一種骨支架復(fù)合材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于組織工程學(xué)領(lǐng)域，主要涉及一種骨組織工程支架復(fù)合材料的制備方法。具體步驟如下：a)去抗原松質(zhì)骨的制備；b)殼聚糖-β-甘油磷酸鈉-膠原溶液表面修飾的去抗原松質(zhì)骨支架的制備。本發(fā)明采用物理化學(xué)結(jié)合(超聲結(jié)合凍干)的方法較好的解決了松質(zhì)骨支架的去抗原問題，尤其是超聲處理，通過超聲溶液與超聲條件的配合最大限度的減少了抗原的存在，并且使去抗原的松質(zhì)骨支架具備較好的力學(xué)性能。
【專利說明】一種骨支架復(fù)合材料的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程學(xué)領(lǐng)域，主要涉及一種骨組織工程支架復(fù)合材料的制備方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨是一族生物礦物材料的總稱，主要發(fā)育于脊椎動(dòng)物中。雖然每一種類型的骨的 結(jié)構(gòu)和組成稍有變化，但都有一個(gè)共同的特點(diǎn)：它們主要成分都是由I型膠原纖維、碳羥磷 灰石和水組成。骨是最復(fù)雜的生物礦化系統(tǒng)之一，也是最典型的天然有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料。 骨中的碳輕磷灰石晶體都是板形的，平均長度和寬度分別為50nm和25nm ;晶體厚度極薄， 且非常一致，一般I. 5nm至4. Onm。骨的主要有機(jī)相為膠原纖維，另外還有少量骨涎酸蛋白、 硫酸軟骨素、脂類、肽類等。膠原纖維中的原膠原分子具有三重螺旋結(jié)構(gòu)，骨中的礦物相位 于原膠原分子間的間隙孔內(nèi)，排列成層，構(gòu)成骨的基本結(jié)構(gòu)。
[0003] 骨損傷是目前常見的疾病。由于風(fēng)濕、類風(fēng)濕等各種骨關(guān)節(jié)疾病或運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷所造 成的關(guān)節(jié)骨損傷給許多病人帶來痛苦。迄今為止，臨床上仍然缺少有效的方法修復(fù)大尺寸 的骨缺損。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)的方法和原理來進(jìn)行骨組織的修復(fù)是目前的一個(gè)重要手段，且取 得了良好的效果。其中，骨修復(fù)支架在骨再生中起著十分重要的作用。
[0004] 研究表明，一種適于骨修復(fù)的支架材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)1、與人體組織具有良好 生物相容性，無免疫源反應(yīng)；2、與人骨力學(xué)性能相近似，且具有一定的強(qiáng)度和支撐力；3、優(yōu) 良的三維微觀結(jié)構(gòu)，保證培養(yǎng)液及血液能夠進(jìn)入骨支架內(nèi)部，且易于成型；4、良好的成骨誘 導(dǎo)性；5、具有合適的表面理化性質(zhì)，且能被宿主骨組織吸收替代；6、取材方便，易于大量制 作。因此，在保證人工骨的承載功能（彈性模量）滿足要求的前提下，人工骨需要制成多孔 結(jié)構(gòu)，即滿足一定的孔隙率，從而促進(jìn)人工骨體內(nèi)生物相容性，保證骨細(xì)胞和營養(yǎng)液物質(zhì)在 支架內(nèi)的傳輸。目前，常用的骨支架材料包括：骨水泥，聚合材料（如PLGA，鈦合金等）等， 但上述材料都或多或少地存在細(xì)胞相容性差及因降解造成局部炎癥等問題。
