多價腦膜炎球菌衍生的多糖-蛋白質(zhì)綴合物及疫苗本申請是申請日為2004年5月7日的、發(fā)明名稱為“多價腦膜炎球菌衍生的多糖-蛋白質(zhì)綴合物及疫苗”的中國專利申請200480019306.6(PCT/US2004/014466)的分案申請。本申請要求2003年5月7日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/468,581的優(yōu)先權(quán)，其在文中全部公開引用作為參考。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來說涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且更具體的涉及到微生物學(xué)、免疫學(xué)、疫苗以及通過免疫對細菌病原體感染的預(yù)防。2.相關(guān)領(lǐng)域概述腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)是全球細菌性腦膜炎和膿毒癥的主要原因。在最近的30年中，地方性腦膜炎球菌疾病的發(fā)生率在發(fā)達國家為每100,000人中有1到5人，而在發(fā)展中國家為每100,000人中有10到25人(Reido,F.X.等，(1995)Ped.Infect.Dis.J.14,643-657頁)。流行期間腦膜炎球菌疾病的發(fā)病率可達每1000,000人中有1,000人。在美國，每年大約有2,600例細菌性腦膜炎病例，而在發(fā)展中國家平均有330,000例。病例致死率在10到20％之間。病原腦膜炎球菌被附著在生物體外膜表面的多糖莢膜所包被?；谇v膜多糖的免疫學(xué)特異性，已經(jīng)鑒定出13種不同的腦膜炎球菌血清群(Frasch,C.E.等，(1985)Rev.Infect.Dis.7,504-510頁)。在這13個血清群當中有5個引起了大多數(shù)的腦膜炎球菌疾??；它們包括血清群A、B、C、W135和Y。血清群A引起大部分流行性疾病。血清群B、C和Y引起大多數(shù)的地方病和疾病的區(qū)域性爆發(fā)。人類鼻-口咽粘膜是唯一已知的腦膜炎奈瑟氏球菌的天然貯庫。細菌在粘膜細胞的外表面以及鼻咽的皮下組織定居。腦膜炎球菌可被持續(xù)攜帶幾個月。腦膜炎球菌通過直接接觸或通過空氣飛沫傳播。腦膜炎球菌是以吞噬泡的形式通過胞吞作用經(jīng)由粘膜上皮侵入的。對入侵的腦膜炎球菌的宿主防御依賴于補體介導(dǎo)的溶菌作用。在補體介導(dǎo)的溶菌作用中發(fā)揮作用的血清抗體相當大部分直接針對外部莢膜多糖。已經(jīng)描述了基于腦膜炎球菌多糖的疫苗，其引起針對莢膜多糖的免疫應(yīng)答。這些抗體可以對血清群特異性腦膜炎球菌引起補體介導(dǎo)的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗顯示對兒童和成人有效(Peltola,H.等，(1997)NewEngl.J.Med297,686-691頁和Artenstein,M.S.等，(1970)NewEngl.J.Med.282,417-420頁)，但對嬰兒和幼兒期效能有限(Reingold,A.L.等，(1985)Lancet2,14-118頁)。對年幼群體，此多糖的后繼給藥產(chǎn)生弱加強應(yīng)答或無加強應(yīng)答(Goldschneider,I.等，(1973)J.Infect.Diseases128,769-776頁和Gold,R.等，(1977)J.Infect.Diseases.136,S31-S35頁)。腦膜炎球菌多糖疫苗的保護期不能持續(xù)很長，并且據(jù)估計對成人和大于4歲的兒童而言為3到5年(Brandt,B.L.和Artenstein,M.S.(1975)J.Infect.Diseases.131,S69-S72頁；Kyhty,H.等，(1980)J.Infect.Diseases.142,861-868頁,和Cessey,S.J.等，(1993)J.Infect.Diseases.167,1212-1216頁)。對1到4歲的兒童而言保護期少于3年(Reingold,A.L.等，(1985)Lancet2,114-118頁)。多糖不能與主要組織相容性復(fù)合體分子結(jié)合，而這是抗原呈遞和刺激T-輔助淋巴細胞的前提條件，即它們是非T-細胞依賴性抗原。多糖能夠不需要T-輔助淋巴細胞的輔助而刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。由于對B淋巴細胞的非T-細胞依賴性刺激，這些抗原免疫后缺乏記憶誘導(dǎo)。在成人體內(nèi)，多糖抗原可以產(chǎn)生非常有效的非T-細胞依賴性應(yīng)答，但在嬰兒和幼兒的不成熟免疫系統(tǒng)中這些非T-細胞依賴性應(yīng)答卻很弱。非T-細胞依賴性多糖抗原可以通過將多糖共價綴合至蛋白質(zhì)分子(“載體”或“載體蛋白質(zhì)”)上而轉(zhuǎn)變?yōu)門-細胞依賴性抗原。與綴合疫苗的多糖組分結(jié)合的B細胞可以被肽特異的T輔助細胞激活，所述肽為綴合的載體蛋白質(zhì)的一部分。對載體蛋白質(zhì)的T-輔助細胞應(yīng)答可以增加針對多糖的抗體的產(chǎn)生。已經(jīng)證明，血清群B多糖在人群中具有極弱的免疫原性至無免疫原性(Wyle,F.A.等，(1972)J.Infect.Diseases.126,514-522頁)。這一血清群多糖與蛋白質(zhì)的化學(xué)綴合在實驗動物中沒有顯著改變免疫應(yīng)答(Jennings,H.J.和Lugowski,C.(1981)J.Immunol.127,1011-1018頁)。據(jù)認為對這一血清群多糖缺乏免疫應(yīng)答的原因是：血清群B多糖與多唾液酸化的宿主糖蛋白如神經(jīng)細胞粘附分子之間的結(jié)構(gòu)相似性。一種基于血清群C多糖的腦膜炎球菌綴合疫苗已有敘述。這種單價疫苗可引起針對相應(yīng)于血清群C的腦膜炎奈瑟氏球菌株系上存在的莢膜多糖的強功能抗體應(yīng)答。這種疫苗僅僅能夠預(yù)防由血清群C細菌引起的疾病。現(xiàn)有的基于腦膜炎球菌多糖的疫苗對幼兒的用途有限，而且不能為成人提供長時間保護。已被證實能夠?qū)λ杏形ｋU感染腦膜炎球菌的群體(包括兒童)產(chǎn)生長時間保護的唯一腦膜炎球菌疫苗是基于腦膜炎奈瑟氏球菌單一血清群的多糖，其不能提供針對其它血清群感染的保護。因此，就需要一種能夠在腦膜炎球菌感染的易感兒童和成人中對腦膜炎球菌疾病產(chǎn)生廣譜、長效保護的腦膜炎球菌綴合疫苗。本發(fā)明的多價腦膜炎球菌多糖通過提供疫苗制劑解決了這一需要，其中在所述制劑中來源于腦膜炎奈瑟氏球菌主要致病血清群的免疫原性多糖通過與載體蛋白質(zhì)綴合而轉(zhuǎn)變成T-細胞依賴性抗原。美國食品藥品管理局(FDA)頒發(fā)的腦膜炎球菌多糖疫苗許可證是基于使用幼兔補體的殺菌力試驗方法(SBA-BR)，該方法是通過用所許可疫苗免疫后的血液樣品進行的。許多政府和專家小組公布了在此類試驗方法中評價腦膜炎球菌多糖疫苗的目前規(guī)程和推薦意見，例如：世界衛(wèi)生組織生物制品標準化專家委員會(WHOExpertCommitteeonBiologicalStandardization)指出：用針對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的腦膜炎球菌疫苗免疫健康成年受試者可誘導(dǎo)產(chǎn)生殺菌抗體(WHO1976)；國際比較研究中的CDCSB-BR建立了用于使用標準參考品血清即CDC供體R21654-3430107測定法的標準化參數(shù)，所述血清是比較研究中質(zhì)量控制血清樣品之一(MaslankaSE等,1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4:156-167)；和世界衛(wèi)生組織疫苗和生物制品開發(fā)專家委員會(WHOExpertCommitteeoftheDepartmentofVaccinesandBiologicals)推薦的標準化CDC方法作為最佳方法(WHO1999)。由于已經(jīng)證明人類對腦膜炎球菌疾病的免疫性與血清殺菌力試驗(SBA)中補體介導(dǎo)殺菌的抗體水平密切相關(guān)，所以同意頒發(fā)許可證(Goldschneider,I等，1969，J.Exp.Med.129:1307-1326和Goldschneider,I等，1969，J.Exp.Med.129:1327-1348)。在使用人補體的殺菌力試驗(SBA-H)中，已經(jīng)確定了抗血清群C的1:4SBA滴度的替代水平。但是，對腦膜炎球菌多糖疫苗許可的必要條件是基于在使用幼兔補體作為補體來源的試驗中(SBA-BR)能夠誘導(dǎo)血清殺菌反應(yīng)(世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)，1976，Requirementsformeningococcalpolysaccharidevaccine.世界衛(wèi)生組織技術(shù)報告系列，第594號.世界衛(wèi)生組織，Geneva，瑞士(WHO，1976))。根據(jù)此建議，受試者免疫接種腦膜炎球菌多糖疫苗2-4周后，檢測其抗下列靶菌株或同等菌株(Al對應(yīng)血清群A，C11對應(yīng)血清群C，S-1975對應(yīng)血清群Y，且S-4383對應(yīng)血清群W-135)時發(fā)現(xiàn)至少90％受試者的血清抗體滴度升高4倍或更多(WHO1976,WHO1981,生物制品局(BureauofBiologics),美國食品藥品管理局，1985年7月17日)。生物制品局采納了WHO的建議，并且根據(jù)此規(guī)程腦膜炎球菌多糖疫苗(血清群A和C組合以及血清群A、C、Y和W-135組合)在美國得到許可。