竹節(jié)香附素a在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及竹節(jié)香附素A的一種新用途，即，制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：首次發(fā)現(xiàn)竹節(jié)香附素A具有抗血管生成活性，可作為血管生成抑制劑使用，能夠應(yīng)用于抑制血管生成藥物的制備以治療腫瘤、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、眼科疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等新生血管依賴性和新生血管相關(guān)性疾病。
【專利說明】竹節(jié)香附素A在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是竹節(jié)香附素A在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]血管生成(ang1genesis)指新生血管通過重塑和擴(kuò)展形成各級(jí)成熟血管的過程。往往從已存在的成熟組織中發(fā)芽生長(zhǎng)出新的血管，或從龐大的血管系統(tǒng)中分裂出較小的子代血管。血管生成在胚胎發(fā)育、生殖、創(chuàng)傷修復(fù)以及女性的生理周期等機(jī)體正常生理過程中發(fā)揮著重要作用。
[0003]血管生成是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的多種分子的復(fù)雜過程。目前，抑制血管生成分子和促進(jìn)血管生成分子間的動(dòng)態(tài)平衡被認(rèn)為是調(diào)控血管生成的“開關(guān)”。正常的生理?xiàng)l件下，兩者處于平衡，血管生成機(jī)制關(guān)閉；而當(dāng)二者的平衡被破壞時(shí)，血管生成機(jī)制被關(guān)閉，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展。一些疾病如各種原因引起的腫瘤、眼部新血管形成、關(guān)節(jié)炎、皮膚疾患等疾病的發(fā)生與發(fā)展，都與血管生成有關(guān)。
[0004]惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。研究表明，實(shí)體腫瘤需要功能性的血管系統(tǒng)以運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)成分，并排出細(xì)胞代謝的相關(guān)廢物。腫瘤中這種血管系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的形成至少部分依賴于已經(jīng)存在的宿主血管，但最終腫瘤的擴(kuò)張依賴于新生血管的形成。腫瘤抗血管生成治療被認(rèn)為是治療惡性腫瘤具有重大醫(yī)學(xué)價(jià)值的策略之一。
[0005]竹節(jié)香附素A (Raddeanin A)是一種植物阜苷,來自于毛茛科(Ranunculaceae)多被銀蓮花(Anemone raddeana Regel)的根莖。研究表明，竹節(jié)香附素A具有抗腫瘤作用，它能夠抑制人肝癌細(xì)胞H印G-2的增殖，對(duì)S180、H22和U14細(xì)胞小鼠移植瘤也有抑制作用。目前還沒有竹節(jié)香附素A抑制新生血管形成并作為血管形成抑制劑使用的報(bào)道。
[0006]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN100577180C公開了一種藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。該發(fā)明提供了藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，特別是在制備抑制腫瘤、關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病、血管瘤、銀屑病等疾病的病變組織血管生成的藥物中的應(yīng)用。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1511531A公開了高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿在抑制血管生成中的應(yīng)用。該發(fā)明公開了高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿在抑制血管生成中的新用途，研究表明，高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿具有抑制血管生成的作用，同時(shí)具有特異性、劑量小、療效高、副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102058579A公開了去氫木香內(nèi)酯在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。該發(fā)明公開了去氫木香內(nèi)酯在抑制血管生成中的新用途。但是關(guān)于竹節(jié)香附素A在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用目前還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供竹節(jié)香附素A的一種新用途。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:竹節(jié)香附素A在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。