[0005] 另外，在骨修復(fù)治療中會(huì)在骨修復(fù)材料中加入種子細(xì)胞輔助治療，但是種子細(xì)胞 與支架復(fù)合物植入機(jī)體后，血管新生需要數(shù)天時(shí)間，細(xì)胞耐受缺氧為數(shù)小時(shí)；細(xì)胞存活需 要的氧和營養(yǎng)僅能靠機(jī)體組織液滲透供應(yīng)，而氧的擴(kuò)散距離局限于〇. 2_內(nèi)，這就決定種 子細(xì)胞的成活及體外構(gòu)建組織工程化骨不能按照實(shí)際骨缺損的大小預(yù)構(gòu)，尤其是大塊骨缺 損，即構(gòu)建組織工程骨的厚度不能大于〇. 5mm，否則其中的種子細(xì)胞因得不到氧和營養(yǎng)物質(zhì) 的供應(yīng)而死亡。因此，血管化仍是組織工程骨研究和臨床應(yīng)用所面臨的瓶頸之一。雖然生 物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建的組織工程骨植入體內(nèi)有成骨作用，但植入初期與受區(qū)血液循環(huán)沒有直接 銜接，種子細(xì)胞成活及代謝產(chǎn)生的各種物質(zhì)與受體間交換仍靠滲透進(jìn)行，距離有限，效果難 以保證。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種骨組織工程支架復(fù)合材料的制備方法；具體步驟如下：
[0007] a)去抗原松質(zhì)骨的制備：
[0008] 剔除原料骨表面的骨膜、附著組織，并用雙蒸水漂洗干凈；分割成小骨塊，然后在 雙蒸水中攪拌浸泡7h，得到無血色的骨塊；骨塊撈出浙干后，置入25°C恒溫?fù)u床中，用1:1 氯仿/甲醇浸泡12h進(jìn)行脫脂，然后再用雙蒸水反復(fù)清洗3次，10-15min/次；制備成去抗 原松質(zhì)骨支架；
[0009] b)殼聚糖-β -甘油磷酸鈉-膠原溶液表面修飾的去抗原松質(zhì)骨支架的制備： [0010] 制備殼聚糖-β -甘油磷酸鈉-膠原溶液（C/GP/Co);將a)制備的去抗原松質(zhì)骨 支架浸入C/GP/Co溶液中，在37°C水浴中放置15min，去離子水清洗后冷凍干燥，得到C/GP/ Co修飾的去抗原松質(zhì)骨支架。
[0011] 在步驟a)中，在脫脂清洗處理后，還進(jìn)行超聲清洗脫細(xì)胞處理，具體處理方法為： 將骨塊放入含有〇. 05?0. 2%的胰酶、0. 1?0. 3%的烷基糖苷和0. 1 %的聚乙二醇的PBS 溶液中進(jìn)行超聲，pH為7. 4,超聲條件為：超聲頻率25kHz，超聲功率為50W，超聲時(shí)間5min， 超聲兩次；所述烷基糖苷為巴斯夫公司生產(chǎn)的Glucopon 225 DK。
[0012] 在步驟b)中，所述C/GP/Co溶液中，殼聚糖的濃度為15mg/ml，β-甘油磷酸鈉的 濃度為30mg/ml，膠原的濃度為35mg/ml，pH為L 4 ;在進(jìn)一步地實(shí)施中，所述C/GP/Co溶液 中還包含〇· 5ng/ml的BMP-2, 35ng/ml的bFGF和50mg/ml的女貞子總苷。所述女貞子總苷 的提取方法為將女貞子藥材粉碎用12倍量的50%乙醇，加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合 并提取液加壓干燥即得。
[0013] 在本發(fā)明中，松質(zhì)骨可以是自體移植物、同種異體移植物或異種移植物。作為非限 制性的實(shí)例，如果支架是異種移植物，其可以來自綿羊、豬或牛的骨。松質(zhì)骨可以取自任何 部位，其中可以利用所需的大小。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，松質(zhì)骨是椎骨松質(zhì)骨。在從 骨中獲得后，將骨髓從松質(zhì)骨中去除。隨后可以使松質(zhì)骨部分成形?？蛇x地，可以在去除骨 髓前，使松質(zhì)骨成形?？梢允顾少|(zhì)骨部分形成支架所需的任何形狀。應(yīng)當(dāng)理解，支架的形狀 取決于應(yīng)用以及體內(nèi)放置支架的位置。支架形狀的非限定性實(shí)例是薄片、矩形塊、圓柱體、 犬骨形或平行六面體。盡管這些形狀作為實(shí)例給出，但設(shè)計(jì)所需的任何形狀的支架而無需 不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)，完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。支架的尺寸也可以根據(jù)支架的所需 用途而變化。在說明性的實(shí)施方案中，支架的厚度可以為約0. Im至約15mm，或約0. 5mm至 約10_，盡管如有需要，其可以更小或更大。例如，如果支架用于修復(fù)踝關(guān)節(jié)，則支架可以小 于0.55_?？蛇x地，如果支架用于修復(fù)膝關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)軟骨缺損，則支架的尺寸可以更大。