為了利于各實驗室之間對腦膜炎球菌疫苗誘導(dǎo)的殺菌活性的比較，經(jīng)過多實驗室研究建立了一種利用幼兔補體的標準化SBA(SBA-BR)(MaslankaSE等,1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4:156-167.)。由于腦膜炎球菌綴合C疫苗的資料開始可以得到，開始出現(xiàn)如下的擔心，即在分析中使用幼兔補體可能導(dǎo)致假的高SBA滴度。在1999年3月召開的澄清和解決關(guān)于實驗室測定法用于分析人腦膜炎球菌血清群A和C特異性抗體的問題的會議之后，世界衛(wèi)生組織生物制品標準化專家委員會建議使用幼兔補體的SBA可以用于檢測對血清群C的抗體反應(yīng)(世界衛(wèi)生組織，1999.StandardizationandvalidationofserologicalassaysfortheevaluationofimmuneresponsestoNeisseriameningitidisserogroupA/Cvaccines.Geneva，WHO/V&B/99.19(WHO1999))。為了盡力避免使用幼兔補體對保護作用的過高評價，WHO建議開展研究以便將通過使用幼兔補體的SBA試驗所測定的SBA閾值滴度與使用人補體所測定的SBA滴度關(guān)聯(lián)起來。隨后召開了會議，得出的結(jié)果支持這樣一個總的結(jié)論：使用幼兔補體時<1:8的SBA滴度缺乏抗血清群C的保護作用，而使用幼兔補體時≥1:128的SBA滴度與使用人補體時的1:4保護性SBA滴度密切相關(guān)。沒有信息提供對于其它腦膜炎球菌血清群如A、Y或W-135或多糖綴合物的相應(yīng)關(guān)聯(lián)SBA-BR滴度。使用幼兔補體時的1:8和1:64之間的SBA滴度沒有必要與使用人補體時1:4的保護性SBA滴度密切相關(guān)(JodarL等，Biologicals2002；30:323-329)。WHO專家委員會推薦，接種疫苗后SBA-BR滴度為1:8、1:16、1:32和1:64時需要使用人補體進行再評價。解決1:8、1:16、1:32和1:64的SBA-BR滴度不確定性的其它措施包括經(jīng)評價接種疫苗前和接種疫苗后之間的抗體SBA滴度的4倍升高。也提供了與保護作用相關(guān)聯(lián)的記憶性的示例，然而專家委員會承認有關(guān)這些替代品的可以得到的資料是不充分的或者是有限的。高于1:8的SBA-BR滴度是表明人對腦膜炎球菌疾病產(chǎn)生免疫性的較好的指標，該滴度是從免疫前至免疫后大約15至大約45天的免疫后階段內(nèi)SBA-BR滴度的4倍升高或更高。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了用多價腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫病人的方法，其中病人血清SBA-BR滴度為1:16或更高，優(yōu)選地為1:32或更高，更優(yōu)選地為1:64或更高，并且甚至更加優(yōu)選地為1:128或更高。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫病人的方法，其中接種疫苗前后病人抗體SBA滴度升高4倍或更高。在另一個實施方案中，本發(fā)明通過用多價腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫病人來為病人提供抗腦膜炎奈瑟氏球菌多種血清群免疫性的方法，其中組合物包含選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A、C和Y；A、C和W-135；C、Y和W-135；A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135中的兩種或兩種以上多糖。在進一步的實施方案中，本發(fā)明通過用多價腦膜炎球菌(純化的)多糖綴合組合物免疫病人來為病人提供抗腦膜炎奈瑟氏球菌多種血清群免疫性的方法，其中多糖被衍生為小于100,000道爾頓。在本發(fā)明的一個實施方案中，純化的多糖被解聚成大約5,000至大約75,000道爾頓的平均多糖大小；優(yōu)選地為大約7,000至大約50,000道爾頓的平均多糖大?。桓觾?yōu)選地為大約8,000至大約35,000道爾頓的平均多糖大?。簧踔粮觾?yōu)選地為大約12,000至大約25,000道爾頓的平均多糖大小。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物中平均多糖大小在大約15,000至大約22,000道爾頓之間。發(fā)明概述本發(fā)明提供了向人體提供抗致病腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌疾病免疫性的方法，其是通過施用腦膜炎球菌多糖-蛋白綴合物的免疫組合物實現(xiàn)的。在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫組合物包含兩種或兩種以上蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。在優(yōu)選的實施方案中，免疫組合物包含兩種或兩種以上不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的莢膜多糖。本發(fā)明提供了向人體提供抗致病腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌疾病免疫性的方法，其包括施用包含兩種或兩種以上不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫組合物，其中每種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的莢膜多糖。本發(fā)明提供了向人體提供抗致病腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌疾病免疫性的方法，其包括施用腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)綴合物。本發(fā)明提供了多價腦膜炎球菌疫苗，其由包含免疫有效量的2-4種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合疫苗，其中每一綴合物各包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)抗腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫反應(yīng)的方法，其包括向人施用免疫有效量的本發(fā)明免疫組合物。在一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的兩種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一綴合物包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖，更加優(yōu)選地，多價腦膜炎球菌疫苗包含莢膜多糖A和W-135、A和Y、C和W-135、C和Y以及W-135和Y。在一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的三種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一綴合物包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖，更加優(yōu)選地，多價腦膜炎球菌疫苗包含莢膜多糖A、C和W-135；A、C和Y；C、Y和W-135；C、W-135和Y以及A、W-135和Y。在另一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的四種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一綴合物包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)抗腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫反應(yīng)的方法，其包括向人或動物施用免疫有效量的本發(fā)明免疫組合物。本發(fā)明提供了多價腦膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合疫苗，其中每一綴合物各包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。本發(fā)明提供了保護易感染腦膜炎奈瑟氏球菌的人或動物的方法，其包括向人或動物施用免疫有效量的本發(fā)明疫苗。本文引用的所有專利、專利申請以及其它出版物全文并入作為參考。發(fā)明詳述本發(fā)明包含具有兩種或兩種以上不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫組合物，其中每一綴合物各包含與載體蛋白質(zhì)綴合的莢膜多糖。因此，本發(fā)明包括含有兩種或兩種以上不同衍生莢膜多糖的組合物，其中所述莢膜多糖與一種或多種載體蛋白質(zhì)綴合?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)制備莢膜多糖。在本發(fā)明中莢膜多糖優(yōu)選從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y制備。在優(yōu)選的實施方案中，分別制備這些腦膜炎球菌血清群綴合物然后配制成單一劑量形式。例如，從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y中分別純化莢膜多糖。