tài)醫(yī)學(xué)造影成像圖清晰，準(zhǔn)確。本發(fā)明中，賦形劑可以作為凍干保護(hù)劑，還可以緩解高分子材料的降解；賦形劑水溶液的濃度沒有特別限制，本發(fā)明優(yōu)選為賦形劑水溶液含28g/L甘露醇和0.82g/L聚山梨醇脂80。本發(fā)明中，冷凍干燥可以去除水分，有利于提高產(chǎn)品的成像性能；氟碳?xì)怏w具有的低彌散性可保持其良好的超聲造影性能；可以將高分子微囊加入裝有賦形劑水溶液的試劑瓶中，分散均勻后，經(jīng)液氮驟冷后，將試劑瓶置入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥，最后將氟碳?xì)怏w充入冷凍干燥機(jī)，利用凍干機(jī)自帶壓蓋系統(tǒng)密封試劑瓶，即完成納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的制備。本發(fā)明還請求保護(hù)根據(jù)上述制備方法制備得到的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。本發(fā)明公開的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑為高分子微囊結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹有可熒光成像的熒光材料并存在孔洞，囊殼由高分子材料構(gòu)成；納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的尺寸為400～1000納米。本發(fā)明公開的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑由于尺寸較小可以透過腫瘤血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入到腫瘤組織，且同時具有超聲造影成像和熒光成像的功能，用于超聲/熒光雙模態(tài)成像，既能得到超聲成像圖像，又可得到熒光成像圖像，通過對所得圖像的配準(zhǔn)和融合互補(bǔ)，得到更多信息；可為疾病的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早治療提供一種全新的診斷制劑。因此，本發(fā)明還公開了上述納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑在超聲/熒光成像中的應(yīng)用。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn):1．本發(fā)明首次將納米噴霧干燥法應(yīng)用于制備造影劑，成功得到了高分子微囊，由此制備了納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑；制備過程簡單、快速；所的產(chǎn)品穩(wěn)定，差別小。2．本發(fā)明所公開的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑同時具有超聲造影成像和熒光成像的功能；通過得到的超聲成像圖像與磁共振成像圖像的配準(zhǔn)和融合互補(bǔ)，可以得到更多、更準(zhǔn)確的檢測信息，有利于臨床判斷。3．本發(fā)明公開的納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的尺寸范圍在400～1000納米之間，可以透過腫瘤血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入到腫瘤組織成像，改善了現(xiàn)有微米級造影劑僅能進(jìn)行血池顯影的局限。4．本發(fā)明公開的方法適用范圍廣，原料易得，無污染；并且所得產(chǎn)品同時具有超聲造影成像和熒光成像的功能，應(yīng)用前景廣。