[0009]所述的血管生成為腫瘤血管新生，所述的腫瘤為實(shí)體腫瘤，所述的實(shí)體腫瘤為原發(fā)性或繼發(fā)性實(shí)體腫瘤。
[0010]所述的腫瘤血管新生為腫瘤病變組織的血管新生或腫瘤導(dǎo)致的血管新生。
[0011]所述的腫瘤血管新生為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌癥的血管新生。
[0012]所述的血管生成為銀屑病病變組織血管新生、Paget’ s疾病血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生、動(dòng)脈粥樣硬化病變處的血管新生或新生血管性眼病的血管生成，所述的新生血管性眼病為原發(fā)性或繼發(fā)性新生血管性眼病。
[0013]竹節(jié)香附素A作為單一成分或與其它藥學(xué)上可接受的成分構(gòu)成組合物在制備抑制血管生成的藥物中的應(yīng)用，所述的其它藥學(xué)上可接受的成分是與竹節(jié)香附素A沒有拮抗作用的藥物，或藥學(xué)上允許的一種或多種輔料。
[0014]所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、微囊制劑、注射劑、栓劑、噴霧劑或軟膏劑。
[0015]所述的藥物的給藥方式為注射、口服、吸入式噴霧或透皮給藥。
[0016]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明提供了竹節(jié)香附素A的一種新的用途。首次發(fā)現(xiàn)竹節(jié)香附素A的抗血管生成作用，首次發(fā)現(xiàn)竹節(jié)香附素可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移和小管形成，減少雞胚絨毛尿囊膜中的血管生成，降低斑馬魚軀干部節(jié)間血管完整性，并顯著抑制荷人結(jié)直腸小鼠腫瘤的血管生成從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。竹節(jié)香附素A通過氫鍵和疏水作用力與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, VEGFR2)的ATP激酶位點(diǎn)結(jié)合，從而有效抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)誘導(dǎo)的VEGFR2及其下游信號(hào)分子的磷酸化，可作為血管生成抑制劑使用，能夠應(yīng)用于抑制血管生成藥物的制備以治療腫瘤、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、眼科疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等新生血管依賴性和新生血管相關(guān)性疾病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]附圖1:竹節(jié)香附素A在不影響腫瘤細(xì)胞HCT-15活力的情況下抑制HUVEC的增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移和小管生成。(A)竹節(jié)香附素A抑制HUVEC增殖且在相同濃度下不影響HCT-15細(xì)胞活力。(B)竹節(jié)香附素A抑制HUVEC運(yùn)動(dòng)。(C)竹節(jié)香附素A抑制HUVEC水平遷移。(D)竹節(jié)香附素A抑制HUVEC垂直遷移。(E)竹節(jié)香附素A抑制HUVEC小管形成。
[0018]附圖2:竹節(jié)香附素A抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成。
[0019]附圖3:竹節(jié)香附素A抑制斑馬魚軀干部位節(jié)間血管形成。
[0020]附圖4:竹節(jié)香附素A通過抗血管生成作用抑制HCT-15荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)。(A)治療組和對(duì)照組荷瘤小鼠及腫瘤代表性照片。(B)腫瘤重量統(tǒng)計(jì)。(C)小鼠腫瘤體積監(jiān)測(cè)。(D)腫瘤組織免疫組化染色⑶31 (微血管密度)。(E) H&E染色(腫瘤壞死)。
[0021]附圖5:竹節(jié)香附素A抑制VEGFR2及其下游信號(hào)分子磷酸化。(A)竹節(jié)香附素A抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞內(nèi)VEGFR2及其下游信號(hào)分子磷酸化，包括:PLC Y 1、JAK2、FAK、Src和Akt。(B)分子對(duì)接技術(shù)推測(cè)竹節(jié)香附素A與VEGFR2結(jié)合模式3D圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0023]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，所用的試劑均可以在市場(chǎng)上購買。
[0024]實(shí)施例1竹節(jié)香附素A抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖實(shí)驗(yàn)
目的和原理:采用CCK-8法檢測(cè)HUVEC的增殖。CCK-8試劑中含有WST - 8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4- 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-Methoxy PMS (1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(Formazan)。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。通過該方法可評(píng)價(jià)藥物對(duì)HUVCE增殖的影響。