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，純化的多糖在綴合至載體蛋白質(zhì)前被解聚并活化。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，利用溫和氧化條件將來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的莢膜多糖部分解聚。天然的腦膜炎球菌多糖大約500,000-1,500,000道爾頓。本發(fā)明針對的是大小較小的腦膜炎球菌多糖。當純化天然腦膜炎球菌多糖時，有一定比例的多糖是較小的。然而，為了獲得更好的產(chǎn)量，通常優(yōu)選將天然腦膜炎球菌多糖解聚或衍生成優(yōu)選的大小范圍，優(yōu)選小于100,000道爾頓。在本發(fā)明的一個實施方案中，純化多糖被解聚成大約5,000至大約75,000道爾頓的平均多糖大??；優(yōu)選地為大約7,000至大約50,000道爾頓的平均多糖大?。桓觾?yōu)選地為大約8,000至大約35,000道爾頓的平均多糖大??；甚至更加優(yōu)選地為大約12,000至大約25,000道爾頓的平均多糖大小。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物中平均多糖大小在大約15,000至大約22,000道爾頓之間。在多糖解聚或部分解聚后可以接著進行活化步驟?！盎罨笔侵笇Χ嗵沁M行化學(xué)處理以提供能夠與載體蛋白質(zhì)反應(yīng)的化學(xué)基團。優(yōu)選的活化方法包括在15-30℃、pH5.0±0.1下于生理鹽水中使用已二酸二酰肼處理約2小時。美國專利號5,965,714描述了一種活化方法。一旦活化，就可以將莢膜多糖綴合到一種或多種載體蛋白質(zhì)上。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，每一莢膜多糖分別與單一載體蛋白質(zhì)種類綴合。在優(yōu)選的實施方案中，將來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的莢膜多糖分別綴合至同一種載體蛋白質(zhì)上。載體蛋白質(zhì)可以包括細菌毒素如白喉毒素，失活的細菌毒素如白喉類毒素、CRM197、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌(E.coli)LT、大腸桿菌ST以及來源于銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。也可以使用細菌外膜蛋白，例如外膜復(fù)合體c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附素蛋白質(zhì)(PsaA)。其它蛋白質(zhì)如卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)也可以作為載體蛋白質(zhì)使用。載體蛋白質(zhì)優(yōu)選無毒和無反應(yīng)原性并且可得到足夠量和足夠純度的蛋白質(zhì)。載體蛋白質(zhì)應(yīng)經(jīng)受得住標準綴合過程。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，從喉棒桿菌(Corynebacteriadiphtheriae)培養(yǎng)物純化并利用甲醛化學(xué)脫毒的白喉毒素被用作載體蛋白質(zhì)。另外一種可供選擇的載體蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)D，它是流感嗜血桿菌(H.influenza)的外膜表面暴露蛋白。在本發(fā)明的一個實施方案中，每一衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例為大約1:1至大約1:20(w/w)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，總的衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例為大約1:2至大約1:10(w/w)；并且每一衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的更加優(yōu)選地平均比例為大約1:2至大約1:6(w/w)。在本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案中，總的衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例為大約1:(4±1)，更加優(yōu)選地為1:(4±0.5)，甚至更加優(yōu)選地為1:(4±0.25)(w/w)。在莢膜多糖與載體蛋白質(zhì)綴合后，可以利用多種技術(shù)對多糖-蛋白質(zhì)綴合物進行純化(就多糖-蛋白質(zhì)綴合物的量而言為富集)。純化步驟的一個目的是從多糖-蛋白質(zhì)綴合物中去除未結(jié)合的多糖。美國專利號6,146,902中描述了一種涉及在硫酸銨存在下進行超濾的純化方法?；蛘撸梢酝ㄟ^許多標準技術(shù)從未反應(yīng)的蛋白質(zhì)和多糖中將綴合物純化出來，所述標準技術(shù)尤其包括大小排阻層析、密度梯度離心、疏水相互作用層析或硫酸銨分級分離等。參見，例如P.W.Anderson等(1986).J.Immunol.137:1181-1186。還可見H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.127:1011-1018。在將多糖和載體蛋白質(zhì)綴合后，可以通過組合多種衍生多糖-蛋白質(zhì)綴合物來制備本發(fā)明的免疫組合物。本發(fā)明的免疫組合物包含與一種或一種以上的載體蛋白質(zhì)綴合的兩種或兩種以上不同的莢膜多糖。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是二價免疫組合物，其包含與白喉毒素或類毒素綴合的分別來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的衍生莢膜多糖。更優(yōu)選地，本發(fā)明為四價免疫組合物，其包含與白喉毒素或類毒素綴合的分別來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。本發(fā)明部分地指向多成分、衍生多糖綴合物的組合物，其中在每一劑量中每一衍生多糖為大約0.5至大約15μg。因此，組合物可以包含1-60μg的總的衍生多糖。在優(yōu)選的實施方案中，組合物中每一衍生多糖的相對含量大約等同于±50％；更優(yōu)選±30％；甚至更加優(yōu)選±20％。載體蛋白質(zhì)的制備和用途以及多種可能的綴合方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。本發(fā)明綴合物可以通過這些技術(shù)人員利用本發(fā)明所教導(dǎo)以及在普通文獻上可輕易得到的信息來制備。也可以從以下美國專利的任意一個或全部中得到指導(dǎo)，其中這些專利的教導(dǎo)在此全部引用作為參考：美國專利號4,356,170；4,619,828；5,153,312；5,422,427和5,445,817。備選地，可以通過共同培養(yǎng)兩種或兩種以上腦膜炎奈瑟氏球菌血清群并且共純化、解聚、活化并綴合多糖，或者通過分別培養(yǎng)純化腦膜炎奈瑟氏球菌血清群并且在解聚、活化和綴合多糖的任何步驟之前或之后將兩種或兩種以上純化多糖混合來制備免疫組合物?？梢酝ㄟ^從不同的腦膜炎球菌血清群分別制備多糖-蛋白質(zhì)綴合物然后將綴合物混合而制備本發(fā)明免疫組合物。本發(fā)明免疫組合物可以作為疫苗使用。本發(fā)明疫苗的配制可以利用本領(lǐng)域的已知方法完成。本發(fā)明的疫苗組合物還可以包含一種或一種以上的佐劑。佐劑包括(作為例子但不限于此)：鋁佐劑(例如鋁鹽諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或其組合)、弗氏佐劑(完全佐劑或不完全佐劑)、BAY、DC-chol、pcpp、單磷酰脂A、CpG、QS-21、霍亂毒素和甲酰甲硫氨酰肽。參見例如：VaccineDesign,theSubunitandAdjuvantApproach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman編，Plenum出版社，N.Y.)。佐劑優(yōu)選地為鋁佐劑，如氫氧化鋁或磷酸鋁。備選的佐劑包括水包油乳劑制劑，例如PCT公開號WO90/14837中所描述的MF59、SAF(包含10％角鯊?fù)椤?.4％Tween80、5％pluronic封閉的多聚體L121和thr-MDP)和RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT，包含2％角鯊?fù)椤?.2％Tween80和選自單磷酸脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁成分，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM))；皂角甙佐劑，例如可以使用StimulonTM(CambridgeBioscience,Worcester,Mass.)或者產(chǎn)生的顆粒如ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)；細胞因子，例如白細胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)。