[0014] 應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的松質(zhì)骨支架可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行定型，用于多種應(yīng)用。例如，本發(fā) 明的松質(zhì)骨支架可以應(yīng)用于手、肘、膝、足、踝或所需的任何其他解剖學(xué)位置中的韌帶、腱、 軟骨或生長板的修復(fù)。此外，本發(fā)明的支架可以應(yīng)用于替代或修復(fù)多種關(guān)節(jié)中的任何關(guān)節(jié)。 本領(lǐng)域已知的用于關(guān)節(jié)替代的方法和植入物的形狀，可以根據(jù)本發(fā)明公開的植入物進(jìn)行定 型并由本發(fā)明的植入物置換。
[0015] 所述松質(zhì)骨支架還可以包括細(xì)胞，可以添加的細(xì)胞的非限定性實(shí)例是成纖維細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或其混合物。在另一個(gè)可選的實(shí)例中，松質(zhì)骨支架還可以包含成體 干細(xì)胞。成體干細(xì)胞的非限定性實(shí)例是骨髓干細(xì)胞和脂肪衍生的干細(xì)胞。所述松質(zhì)骨支架 添加脂肪干細(xì)胞的方法為：
[0016] 將采用上述方法制備的松質(zhì)骨支架材料浸入脂肪干細(xì)胞的混懸物中，反復(fù)交替吸 取支架材料上的細(xì)胞混懸物，以確保接種均勻，然后成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3周，使骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞，形成含成骨細(xì)胞的細(xì)胞-支架材料復(fù)合物，植入體內(nèi)便為由 脂肪干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨。所述成骨誘導(dǎo)液包括低糖〇1^1，10%胎牛血清，10〇1^/1111 鏈霉素，l〇〇U/ml青霉素 ，β -甘油磷酸鈉10mmol/L，地塞米松10nmol/L，維生素 C 50mg/L。
[0017] 本發(fā)明采用物理化學(xué)結(jié)合（超聲結(jié)合凍干）的方法較好的解決了松質(zhì)骨支架的去 抗原問題，尤其是超聲處理，通過超聲溶液與超聲條件的配合最大限度的減少了抗原的存 在，并且使去抗原的松質(zhì)骨支架具備較好的力學(xué)性能。另外，在松質(zhì)骨支架外面包被了含有 營養(yǎng)成分的水凝膠材料，使松質(zhì)骨支架在體內(nèi)可以較好的捕獲種子細(xì)胞，尤其是脂肪干細(xì) 胞，并提供了適合的營養(yǎng)成分適合細(xì)胞向成骨和成血管方向分化，加工制作科學(xué)合理、簡便 易行。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1 :松質(zhì)骨材料的掃描電鏡圖；
[0019] 圖2 :C/GP/Co修飾的去抗原松質(zhì)骨掃描電鏡圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面將結(jié)合附圖以及進(jìn)一步的詳細(xì)說明來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下 說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。 本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0021] 在本發(fā)明中，除特殊說明外，" ％ "代表重量百分比。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 步驟1 :剔除豬骨表面的骨膜、附著組織，并用雙蒸水漂洗干凈；分割成小骨塊，然 后在雙蒸水中攪拌浸泡7h，得到無血色的骨塊（6mmX6mmX 6mm) 10顆；骨塊撈出浙干后，置 入25°C恒溫?fù)u床中，用1:1氯仿/甲醇IOml浸泡12h進(jìn)行脫脂，然后用雙蒸水反復(fù)清洗3 次，10-15min/次；隨后將骨塊放入含有0. 1 %的胰酶、0. 2 %的烷基糖苷和0. 1 %的聚乙二 醇的PBS溶液中進(jìn)行超聲，pH為7. 4,超聲條件為：超聲頻率25kHz，超聲功率為50W，超聲時(shí) 間5min，超聲兩次；然后用雙蒸水反復(fù)清洗3次，10-15min/次；制備成如圖1所示的去抗原 松質(zhì)骨支架；