[0025]方法:HUVEC和HCT-15細(xì)胞分別接種于96孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合后，將竹節(jié)香附素A以以下濃度0.1,0.3、1、3、10 μ M加入孔中(未加竹節(jié)香附素A的組為對(duì)照)，作用48 h后每孔加與孔內(nèi)體積比為1:10體積的CCK-8溶液，置于37 1:培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，用可調(diào)波長(zhǎng)式微孔酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)OD值。未加竹節(jié)香附素A的組為對(duì)照。以細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但不含細(xì)胞的孔做為空白對(duì)照。按如下公式計(jì)算細(xì)胞活力:
細(xì)胞活力(％) =(0D_tMl-0Dblank)/ (ODcontrol-ODsample) X 100%
結(jié)果與結(jié)論:如圖1A所示，竹節(jié)香附素A對(duì)HUVEC的細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。竹節(jié)香附素A的濃度為f 10 μ M對(duì)HUVEC的增殖具有顯著抑制作用且HCT-15細(xì)胞活力未受影響。
[0026]***:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O PM)比具有極顯著性差異0° <0.001)
實(shí)施例2竹節(jié)香附素A抑制HUVEC運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)
目的和原理:采用Cellomics Cell Motility試劑盒,該試劑盒通過在96孔板內(nèi)鋪上一層藍(lán)色突光微球，使細(xì)胞在其上運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間后，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)會(huì)將表面的突光顆粒吞曬或推開，會(huì)留下沒有熒光的運(yùn)動(dòng)估計(jì)區(qū)域，該區(qū)域面積與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色后，直接測(cè)量細(xì)胞在孔板底部因運(yùn)動(dòng)留下的痕跡，從而得到細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡。
[0027]方法:在膠原I包被的96孔板內(nèi)，加入藍(lán)色熒光微球溶液，避光孵育I h。用WashBuffer洗滌5遍后，加入含有不同濃度竹節(jié)香附素A的HUVEC細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為5 X 12/ml)，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。未加竹節(jié)香附素A的組為對(duì)照。20 h后，每孔加入200 μ I預(yù)熱的5.5%固定液固定I h，洗3遍后依次加入透化液和若丹明-鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞骨架。清洗3遍后加200 μ I Wash Buffer，在高通量篩選分析儀上進(jìn)行分析(若丹明，Ex: 542 nm, Em: 565 nm ;藍(lán)色突光微球，Ex: 365 nm, Em: 415 nm)。
[0028]結(jié)果與結(jié)論:如圖1B所示竹節(jié)香附素A可有效抑制HUVEC運(yùn)動(dòng)，且竹節(jié)香附素濃度為3 μ M時(shí)即完全抑制HUVEC運(yùn)動(dòng)。
[0029]***:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O PM)比具有極顯著性差異(P <0.001)
實(shí)施例3竹節(jié)香附素A抑制HUVEC水平遷移形成實(shí)驗(yàn)
目的與原理:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種操作簡(jiǎn)易，且價(jià)格低廉的研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)方法，通過在融合的單層細(xì)胞上人為造成一道空白區(qū)域，稱為劃痕。劃痕邊緣細(xì)胞逐漸遷移進(jìn)入空白區(qū)域“愈合”該劃痕。
[0030]方法:將HUVEC細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)，生長(zhǎng)至80%融合。用槍頭在每孔中間位置輕輕劃一道痕。加入含不同濃度竹節(jié)香附素A的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。在顯微鏡下拍照觀察HUVEC遷移情況。
[0031]結(jié)果與結(jié)論:如圖1C所示，竹節(jié)香附素A在0.3-10 μ M范圍內(nèi)可顯著抑制HUVEC的水平遷移。
[0032]***:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O PM)比具有極顯著性差異(P <0.001)