在本發(fā)明的一個實施方案中，蛋白質(zhì)-多糖綴合物的平均糖基化比率(多糖與蛋白質(zhì)的比率)為大約0.05至大約2；更優(yōu)選的平均糖基化比率為大約0.08至大約1.25；甚至更加優(yōu)選的平均糖基化比率為大約0.1至大約0.9。在一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)-多糖綴合物的平均糖基化比率為大約0.2至大約0.8；更優(yōu)選的平均比率為大約0.2至大約0.6；并且甚至更加優(yōu)選的平均比率為大約0.3至大約0.5。如下所述，本發(fā)明的疫苗和免疫組合物在多種動物模型中引起類似T-細胞依賴性的免疫反應(yīng)，而多糖疫苗引起類似非T-細胞依賴性的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明組合物對于研究在類似T-細胞依賴性的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原免疫反應(yīng)中所涉及的生物學(xué)途徑和過程也是一個有用的研究工具。施用于人或動物的本發(fā)明疫苗的量以及施用方案可以按照藥學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域一般技術(shù)人員眾所周知的標準技術(shù)確定，并在確定時考慮到諸如所用具體抗原、佐劑(如果存在)、年齡、性別、體重、物種和特定動物或患者的狀況以及施用路徑等因素。在本發(fā)明中，為了在抗腦膜炎奈瑟氏球菌的疫苗接種中提供有效劑量，多糖-蛋白質(zhì)載體的量可以為每公斤體重大約0.02μg至大約5μg。在本發(fā)明優(yōu)選的組合物和方法中，劑量為每公斤體重大約0.1μg至3μg。例如，如果感染后時間不長，由于細菌增殖時間較短，有效劑量可以需要較少的抗體。同樣，有效劑量依賴于診斷時的細菌負載量。對于治療使用，可考慮在一段時期內(nèi)多次注射施用。本發(fā)明的多價綴合物可以以單一劑量或以系列劑量(即進行“一次加強”或“幾次加強”)形式施用。例如，就像目前針對預(yù)防兒童疾病的其它疫苗所推薦的那樣，兒童可以在生命早期接受單一劑量，此后在長達10年后接受加強劑量。加強劑量可使致敏B細胞產(chǎn)生抗體，即回憶應(yīng)答。也就是說，多價綴合物疫苗與得到許可的多糖疫苗相比，可在年幼群體中引起高的初次(即在疫苗的單次施用后)功能抗體應(yīng)答，而且還能夠引起回憶應(yīng)答(即在加強施用后)，這表明由本發(fā)明的多價綴合疫苗所引起保護性免疫應(yīng)答具有長效性。本發(fā)明組合物包括經(jīng)管口例如口、鼻、肛、陰道、經(jīng)口、胃內(nèi)、粘膜(例如經(jīng)舌、肺泡、牙齦、嗅覺或呼吸粘膜)等等施用的液體制劑，諸如混懸液、糖漿或酏劑；以及經(jīng)腸胃外、皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)或靜脈施用(例如注射施用)的制劑，諸如無菌混懸劑或乳劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)和腸胃外施用。此類組合物可以與適當載體、稀釋劑或賦形劑諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合。組合物也可以被凍干。根據(jù)所期望的施用路徑和制劑形式，組合物可以包含諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、膠凝劑或粘度增強添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、著色劑等等輔料。可以在不需要過多實驗的前提下參考標準教科書例如REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCE，第17版，1985(文中并入作為參考)來制備適宜的制劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選的施用路徑是肌肉或皮下，優(yōu)選肌肉施用路徑?？梢酝ㄟ^注射或備選的遞送裝置進行施用。本發(fā)明組合物可以以液體制劑的形式方便的提供，所述液體制劑例如可以被緩沖至選定pH的等滲水溶液、混懸液、乳液或粘性組合物。如果優(yōu)選消化道吸收，本發(fā)明組合物可以為藥丸、片劑、膠囊、膜片等等“固體”形式，包括緩釋或液體填充型“固體”制劑(例如以明膠包裹液體，由此明膠在胃中溶解用于在消化道中實現(xiàn)遞送)。如果希望鼻腔或呼吸道(粘膜)施用，組合物可以是通過壓力噴霧給藥器、泵給藥器或氣霧給藥器施用的形式。氣溶膠通常借助碳氫化合物在壓力下形成。泵給藥器優(yōu)選按計量的量施用或者按具有特定微粒大小的劑量施用。液體制劑通常比凝膠、其它粘性組合物和固體組合物更易制備。另外，液體組合物多少可以更方便的在動物、兒童(尤其是幼兒)和其它可能在吞咽藥丸、片劑、膠囊等等方面有困難的個體上施用，尤其是通過注射或口服方式，在多劑量給藥情況下液體組合物也更方便。另一方面，可以將粘性組合物配制成具有適當范圍內(nèi)的粘性以便與粘膜(諸如胃或鼻粘膜的內(nèi)襯)接觸時間更長。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，疫苗組合物可以配制成無菌液體的、無致熱原的、磷酸鹽緩沖的生理鹽水，可以有或沒有防腐劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，一次劑量的配方包含大約0.3至大約1.0mg磷酸鈉、大約3.5至大約6.0mg氯化鈉以及高達1.5mL的水。在一個優(yōu)選的實施方案中，一次劑量的配方包含大約0.6±0.2mg磷酸鈉、4.4±0.2mg氯化鈉以及高達大約0.5±0.2mL的水。明顯的，對適當載體和其它添加劑的選擇會取決于確切施用途徑和特定劑型的性質(zhì)，例如液體劑型(例如不管將組合物配制成溶液、混懸液、凝膠或其它液體形式)或固體劑型(例如不管將組合物配制成藥丸、片劑、膠囊、膜片、緩釋型或液體填充型)。溶液、混懸液和凝膠除含有活性成分之外通常含有大量的水(優(yōu)選純化的水)。也可以存在少量的其它成分，例如pH調(diào)節(jié)劑(例如諸如氫氧化鈉的堿)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、膠凝劑(例如甲基纖維素)、著色劑和/或調(diào)味劑。組合物可以為等滲的，即它可以具有與血液和淚液相同的滲透壓。所期望的本發(fā)明組合物的等滲性可以利用酒石酸鈉、丙二醇或其它無機或有機溶質(zhì)實現(xiàn)。在一個實施方案中，用磷酸鈉或氯化鈉或其混合物實現(xiàn)組合物的優(yōu)選等滲性。對于包含鈉離子的緩沖劑而言，特別優(yōu)選氯化鈉。組合物的粘度可以使用可藥用增稠劑來維持所選定水平。由于甲基纖維素可以容易地且經(jīng)濟地獲得，而且容易操作，所以優(yōu)選甲基纖維素。其它適宜的增稠劑包括例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等等。增稠劑的優(yōu)選濃度取決于所選試劑。要點是使用可達到所選粘度的量。粘性組合物通常通過向溶液中添加此類增稠劑制備?？梢圆捎每伤幱梅栏瘎﹣硌娱L組合物的保存期。苯甲醇是適宜的，但是還可以使用各種防腐劑包括例如對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨。防腐劑的適宜濃度為總重量的0.02％-2％，但根據(jù)所選試劑可以明顯變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到：所選則的組合物組分必須為與腦膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白質(zhì)載體綴合物不起化學(xué)反應(yīng)的。本發(fā)明將通過參考下列舉例說明性但非限制性實施例進一步描述，所述實施例詳細闡明本發(fā)明概念的幾個優(yōu)選實施方案。本發(fā)明的其它實施例在不背離本發(fā)明精神的前提下對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。以下縮寫和商標為：ACIP，免疫接種顧問委員會(AdvisoryCommitteeonImmunizationPractices)；AE，不良事件；CetavalonTM，十六烷基三甲基溴化銨，CTAB；CFR，聯(lián)邦法規(guī)；CRF，個案報告表；DTP，白喉-破傷風(fēng)-百日咳；ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定；FDA，美國食品藥品管理局；GCP，藥品臨床試驗管理規(guī)范；GMC，幾何平均濃度；GMT，幾何平均滴度；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亞類1；IgG2，免疫球蛋白G亞類2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，國際協(xié)調(diào)會議；IND，研究用新藥；IRB，機構(gòu)審查委員會；MenA/C-Dt，二價(A和C)腦膜炎球菌多糖-白喉綴合疫苗；MenPS，腦膜炎球菌血清群特異性多糖；mL，毫升；MenomuneTM，許可的腦膜炎球菌A、C、Y和W-135多糖疫苗；OD，光密度；PBS，磷酸緩沖鹽溶液；SAE，嚴重不良事件；SBA，血清殺菌活性；SBA-BR，使用幼兔補體進行的血清殺菌力試驗；SBA-HC，使用人補體進行的血清殺菌力試驗；SIDS，嬰兒猝死綜合征；TetraMenD，四價(A、C、Y和W-135)腦膜炎球菌多糖-白喉綴合疫苗；Td，破傷風(fēng)和白喉疫苗；UAE，意外不良事件；URI，上呼吸道感染；μg，微克。實施例實施例1.腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的純化莢膜多糖粉末的制備粗糊狀物的制備分別將腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的凍存種培養(yǎng)物融化，并在液體WatsonScherp培養(yǎng)基中恢復(fù)，而后接種至含有MuellerHinton瓊脂培養(yǎng)基的Blake瓶中。將Blake瓶在CO2存在條件下于35-37℃培養(yǎng)15-19小時。培養(yǎng)后，將生長物從Blake瓶中移出并加至含有WatsonScherp培養(yǎng)基的4L搖瓶中。將搖瓶在水平搖床上于35-37℃培養(yǎng)3-7小時。將4L瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含有WatsonScherp培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中。發(fā)酵容器在35-37℃培養(yǎng)7-12小時，其間加入補料和消泡劑并控制溶解氧含量和pH。培養(yǎng)后，將發(fā)酵容器內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至500L大罐中，加入CetavlonTM，并且混合1小時。將CetavlonTM處理的生長物以每小時約30-70升的流速以約15,000-17,000×g離心。利用第二次CetavlonTM沉淀將多糖粗品從上清液中沉淀出來。向上清液中加入CetavlonTM并將材料在室溫下混合至少1小時。將材料于1-5℃貯藏8-12小時。以每分鐘300-400ml的流速，約45,000-50,000×g離心收集沉淀的多糖。將收集的糊狀物貯藏于-60℃或更低溫度下直至進一步處理。純化多糖粉末的制備將未活化的糊狀物融化并轉(zhuǎn)移至攪拌器中。將糊狀物于0.9M氯化鈣中攪拌以得到均一懸浮液。懸浮液于大約10,000×g離心15分鐘。將上清液通過容器中的無綿絨墊得到第一次提取物。向糊狀物中加入第二次體積的0.9M氯化鈣，并且攪拌得到均一懸浮液。懸浮液如上所述離心，且將上清液與來自第一次提取的上清液混合?？偣策M行4次提取，并將上清液混合?；旌系奶崛∥锿ㄟ^利用10-30kDaMWCO螺旋形超濾裝置進行超濾濃縮。向濃縮液中加入氯化鎂，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.2-7.5。向濃縮物中加入DNA酶和RNA酶，并于25-28℃混合孵育4小時。加乙醇至濃度為30-50％。通過10,000×g離心2小時除去沉淀的核酸和蛋白質(zhì)。回收上清液并通過加入乙醇至80％且于1-5℃靜置過夜使多糖沉淀。虹吸除去乙醇，并將沉淀的多糖在10,000×g離心5分鐘。用乙醇洗滌沉淀的多糖。用丙酮洗滌多糖，10,000×g離心15-20分鐘。將多糖真空干燥。將初始多糖粉末融入乙酸鈉溶液。向其中加入氯化鎂，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，并于25-28℃混合孵育4小時以去除殘余的核酸。在與這些酶孵育后，向多糖-酶混合物中加入等體積的乙酸鈉-酚溶液，并置于1-5℃水平搖床中約30分鐘。將混合物于10,000×g離心15-20分鐘。將上層水相層回收并保存。向水相層中加入等體積乙酸鈉-酚溶液，并按照上述提取?？偣策M行4次提取以便從多糖溶液中去除蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。合并的水相提取物用注射用水稀釋高達10倍，并對10倍體積注射用水透析。向透析后的多糖中加入氯化鈣。通過加入乙醇至80％并于1-5℃過夜沉淀多糖。取出乙醇上清液，并通過10,000×g離心15分鐘收集多糖。純化的多糖用乙醇洗滌兩次，并用丙酮洗滌一次。將洗滌后的粉末在干燥器中進行真空干燥。干粉貯藏于-30℃或更低溫度下直至進行綴合反應(yīng)。實施例2.純化的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y莢膜多糖粉末的解聚本制備所用材料包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的純化的莢膜多糖粉末(按照實施例1制備)、無菌的50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉、30％過氧化氫以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。在分別的反應(yīng)中對每一血清群多糖進行解聚。向一不銹鋼罐中裝入多達60克的純化莢膜多糖粉末。向多糖中加入無菌的50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)至濃度為每升2.5g多糖。在1-5℃下混合多糖溶液12-24小時以實現(xiàn)溶解。將反應(yīng)罐與熱交換器相連。再額外加入50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)以稀釋多糖至每升1.25g的反應(yīng)濃度。將多糖溶液加熱至55±0.1℃。向反應(yīng)混合物中加入30％過氧化氫至其反應(yīng)濃度為1％。通過隨反應(yīng)時間跟蹤多糖分子大小的變化來監(jiān)控反應(yīng)進程。每隔15-20分鐘，取出一份反應(yīng)混合物試樣并注射至高效凝膠排阻色譜(HPSEC)柱以測量多糖的分子大小。當多糖的分子大小達到目標分子大小時，關(guān)閉加熱器并通過冰水浴循環(huán)將多糖溶液迅速冷卻至5℃。通過將反應(yīng)罐連接至裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器上，將解聚多糖溶液濃縮至每升15g。將濃縮后的解聚多糖溶液用10倍體積無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)透析。將解聚多糖貯存于1-5℃直至下一步驟。通過流經(jīng)商品名為“Ultahydrogel.TM.250”的凝膠過濾層析柱以及利用多角度激光光散射確定解聚多糖的分子大小，所述凝膠過濾層析柱用葡聚糖分子標準來校準。對于血清群A，使用BartletG.R.J的方法((1959),JournalofBiophygicalChemistry，234，466-468頁)通過磷的含量測定多糖的量，并且對于血清群C、W135和Y，使用SvennerholmL.的方法((1955)，BiochimicaBiophysicaActa，24，604-611頁)通過唾液酸的含量測定多糖的量。通過HesterinS.((1949),JournalofBiologicalChemistry，180，249頁)的方法測定O-乙酰基含量。通過ParkJ.T.和JohnsonM.J.((1949)，JournalofBiologicalChemistry，181，149-151頁)的方法測定還原活性。解聚多糖的結(jié)構(gòu)完整性通過質(zhì)子1H和13CNMR確定。解聚多糖的純度通過測量LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余過氧化氫含量來確定。實施例3.腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y解聚多糖的衍生化本制備所用材料包括過氧化氫解聚的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y莢膜多糖(按照實施例2制備)、己二酸二酰肼、僅用于血清群A的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)、氰基硼氫鈉、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉、無菌的1M氯化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。在分開的反應(yīng)中將每一血清群多糖進行衍生反應(yīng)。向一不銹鋼罐中裝入純化的解聚多糖，并用無菌0.85％生理鹽水的稀釋至終反應(yīng)濃度為每升1g多糖。向該溶液中加入溶于無菌0.85％生理鹽水的己二酸二酰肼濃的等分試樣至其反應(yīng)濃度為每升1g。對于血清群A，將EDAC作為溶于無菌0.85％生理鹽水的濃的等分試樣加入，以達到每升1g的反應(yīng)濃度。調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.1，并利用無菌的1N鹽酸和無菌的1N氫氧化鈉在室溫下(15-30℃)維持此pH值達2小時。2小時后，向此反應(yīng)混合物中加入溶于無菌0.85％生理鹽水的氰基硼氫鈉濃的等分試樣至每升2g的反應(yīng)濃度。在室溫下(15-30℃)攪動反應(yīng)物44±4小時，同時維持pH值5.5±0.5。此反應(yīng)期后，將pH值調(diào)至6.0±0.1，并且通過將反應(yīng)罐連接至裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器上將衍生的多糖濃縮至每升12g多糖。用30倍體積的1M氯化鈉透析濃縮后衍生多糖，接著用10倍體積的0.15M氯化鈉透析。將反應(yīng)罐與超濾器分離，并在1-5℃貯藏7天。將反應(yīng)罐與裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器重新連接，并用30倍體積的1M氯化鈉透析，接著用10倍體積的0.15M氯化鈉透析。通過與在解聚多糖中所用的相同方法對衍生多糖的分子大小、多糖的量以及O-乙?；窟M行測定。通過SnyderS.L.和SobocinskiP.Z.((1975),AnalyticalBiochemistry,64，282-288頁)的2,4,6-三硝基苯磺酸方法測定酰肼含量。