附圖說明圖1為實(shí)施例一得到的高分子微囊的掃描電鏡和透射電鏡圖；圖2為實(shí)施例一得到的高分子微囊的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜圖；圖3實(shí)施例二得到的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑在紫外燈下的照片圖；圖4實(shí)施例二得到的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑在兩種成像模式下的顯影效果圖；圖5實(shí)施例二得到的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑經(jīng)裸鼠皮下注射后的超聲造影圖；圖6實(shí)施例二得到的納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑經(jīng)裸鼠皮下注射后的熒光成像圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例、附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述:實(shí)施例一：一種納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的制備方法，包括以下步驟：（1）稱取0.5g聚乙交酯丙交酯共聚物、0.1g二花生?；字Ｄ憠A、1mg稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒（NaYF4:Yb3+,Tm3+）溶解分散于100mL二氯甲烷中，為油相體系；稱取0.11g碳酸銨溶解于1000mL去離子水中，為水相體系；將碳酸銨水溶液10mL加入到油相體系中；混合后均質(zhì)乳化，得到乳化液；均質(zhì)乳化條件為：轉(zhuǎn)速25000轉(zhuǎn)/分，時間5分鐘；（2）將步驟(1)得到的乳化液進(jìn)行納米噴霧干燥，噴霧干燥條件為：以氮?dú)庾鬏d氣，噴霧網(wǎng)孔尺寸為4微米，進(jìn)風(fēng)溫度為55℃，氮?dú)饬魉贋?50L/min。使用納米噴霧干燥儀（B-90，瑞士步琪）的高壓靜電收集器收集得到高分子微囊；（3）將步驟(2)得到的高分子微囊250mg分散于100mL賦形劑水溶液中（含28g/L甘露醇和0.82g/L聚山梨醇酯-80），超聲分散，液氮驟冷，而后真空冷凍干燥，充入氟碳?xì)怏w，即得一種納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。真空冷凍干燥在自動壓蓋冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行。圖1為步驟(2)制得的高分子微囊的掃描電鏡和透射電鏡照片（a、高分子微囊掃描電鏡照片；b、高分子微囊局部掃描電鏡照片；c、高分子微囊局部透射電鏡照片），從掃描電鏡照片可以看出，高分子微囊呈較規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，粒徑分布均勻且分散性良好，沒有粘連或明顯團(tuán)聚發(fā)生，大小主要集中在400～1000納米的范圍內(nèi)；局部掃描電鏡照片顯示，高分子微囊內(nèi)部具有孔洞，使其具有良好的聲學(xué)造影功能；透射電鏡照片中分散的許多黑點(diǎn)為稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子，其在高分子微囊中分布均勻，沒有出現(xiàn)明顯的聚集。圖2為步驟(2)制得的高分子微囊的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜。從光譜中可以看出，在980nm激發(fā)下，高分子微囊在800nm發(fā)出顯著的近紅外熒光，可以應(yīng)用于生物熒光成像中。實(shí)施例二：一種納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的制備方法，包括以下步驟：（1）稱取0.6g聚丙交酯、0.08g二棕櫚酰磷脂酰膽堿、1.5mg量子點(diǎn)（CdSe@ZnS）溶解分散于100mL二氯甲烷中，為油相體系；稱取0.11g碳酸氫銨溶解于1000mL去離子水中，為水相體系；將碳酸氫銨水溶液8mL加入到油相體系中中；混合后均質(zhì)乳化，得到乳化液；均質(zhì)乳化條件為：轉(zhuǎn)速15000轉(zhuǎn)/分，時間8分鐘；（2）將步驟(1)得到的乳化液進(jìn)行納米噴霧干燥，噴霧干燥條件為：以氮?dú)庾鬏d氣，噴霧網(wǎng)孔尺寸為4微米，進(jìn)風(fēng)溫度為55℃，氮?dú)饬魉贋?60L/min。使用納米噴霧干燥儀（B-90，瑞士步琪）的高壓靜電收集器收集得到高分子微囊；（3）將步驟(2)得到的高分子微囊250mg分散于100mL賦形劑水溶液中（含28g/L甘露醇和0.82g/L聚山梨醇酯-80），超聲分散，液氮驟冷，而后真空冷凍干燥，充入氟碳?xì)怏w，即得一種納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。