實(shí)施例4竹節(jié)香附素A抑制HUVEC遷移實(shí)驗(yàn)
目的和原理:Transwell實(shí)驗(yàn)技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)的主要材料是Transwell小室(Transwellchamber ),小室的底層有一層通透性的膜(一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane))，這層膜帶有孔徑大小0.1 一 12.0Mm的微孔，實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞置于小室上，在小室下含有的趨化因子或生長(zhǎng)因子的作用下，細(xì)胞透過聚碳酸酯膜，從而進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。
[0033]方法:下室加入600 μ?含有20 ng/ml的VEGF165的HUVEC培養(yǎng)液。上室中加入含有不同竹節(jié)香附素A濃度的HUVEC細(xì)胞(細(xì)胞密度為2 X 105/ml )，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。未加竹節(jié)香附素A的組為對(duì)照。8 h后，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，棄去孔中培養(yǎng)液，力口入600 μ? 1%戊二醛常溫固定15 min，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后加入200μ? 0.1%結(jié)晶紫染色，最后用PBS漂凈多余的結(jié)晶紫染料。在正置顯微鏡(Olympus)下觀察拍照。
[0034]結(jié)果與結(jié)論:遷移后的細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后顯紫紅色。由圖1D所示，與對(duì)照組相t匕，竹節(jié)香附素A的濃度在0.1-10 μ M范圍內(nèi)，HUVEC的遷移能力被顯著抑制。
[0035]***:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O PM)比具有極顯著性差異0° <0.001)
實(shí)施例5竹節(jié)香附素A抑制HUVEC小管形成實(shí)驗(yàn)
目的和原理:人工基膜Matrigel膠是從小鼠HlS肉瘤提取的基膜成分，在37°C下可自發(fā)形成凝膠狀的人工基膜，具有天然基膜的生物學(xué)作用。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可以在Matrigel膠上粘附成管，從而可用于研究藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管作用的影響。
[0036]方法:取50 μ I Matrigel膠溶液加入到預(yù)冷的96孔培養(yǎng)板中，然后放置于37°C培養(yǎng)箱孵育I h，使膠固化。將含有不同竹節(jié)香附素A濃度的HUVEC細(xì)胞(細(xì)胞密度為lXlOVml)分別加入鋪有Matrigel的96孔板中，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。未加竹節(jié)香附素A的組為對(duì)照。10 h后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察血管形成。
[0037]結(jié)果與結(jié)論:HUVEC可在matrigel上延伸生長(zhǎng)呈管狀并相互連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由圖1E所示，與對(duì)照組相比，竹節(jié)香附素A的濃度在0.3-10 μΜ范圍內(nèi)，HUVEC細(xì)胞小管形成能力被顯著抑制，且10 μ M時(shí)，HUVEC細(xì)胞散在存在，未見小管形成，HUVEC的小管形成能力被完全抑制。
[0038]*:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O μ Μ)比具有顯著性差異(P < 0.05) ***:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O μ Μ)比具有極顯著性差異(P < 0.001) 實(shí)施例6竹節(jié)香附素A抑制雞胚絨毛尿囊膜上血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮?雞胚絨毛尿囊膜(CAM)具有豐富的血管網(wǎng)，對(duì)于刺激或抑制血管生成的藥物敏感，是較為理想的研究抗血管生成藥物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> [0039]方法:將受精蛋置于溫度為38° C相對(duì)濕度為65-70%的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6天后，在雞蛋氣室上方開一個(gè)直徑為2 cm左右的窗口，揭去蛋殼和外膜,暴露CAM。將含有不同濃度竹節(jié)香附素A的醋酸纖維素膜(藥物載體，直徑6 mm)輕輕放置于CAM表面合適位置。以不加藥的生理鹽水組作為對(duì)照。用無菌封口膜封好氣室上方開口，將雞蛋繼續(xù)孵育48 h后，暴露CAM進(jìn)行觀察拍照，計(jì)算新生血管數(shù)量。
[0040]結(jié)果:由圖2所示竹節(jié)香附素A濃度為0.3-10 μ M范圍內(nèi)，與對(duì)照組相比能顯著抑制CAM的血管新生。