衍生多糖的結(jié)構(gòu)完整性通過質(zhì)子1H和13CNMR確定。衍生多糖的純度通過測量未結(jié)合的酰肼水平、LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余氰基硼氫化物含量來確定。實施例4.載體蛋白質(zhì)的制備粗白喉類毒素蛋白質(zhì)的制備將凍干的種子培養(yǎng)物進行重構(gòu)并培養(yǎng)16-18小時。取一等分試樣培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的0.5升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上于34.5-36.5℃培養(yǎng)7-9小時。從培養(yǎng)瓶取一等分試樣培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的4升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上于34.5-36.5℃培養(yǎng)14-22小時。將來自4升搖瓶中的培養(yǎng)物接種于含有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。將發(fā)酵罐在34.5-36.5℃孵育70-144小時。發(fā)酵罐內(nèi)容物通過深層濾器過濾至收集器中。向收獲物中加入37％的甲醛溶液至其濃度為0.2％。將pH調(diào)整至7.4-7.6。將收獲物通過0.2微米濾器過濾至無菌的20升的瓶中。將瓶子于34.5-36.5℃培養(yǎng)7天。向每一20升瓶中加入37％的甲醛溶液至其濃度為0.4％。調(diào)節(jié)混合物pH值至7.4-7.6。將瓶在搖床上于34.5-36.5℃培養(yǎng)7天。向每一20升瓶中加入37％的甲醛溶液至其濃度為0.5％。調(diào)節(jié)混合物pH值至7.4-7.6。將瓶于34.5-36.5℃培養(yǎng)8周。對類毒素粗品進行脫毒測試。在測試期間將瓶貯藏于1-5℃。粗白喉類毒素蛋白質(zhì)的純化將類毒素粗品升溫至室溫，并將20升瓶中的內(nèi)容物合并裝入純化罐。調(diào)節(jié)類毒素pH值至7.2-7.4，并向類毒素粗品中加入活性炭并混合2分鐘。將活性炭類毒素混合物靜置1小時，然后用深層濾器過濾至第二個純化罐中。向濾液中加入固體硫酸銨至70％飽和度。調(diào)節(jié)pH值至6.8-7.2，并將溶液靜置16小時。過濾收集沉淀的蛋白質(zhì)，并用70％飽和度硫酸銨溶液(pH7.0)洗滌。將沉淀溶于無菌蒸餾水，并將蛋白質(zhì)溶液過濾至不銹鋼收集器中。調(diào)節(jié)pH值至6.8-7.2，并加入硫酸銨至40％飽和度。調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0-7.2，并將溶液靜置16小時。通過過濾去除并丟棄沉淀。向濾液中加入硫酸銨至60％飽和度，并調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2。將混合物靜置16小時，并通過過濾收集沉淀的蛋白質(zhì)。將沉淀溶于無菌蒸餾水，過濾去除不溶的蛋白質(zhì)，并用0.85％生理鹽水透析。純化白喉類毒素蛋白質(zhì)的濃縮和無菌過濾利用10,000MWCO再生纖維素濾柱，將蛋白質(zhì)溶液濃縮至每升15g并用10倍體積的0.85％生理鹽水透析。濃縮的蛋白質(zhì)溶液通過0.2微米濾膜過濾。將蛋白質(zhì)溶液貯藏于1-5℃貯存直至進行綴合。蛋白質(zhì)濃度通過Lowry,O.H.等的方法((1951)，JournalofBiologicalChemistry，193，265-275頁)測定。蛋白質(zhì)純度通過測定無菌度、LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余甲醛含量確定。實施例5.腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y多糖與白喉類毒素蛋白質(zhì)的單價綴合物的制備本制備所用材料包括腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的己二酸衍生多糖(按照實施例3制備)、無菌白喉類毒素蛋白質(zhì)(按照實施例4制備)、EDAC、硫酸銨、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％)。在分別的反應(yīng)中制備每一血清群多糖綴合物。所有的四種綴合物均通過下列方法制備。向一不銹鋼罐中裝入純化的己二酸衍生多糖(反應(yīng)濃度為700-1000μM活性酰肼)以及純化的白喉類毒素蛋白質(zhì)(反應(yīng)濃度為3.8-4.0g/L蛋白質(zhì))。利用0.85％生理鹽水稀釋這些原料至目標反應(yīng)濃度并調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.1。將等分試樣的EDAC加入到多糖蛋白質(zhì)混合物中至2.28-2.4g/L的濃度。在15-30℃下將反應(yīng)pH維持在5.0±0.1達2小時。2小時后，用無菌的1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.1，并將反應(yīng)物在1-5℃貯藏16-20小時。將反應(yīng)混合物升溫至15-30℃，并將反應(yīng)罐連接至裝備有30,000MWCO再生纖維素柱的超濾器上。加入固體硫酸銨至60％飽和度(對于血清群A、W-135和Y)和50％飽和度(對于血清群C)。將綴合反應(yīng)混合物用20倍體積的60％飽和硫酸銨溶液(對于血清群A、W-135和Y)和50％飽和硫酸銨溶液(對于血清群C)透析，接著用20倍體積的0.85％生理鹽水透析。透析后的綴合物先通過含有1.2微米和0.45微米濾心的過濾膠囊，然后再通過含有0.22微米濾心的過濾膠囊。通過與解聚和衍生多糖中所用相同的方法測定多糖的量和O-乙?；?。蛋白質(zhì)的量通過Lowry方法確定。綴合物的分子大小通過商品名為“TSK6000PW”的凝膠過濾層析柱來確定，其使用DNA作為空體積標記物、使用ATP作為總體積標記物以及使用牛甲狀腺球蛋白作為參考標記物。此外，通過多角度激光光散射確定從TSK6000PW柱上洗脫的綴合物的分子大小。通過使用雙夾心ELISA方法測定與抗多糖血清群特異性抗體的結(jié)合來測定綴合物的抗原特性。綴合物純度通過測定未結(jié)合(未綴合)多糖的量(通過在疏水相互作用層析柱上洗脫)、未綴合蛋白質(zhì)的量(利用毛細管電泳)、無菌度、LAL(內(nèi)毒素)含量、殘余EDAC含量以及殘余銨離子含量來確定。實施例6.多價腦膜炎球菌A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合疫苗的配制本制備所用材料包括按照實施例5制備的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉類毒素綴合物、無菌的100mM磷酸鈉緩沖的生理鹽水(0.85％氯化鈉)。向不銹鋼積聚罐內(nèi)的生理鹽水(0.85％)中加入等分試樣的無菌的100-500mM磷酸鈉緩沖生理鹽水使得到的最終疫苗濃度為10mM磷酸鈉。向含有10mM無菌磷酸鈉生理鹽水的積聚罐中加入2-4種無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物中的每一種，達到每毫升緩沖液中每一血清群多糖各8μg的終濃度。將配制的四價綴合物混合并通過0.2μm濾器過濾至第二個積聚罐中。多價疫苗制劑中每一種血清群多糖的量可以通過糖成分分析測定，其中糖成分分析可以使用具有脈沖安培檢測的高pH陰離子交換層析來測定。蛋白質(zhì)的量通過Lowry方法測定。使用與pH計連接的復(fù)合電極測定疫苗的pH值。通過使用雙夾心ELISA方法測定與抗多糖血清群特異性抗體的結(jié)合來測定多價綴合物的抗原特性。通過疫苗中每一綴合物在動物模型中引起初次和加強抗多糖IgG免疫應(yīng)答的能力來確定多價綴合疫苗的免疫原性。多價綴合疫苗的純度通過測定未結(jié)合(未綴合)多糖的量(使用具有脈沖安培檢測的高pH陰離子交換層析)，無菌度、LAL(內(nèi)毒素)含量、致熱原含量和一般安全性來測定。實施例7.氫氧化鋁佐劑輔助的多價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素蛋白質(zhì)綴合物的制備制備吸附至氫氧化鋁的綴合物。本制備所用材料包括按照實施例5制備的血清群A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌氫氧化鋁。向含有生理鹽水的積聚罐中加入每一種的無菌單價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素綴合物的等分試樣，達到每毫升緩沖液中每一血清群多糖為8μg的終濃度。向多價綴合疫苗中加入溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌氫氧化鋁，以達到終濃度為每毫升疫苗0.44mg鋁離子。實施例8.磷酸鋁佐劑輔助的綴合物的制備本制備所用材料包括按照實施例5制備的血清群A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌磷酸鋁。向含有生理鹽水的積聚罐中加入每一種的無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物的等分試樣，達到每毫升緩沖液中每一血清群多糖為8μg的終濃度。向多價綴合物疫苗中加入溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌磷酸鋁，以達到終濃度為每毫升疫苗0.44mg鋁離子。