[0024] 步驟2 :殼聚糖-β -甘油磷酸鈉-膠原溶液表面修飾的去抗原松質(zhì)骨支架的制 備：
[0025] 制備殼聚糖-甘油磷酸鈉-膠原溶液（C/GP/Co);溶液組成為15mg/ml的殼 聚糖，30mg/ml 的 β -甘油磷酸鈉，35mg/ml 的膠原，0· 5ng/ml 的 BMP-2,35ng/ml 的 bFGF 和 50mg/ml的女貞子總苷，pH為7. 4 ;將步驟1制備的去抗原松質(zhì)骨支架浸入C/GP/Co溶液中， 在37°C水浴中放置15min，去離子水清洗后冷凍干燥，得到C/GP/Co修飾的去抗原松質(zhì)骨支 架，如圖2所示。
[0026] 所述烷基糖苷為巴斯夫公司生產(chǎn)的Glucopon 225 DK。
[0027] 實(shí)施例2
[0028] 不同超聲條件下松質(zhì)骨支架的性能檢測(cè)
[0029] 除下表參數(shù)外其它支架材料制備方法同實(shí)施例1
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種骨支架復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，具體步驟如下： a) 去抗原松質(zhì)骨的制備： 剔除原料骨表面的骨膜、附著組織，并用雙蒸水漂洗干凈；分割成小骨塊，然后在雙蒸 水中攪拌浸泡7h，得到無血色的骨塊；骨塊撈出浙干后，置入25°C恒溫?fù)u床中，用1:1氯仿 /甲醇浸泡12h進(jìn)行脫脂，然后再用雙蒸水反復(fù)清洗3次，10-15min/次；制備成去抗原松質(zhì) 骨支架； b) 殼聚糖-甘油磷酸鈉-膠原溶液表面修飾的去抗原松質(zhì)骨支架的制備： 制備殼聚糖-￠-甘油磷酸鈉-膠原溶液（C/GP/Co);將a)制備的去抗原松質(zhì)骨支架浸 入C/GP/Co溶液中，在37°C水浴中放置15min，去離子水清洗后冷凍干燥，得到C/GP/Co修 飾的去抗原松質(zhì)骨支架。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨支架復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，在步驟a) 中，在脫脂清洗處理后，還進(jìn)行超聲清洗脫細(xì)胞處理，具體處理方法為：將骨塊放入含有 0. 05?0. 2 %的胰酶、0. 1?0. 3%的烷基糖苷和0. 1 %的聚乙二醇的PBS溶液中進(jìn)行超聲， pH為7. 4,超聲條件為：超聲頻率25kHz，超聲功率為50W，超聲時(shí)間5min，超聲兩次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨支架復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，在步驟b)中， 所述C/GP/Co溶液中，殼聚糖的濃度約為15mg/ml，0 -甘油磷酸鈉的濃度約為30mg/ml，膠 原的濃度約為35mg/ml，pH為7. 4。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種骨支架復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述C/GP/Co 溶液中還包含0. 5ng/ml的BMP_2,35ng/ml的bFGF和50mg/ml的女貞子總苷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨支架復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述原料骨 為豬骨。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK104353112SQ201410513528
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】張靜瑩 申請(qǐng)人:大連大學(xué)