[0041]***:與對(duì)照組相(竹節(jié)香附素A的濃度為O PM)比具有極顯著性差異(P <
0.001)
實(shí)施例7竹節(jié)香附素A抑制斑馬魚軀干部位血管生成實(shí)驗(yàn)
目的和原理:斑馬魚是今年來抗血管生成藥物篩選的熱點(diǎn)模型。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚基因組與人類基因組同源性高達(dá)87%。相比細(xì)胞模型而言，該模型可在非毒性濃度下篩選抗血管生成藥物。本研究采用了轉(zhuǎn)染了 EGFP的斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其在血管形成過程中特異性表達(dá)綠色熒光，通過共聚焦顯微鏡，能更直觀、清晰地觀察到藥物對(duì)于斑馬魚血管生成的影響。
[0042]方法:將18 hpf的斑馬魚胚胎培養(yǎng)于12孔板內(nèi)，每孔30條。每孔加入濃度為0.4μΜ竹節(jié)香附素A，采用5 μ M ΡΤΚ787 (VEGFR拮抗劑)作為陽性對(duì)照，以不含竹節(jié)香附素A的載體作為陰性對(duì)照。孵育30 h后采用0.016 %三卡因甲基磺酸鹽麻醉斑馬魚，在共聚焦顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)每條斑馬魚完整的節(jié)間血管數(shù)(ISVs)。
[0043]抑制率(%) = (1-實(shí)驗(yàn)組斑馬魚ISV數(shù)量/對(duì)照組斑馬魚ISV數(shù)量)X 100 結(jié)果與結(jié)論:由圖3所示，陰性對(duì)照組全部斑馬魚所有ISV均完整，而陽性對(duì)照組斑馬魚ISV形成被完全抑制。竹節(jié)香附素A組的斑馬魚ISV形成有67.6 %被抑制。說明竹節(jié)香附素A能有效抑制斑馬魚節(jié)間血管形成。
[0044]實(shí)施例8竹節(jié)香附素A抗血管生成抑制荷HCT-15人結(jié)直腸癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮?通過觀察荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況，以及對(duì)腫瘤組織的組化和免疫組化分析(CD31:微血管密度，TUNEL:細(xì)胞凋亡，H&E染色:腫瘤壞死面積)，考察藥物對(duì)于荷瘤小鼠的抗血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)的療效。
[0045]方法:將HCT-15細(xì)胞(I X 16 /只)皮下接種于5周齡的雌性BALB/c裸鼠右側(cè)腋下。待腫瘤長(zhǎng)至100 mm3大小后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只。每隔一天分別給予竹節(jié)香附素A 5 mg/kg/和生理鹽水的治療。每天記錄小鼠體重和腫瘤體積。計(jì)算公式:腫瘤體積(mm3)=(長(zhǎng)X寬X寬)/2。治療后第22天，將小鼠斷頸處死后取下腫瘤組織稱重，將組織石蠟包埋，進(jìn)行組化和免疫組化染色。腫瘤血管采用CD31抗體標(biāo)記，H&E染色用于腫瘤壞死面積分析。將切片置于顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD)，腫瘤細(xì)胞增殖陽性率和腫瘤壞死面積。
[0046]結(jié)果與結(jié)論:如圖4A-C所示，竹節(jié)香附素A有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，治療組小鼠平均腫瘤體積為765.3 土 156.6 mm3,瘤重為1.16 土 0.33 g，顯著小于對(duì)照組(體積:1919.0 土670.6 mm3,瘤重:2.17 土 0.52 g)。免疫組化分析表明,竹節(jié)香附素A能顯著抑制腫瘤微血管密度(圖4D)，從而增加腫瘤壞死面積(圖4E)，表明竹節(jié)香附素A能通過抗血管生成發(fā)揮抗腫瘤活性。
[0047]實(shí)施例9竹節(jié)香附素A抑制HUVEC內(nèi)VEGF刺激的VEGFR2及其下游分子激活實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮?在腫瘤血管新生過程中，VEGF通過與其表面受體VEGFR結(jié)合，在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成中發(fā)揮重要作用。涉及到新生血管形成VEGF通路主要是由VEGFR2介導(dǎo)的，且VEGFR2的激活可激活其下游的多種信號(hào)分子。本研究采用了免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)方法考察藥物對(duì)于VEGF刺激引起的HUVEC內(nèi)VEGFR2及其下游通路的影響。Western Blot法原理是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，以抗體作為探針，采用標(biāo)記的二抗顯色。通過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的蛋白生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影從而檢測(cè)電泳分離的特異性目的蛋白。