實施例9.在人類臨床研究中使用的材料和方法的一般描述四價衍生綴合疫苗的免疫原性在多種不同的臨床方案下研究了綴合疫苗誘發(fā)人類免疫應(yīng)答的能力。以下研究總結(jié)了這些結(jié)果。除非另外指出，以下每種研究中所使用的材料和方法如下：TetraMenDTetraMenD疫苗包含四種血清群腦膜炎球菌莢膜多糖：A、C、Y和W-135，每種多糖4μg，共價綴合于總量為48μg的白喉類毒素蛋白質(zhì)上。疫苗用無菌的、無熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水配制，但不含防腐劑。配方包含0.6mg磷酸鈉、4.4mg氯化鈉以及高達0.5mL的水。在美國和其它國家被許可用于2歲及2歲以上的人群。Menomune為凍干制劑，疫苗的一次劑量包含作為抗原的A、C、Y和W-135多糖各50μg，用硫柳汞保存的等滲氯化鈉溶液的稀釋液重新溶解，每次皮下給藥劑量為0.5mL。每0.5mL劑量的疫苗包括2.5-5mg作為穩(wěn)定劑的乳糖。對于皮下施用，作為血清群A、C、Y和W-135組合的-A/C/Y/W-135腦膜炎球菌多糖疫苗是一種血清群特異多糖抗原的凍干制劑，這些抗原分別來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135。稀釋劑是無菌的、無熱原的蒸餾水。按照標記的指示用稀釋劑重新溶解凍干制劑，每0.5mL劑量的配方包含溶于等滲氯化鈉溶液中的血清群A、C、Y和W-135的“分離產(chǎn)品”各50μg。成人用吸著破傷風(fēng)白喉混合類毒素(TetanusandDiphtheriaToxoidsAdsorbedforAdult)(以下稱作Td)是一種溶于等滲氯化鈉溶液中的明礬沉淀類毒素的無菌混懸劑，其中含有磷酸鈉緩沖液以控制pH值。此疫苗用于肌肉注射。通過分析，每一0.5mL的劑量配制成包含5Lf的破傷風(fēng)類毒素、2Lf的白喉類毒素和不超過0.28mg的鋁。在豚鼠效價測試中，破傷風(fēng)和白喉類毒素可以分別誘導(dǎo)產(chǎn)生至少2和0.5單位/毫升的抗毒素。在第一次隨訪時，所有受試者均接受0.5mLTd的單一劑量，施用時使用25英寸的計量注射針在左臂三角肌注射。每0.5mL劑量包含5Lf的破傷風(fēng)類毒素和2Lf的白喉類毒素。血清樣品于基線期之后指定的天數(shù)抽取血液樣品。例如，如果方案指定3個時間點(0天、28天和6個月)，那么應(yīng)該在疫苗接種之前的0天(基線期)、疫苗接種后28天(為了評價初次免疫應(yīng)答)和疫苗接種后6個月(為了評價免疫應(yīng)答的延續(xù)時間)抽取血液樣品。在每個時間點從每位受試者收集大約5mL全血。在采集后4小時之內(nèi)離心全血。吸出血清并貯存于-20℃。“28天”血液樣品取自0天注射后至少28天但尚未到57天時?！?個月”血液樣品取自0天注射后6個月加或減28天時。所以，28天血清代表取自0天后28-56天的血清，6個月血清代表取自0天后149-217天的血清。測定技術(shù)本研究使用了多種標準化免疫學(xué)測定法。以下描述總結(jié)了文中所用的方法。但是，其它相似的測定法(包括文中提到的測定法的修改方法)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的且可以被使用。通過使用幼兔補體的殺菌力試驗方法(SBA-BR)檢測抗腦膜炎球菌抗體使用血清殺菌力試驗方法測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的功能性抗體活性。在無菌96孔微量滴定板中準備測試血清的倍比稀釋液。將血清群特異性腦膜炎球菌和幼兔補體加入到血清稀釋液中并孵育。在該孵育階段之后，向血清/補體/細菌混合物中加入瓊脂覆層培養(yǎng)基，使之凝固，然后在37℃、5％CO2環(huán)境中孵育過夜。計數(shù)孔中存在的細菌菌落。通過與補體對照孔的平均值相比達到>50％殺死的倒數(shù)型血清稀釋度確定終點滴度。對于使用兔補體的該測定法，檢出限為滴度8。IgG抗腦膜炎球菌抗體的測定使用間接ELISA測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的IgG抗體活性。操作方法中涉及到與通過甲基化人血清白蛋白吸附到塑料微量滴定孔中的過量腦膜炎球菌血清群特異多糖(MenPs)抗原發(fā)生反應(yīng)的血清抗體。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG特異單克隆抗體的反應(yīng)來測定所結(jié)合抗體的量。然后使用過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，并用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的光密度(OD)與結(jié)合到微量滴定板中腦膜炎球菌多糖的血清中IgG抗體的量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用4參數(shù)邏輯曲線法與指定值的參考標準品(LotCDC1992或等效物)相比較來計算IgG抗體的量。IgM抗腦膜炎球菌抗體的測定使用間接ELISA測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的IgM抗體活性。操作方法中涉及到與通過甲基化人血清白蛋白吸附到塑料微量滴定孔中的過量MenPs抗原發(fā)生反應(yīng)的血清抗體。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgM特異單克隆抗體的反應(yīng)來測定所結(jié)合抗體的量。然后使用過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，并用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的光密度(OD)與結(jié)合到微量滴定板中腦膜炎球菌多糖的血清中IgM抗體的量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用4參數(shù)邏輯曲線法與指定值的參考標準品(LotCDC1992或等效物)相比較來計算IgM抗體的量。高親和力抗腦膜炎球菌IgG抗體的測定在AventisPasteurInc.公司使用改良的ELISA法測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的高親和力IgG抗體活性。目前，該測定法處于AventisPasteurInc.公司的研發(fā)中，并且將在臨床樣品測試之前取得資格。簡言之，就是用MenPs抗原包被96孔微量滴定板。吸出并洗滌所包被的微量滴定板后，在板中直接制備臨床血清的系列稀釋液并孵育過夜，稀釋時使用包含75mM硫氰酸銨的磷酸緩沖鹽(PBS)血清稀釋緩沖液。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG特異單克隆抗體的反應(yīng)來測定結(jié)合抗體的量。然后使用過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，并用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的光密度(OD)與結(jié)合到微量滴定板內(nèi)腦膜炎球菌多糖的血清中高親和力IgG抗體的量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用4參數(shù)邏輯曲線與參考標準品(LotCDC1992或等效物)相比較來計算高親和力IgG抗體的量。腦膜炎球菌抗體IgG1和IgG2亞類的測定使用ELISA測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的IgG1和IgG2亞類的抗體分布。血清系列稀釋液中的抗體與吸附在微量滴定板孔中的MenPs抗原反應(yīng)。使用抗人IgG1Fc特異或IgG2Fc特異的試劑測定所結(jié)合抗體的量。然后使用過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，并用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的光密度(OD)與結(jié)合到微量滴定板內(nèi)腦膜炎球菌多糖的血清中IgG1和IgG2抗體的量相關(guān)聯(lián)?？贵w的量表示為血清樣品中IgG1:IgG2的比率，如果可以得到適宜的參考標準品則也可以表示為IgG1或IgG2的濃度。通過對VERO細胞代謝的抑制測定抗白喉抗體通過測試血清保護VERO細胞免受白喉毒素攻擊的能力，檢測抗白喉抗體的反應(yīng)。使用無菌的96孔微量滴定板，將測試血清的倍比稀釋液(以1:4稀釋度開始)用白喉毒素激發(fā)并孵育。然后加入VERO細胞，用無菌的礦物油將微量滴定板孔封口并孵育6-8天。然后通過觀察培養(yǎng)基中pH指示劑的顏色改變來確定抗體水平，這種顏色的變化源自細胞代謝的副產(chǎn)物。通過與校準的WHO參考血清對比，將結(jié)果表示為國際單位/毫升，并且通過在白喉毒素激發(fā)劑量(challengedose)存在下允許細胞代謝的最高血清稀釋度來確定。檢測低限可以通過參考血清的最低的可檢測抗毒素水平以及測試血清的起始稀釋度來確定，一般為0.005IU/mL。通過ELISA法測定抗破傷風(fēng)抗體使用間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定抗破傷風(fēng)抗體水平。操作方法中涉及到與吸附到塑料微量滴定孔中破傷風(fēng)類毒素發(fā)生反應(yīng)的測試血清抗體。通過與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG特異抗體的反應(yīng)來測定所結(jié)合抗體的量。