圖3為上述納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑在紫外燈下的照片。生理鹽水（a）和步驟（2）制備的未包載量子點(diǎn)的納米高分子微囊（b）沒有任何熒光，而包載CdSe@ZnS量子點(diǎn)的納米高分子微囊（c）發(fā)出顯著的熒光，溶液各處的熒光強(qiáng)度相近，證明CdSe@ZnS量子點(diǎn)成功地包載到了高分子微囊中，且保留了量子點(diǎn)良好的發(fā)光特性。圖4為上述納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑在兩種成像模式下的顯影效果圖。在水槽中橫貫一根彈性透明醫(yī)用級硅膠管（內(nèi)徑約5mm），小心灌注超聲脫氣水直至將硅膠管浸沒。用鐵架臺將超聲探頭和紫外燈固定在合適的位置。實(shí)驗(yàn)步驟如下：開啟紫外燈，以推注生理鹽水的聲像圖作為對照，從硅膠管一端緩慢推注本發(fā)明制備的超聲/熒光雙模態(tài)造影劑，超聲診斷儀實(shí)時動態(tài)記錄硅膠管的超聲對比增強(qiáng)情況，同時在透明水槽前用攝像機(jī)實(shí)時記錄硅膠管熒光增強(qiáng)情況，最后將兩者疊加，觀察雙模式顯影劑同步對比增強(qiáng)效果。從圖中可以看出，當(dāng)管腔中充滿生理鹽水時，聲像圖呈完全無回聲狀態(tài)（a）；推注超聲/熒光雙模態(tài)造影劑之后，管腔中有造影劑的部分得到了明顯的增強(qiáng)，無造影劑部分仍呈現(xiàn)無回聲狀態(tài)（b）；在紫外燈照射下，發(fā)現(xiàn)圖4b中有回聲增強(qiáng)的液柱發(fā)出明亮的熒光，說明制得的超聲/熒光雙模態(tài)造影劑兼具優(yōu)秀的熒光成像能力，且與超聲造影圖像具有很好的同步性。利用PhilipsiU22型彩色超聲診斷儀，L9-3線陣探頭（9~3MHz）進(jìn)行體內(nèi)超聲造影實(shí)驗(yàn)。將裸鼠麻醉后，皮下注射超聲/熒光雙模態(tài)醫(yī)學(xué)顯影劑100μL（40mg/mL），攝取注射部位回聲增強(qiáng)圖片并存儲。圖5為上述納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑經(jīng)裸鼠皮下注射后的超聲造影圖。從圖中可以看出，在注射部位可見顯著的回聲增強(qiáng)。利用美國劍橋科研儀器公司的活體熒光成像系統(tǒng)（MaestroTMinvivoFluorescenceImagingSystem）進(jìn)行小動物活體成像。皮下注射超聲/熒光雙模態(tài)醫(yī)學(xué)顯影劑100μL（40mg/mL）。成像參數(shù)：激發(fā)光濾光片帶通465~495nm，經(jīng)515nm長通濾光片濾光后在550~700nm的波段收集發(fā)射光。成像軟件為儀器自帶的Maestro，通過CCD數(shù)碼相機(jī)采集圖像，可調(diào)式液晶濾光片自動地每間隔20nm波長對被檢動物進(jìn)行連續(xù)掃描，獲得一系列不同波長而連續(xù)的單色光譜圖。圖6為上述納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑經(jīng)裸鼠皮下注射后的熒光成像圖。從圖中可以看出，在注射部位可見明顯的熒光信號，實(shí)為注射的納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。實(shí)施例三：一種納米超聲/熒光雙模態(tài)造影劑的制備方法，包括以下步驟：（1）稱取1.0g殼聚糖、0.1g聚山梨醇酯-80、1.0mg熒光染料（sq635）溶解分散于100mL二氯甲烷中，為油相體系；稱取0.10g碳酸氫銨溶解于1000mL去離子水中，為水相體系；將碳酸銨水溶液15mL加入到油相體系中中；混合后均質(zhì)乳化，得到乳化液；均質(zhì)乳化條件為：轉(zhuǎn)速20000轉(zhuǎn)/分，時間5分鐘；（2）將步驟(1)得到的乳化液進(jìn)行納米噴霧干燥，噴霧干燥條件為：以氮?dú)庾鬏d氣，噴霧網(wǎng)孔尺寸為4微米，進(jìn)風(fēng)溫度為55℃，氮?dú)饬魉贋?60L/min。使用納米噴霧干燥儀（B-90，瑞士步琪）的高壓靜電收集器收集得到高分子微囊；（3）將步驟(2)得到的高分子微囊250mg分散于100mL賦形劑水溶液中（含28g/L甘露醇和0.82g/L聚山梨醇酯-80），超聲分散，液氮驟冷，而后真空冷凍干燥，充入氟碳?xì)怏w，即得一種納米級超聲/熒光雙模態(tài)造影劑。