[0048]方法:將HUVEC細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(I X 15 /孔)，置于37 °C培養(yǎng)箱孵育24 h。采用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)6 h后，加入不同濃度的竹節(jié)香附素A (0.1-10 μΜ)孵育30min，并以不加藥物的孔作為對(duì)照，隨后加入100 ng/mL VEGF刺激4 min,以不加VEGF刺激的孔作為陰性對(duì)照。使用加入PMSF和磷酸化抑制劑的RIPA裂解液對(duì)HUVEC細(xì)胞進(jìn)行裂解。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，每份樣本取40 μ g蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性，于8%-10%丙烯酰胺凝膠上樣。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，用5%BSA封閉后加入不同的磷酸化和非磷酸化VEGFR2及其下游信號(hào)分子一抗孵育過夜，采用羊抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育I h。將膜置于Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)，在膜表面均勻滴加顯影液，曝光30 sec,得到條帶。
[0049]結(jié)果與結(jié)論:由圖5A所示，竹節(jié)香附素A能劑量依賴性地抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC內(nèi)的VEGFR2及其下游信號(hào)分子:PLC Y 1，JAK2，F(xiàn)AK, Src和Akt的磷酸化。
[0050]實(shí)施例10竹節(jié)香附素A與VEGFR2分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)
目的和原理:本研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)香附素A可顯著抑制VEGFR2及其下游信號(hào)通路的磷酸化，因此希望通過分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步推測(cè)竹節(jié)香附素A與VEGFR2間的相互作用模式。分子對(duì)接是將已知三維結(jié)構(gòu)的分子放在靶分子的活性位點(diǎn)處，通過不斷優(yōu)化受體和化合物的位置、構(gòu)象和受體的氨基酸殘基側(cè)鏈和骨架等，尋找兩者之間作用的最佳構(gòu)象，推測(cè)其結(jié)合模式和親和力等的一種理論模擬分子間作用的方法。
[0051]方法:采用分子操作環(huán)境(MOE)對(duì)接竹節(jié)香附素A分子和VEGFR2。從蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中得到VEGFR2的X射線晶體構(gòu)型，采用MOE生成竹節(jié)香附素A三維結(jié)構(gòu)，采用Site Finder模塊得到VEGFR2激酶位點(diǎn)的潛在結(jié)合域。將竹節(jié)香附素A與潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，采用PyMOL軟件分析兩者的相互作用。
[0052]結(jié)果與結(jié)論:由圖5B所示竹節(jié)香附素A結(jié)合在VEGFR2 ATP激酶位點(diǎn)的疏水口袋中，通過疏水鍵和氫鍵發(fā)生相互作用。
[0053]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.竹節(jié)香附素A在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的血管生成為腫瘤血管新生，所述的腫瘤為實(shí)體腫瘤，所述的實(shí)體腫瘤為原發(fā)性或繼發(fā)性實(shí)體腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤血管新生為腫瘤病變組織的血管新生或腫瘤導(dǎo)致的血管新生。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤血管新生為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌癥的血管新生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的血管生成為銀屑病病變組織血管新生、Paget’ s疾病血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生、動(dòng)脈粥樣硬化病變處的血管新生或新生血管性眼病的血管生成，所述的新生血管性眼病為原發(fā)性或繼發(fā)性新生血管性眼病。
6.竹節(jié)香附素A作為單一成分或與其它藥學(xué)上可接受的成分構(gòu)成組合物在制備抑制血管生成的藥物中的應(yīng)用，所述的其它藥學(xué)上可接受的成分是與竹節(jié)香附素A沒有拮抗作用的藥物，或藥學(xué)上允許的一種或多種輔料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、微囊制劑、注射劑、栓劑、噴霧劑或軟膏劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物的給藥方式為注射、口月艮、吸入式噴霧或透皮給藥。
【文檔編號(hào)】A61P17/06GK104161766SQ201410415570
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】方超, 陳紅專, 管瀅蕓, 趙梅, 欒鑫, 陸琴, 徐見容, 劉亞蓉, 高云鴿, 劉海軍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院