然后使用堿性磷酸酶底物產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，并用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的OD值(光密度)與結(jié)合到微量滴定板內(nèi)所包被抗原的血清稀釋液中的抗體的量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用平行線分析法與指定單位量的國際參考品(WHOLotTE-3)相比較，計算出抗體濃度。結(jié)果表示為國際單位/毫升(IU/mL)。ELISA法檢測抗破傷風(fēng)IgG的最低水平為0.01IU/mL，將低于此水平的樣品的值表示為<0.01IU/mL。如文中所使用，“不良事件”、“嚴重不良事件”和“意外不良事件”均為疫苗行業(yè)所熟知的術(shù)語。依據(jù)標準的臨床實踐總結(jié)并分析了安全性資料，包括評價接種疫苗的所有受試者的臨床研究持續(xù)時間。一般來說，每個術(shù)語均理解為具有以下含義。不良事件(AE)定義為：“在施用藥物的病人或臨床研究受試者中出現(xiàn)的任何不幸醫(yī)療事件，并且其不一定與此處理存在因果關(guān)系。因此，不良事件可以是與醫(yī)藥(研究)產(chǎn)品的使用暫時相關(guān)的任何不利的和非故意的病征(包括異常實驗室發(fā)現(xiàn))、癥狀或疾病，而不管其是否與醫(yī)藥(研究)產(chǎn)品相關(guān)?！?ICH指導(dǎo)，GCP(E6)§1.2)。嚴重不良事件(SAE)是：“在任何劑量出現(xiàn)的導(dǎo)致任何下列后果的任何不良藥物事件：死亡、威脅生命的不良藥物事件、病人住院或住院期延長、持久或明顯殘疾/無自理能力或先天性異常/出生缺陷。當根據(jù)適當醫(yī)療鑒定，即它們危害到病人或受試者并且需要通過藥物或外科介入避免發(fā)生本定義所列后果之一，則那些沒有導(dǎo)致死亡、威脅生命或需要住院的重大醫(yī)療事故可以考慮為嚴重不良藥物事件。此醫(yī)療事件的實例包括需要在急診室或家中進行精心治療的過敏性支氣管痙攣、未導(dǎo)致病人住院的血液病或驚厥或者藥物依賴或藥物濫用的發(fā)展。”(21CFR第I章,§312.32(a))。意外不良事件(UAE)是：“任何不良的藥物事件，其特異性或嚴重性與目前研究者指南中的不一致；或者如所修正，如果不需要或者得不到研究者指南，則其特異性或嚴重性與總體研究計劃中或當前應(yīng)用的其它地方描述的危險性資料不一致?！?21CFR第I章,§312.32(a))。本研究依據(jù)標準臨床實踐開展，并且研究中病人入選或排除的標準如下：病人的入選標準：1.如通過既往醫(yī)療史和體格檢查所確定，受試者為健康的。2.在接種疫苗時受試者至少11歲而未到19歲。3.受試者的父母/監(jiān)護人或受試者已經(jīng)簽署了機構(gòu)審查委員會(IRB)認可的適用于本試驗的知情同意書。4.受試者已經(jīng)簽署了機構(gòu)審查委員會(IRB)認可的適用于本試驗的同意書。病人的排除標準：1.患有嚴重慢性病(如心臟病、腎病、神經(jīng)病、代謝疾病、風(fēng)濕病等)。2.已知或懷疑免疫功能損傷。3.在檢查之前的72小時內(nèi)患有伴隨或不伴隨發(fā)熱的急性內(nèi)科疾病或者在檢查時口腔溫度≥38℃(100.4°F)。4.具有確實的侵入性腦膜炎球菌疾病史或先前進行腦膜炎球菌疫苗接種。5.在近3個月內(nèi)施用過免疫球蛋白和其它血液制品，或者在疫苗研究的6周內(nèi)口服或注射過皮質(zhì)類固醇或進行過其它免疫調(diào)節(jié)治療。按照口服類固醇持續(xù)時間<7天的遞減劑量方案進行的個體可以登記參加試驗，只要他們在登記前2周內(nèi)沒有接受1個療程以上的治療即可。6.在疫苗接種前72小時內(nèi)接受過抗生素治療。7.在登記前28天內(nèi)接種過任何疫苗，或者在登記后28天內(nèi)計劃接種除本研究指出的附加疫苗之外的任何疫苗。8.懷疑或已知對任何疫苗成分過敏。9.無法參與整個研究階段或者不能參加預(yù)定隨訪或不遵守研究規(guī)程。10.登記參加另一個臨床試驗。11.在研究者看來，對受試者具有健康危險或者干擾疫苗評價的任何情況。12.在接種疫苗時尿妊娠試驗陽性或可疑陽性的女性。實施例10.研究A-劑量研究研究A是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。90個健康成人(18-55歲)參加I期試驗，并接受TetraMenD疫苗單次注射。30個健康兒童(12-22個月)參加II期試驗并接受TetraMenD疫苗的單一劑量水平注射兩次。90個健康嬰兒(6-12周)參加III期試驗并接受TetraMenD疫苗的單一劑量水平注射三次。I期在18-55歲成人中的劑量研究此臨床試驗是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。在I期中，90個健康成人(18-55歲)接受了TetraMenD疫苗的單次注射。對于成人受試者，在TetraMenD施用前的基線期(0天)和TetraMenD施用后的28天抽取血清樣品用于血清學(xué)分析。分析所有可得到樣品的抗腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135莢膜多糖的SBA，并且通過ELISA法分析抗這些相同血清群的IgG抗體。對于所有血清群的SBA和IgGELISA結(jié)果總結(jié)如下。一個關(guān)鍵的免疫原性判定終點是比基線值升高≥4倍的受試者的比例。為了確定基線值SBA滴度對SBA升高≥4的比例產(chǎn)生什么影響，在成人中開展了亞組分析，其中將成人分成受試者基線值滴度小于1:64的組和受試者基線值滴度至少1:64的組。TetraMenD的安全性與是可比的，研究結(jié)果總結(jié)于下表。表A-1：I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期(0天)SBA滴度分布(續(xù)表A-1)表A-2：I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的注射后28天的SBA滴度分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-2)表A-3：I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射后28天達到SBA閾值的比例(符合方案數(shù)據(jù)分析)N：在每一時間點(0天；28天)可評價受試者的數(shù)量表A-4：I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射后28天的SBA和IgGELISA結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-4)0天：在接種疫苗前抽取的基線期血液樣品。28天：在接種疫苗后28天抽取的血液樣品。上升≥4倍的％：與0天相比接種疫苗后28天GMT值上升≥4倍的成人的百分比。N：可評價受試者的數(shù)量。*對于SBA數(shù)據(jù)計算GMT；對于IgGELISA數(shù)據(jù)計算GMC。表A-5顯示了按照劑量、病人年齡和血清群的GMT值。表A-5：按照劑量、病人年齡和血清群的GMT(續(xù)表A-5)(續(xù)表A-5)II期在12個月至22個月的幼兒中的劑量研究此臨床試驗是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。在II期中，30個健康兒童(12-22個月)接受了兩次TetraMenD疫苗的單一劑量。對于幼兒受試者，在三個時間點抽取血清樣品用于血清學(xué)分析：第一次注射TetraMenD疫苗之前的基線期(0天)、登記后60天(第一次注射之后的60天并且在馬上進行第二次注射TetraMenD疫苗的之前)和登記后90天(第二次注射之后30天)。分析所有可得樣品的抗腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135莢膜多糖的SBA，并且通過ELISA法分析抗這些相同血清群的IgG抗體。對于所有血清群的SBA和IgGELISA結(jié)果總結(jié)如下。結(jié)果總結(jié)于下表。表A-6：II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的基線期(0天)SBA滴度分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-6)表A-7：II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的第一次注射后60天(60天)的SBA滴度分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-7)表A-8：II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的第二次注射后30天(90天)SBA滴度分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-8)表A-9：II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的基線期、第一次注射后60天和第二次注射后30天達到SBA閾值的比例(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-9)表A-10：II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的幼兒的基線期、第一次注射后60天和第二次注射后30天的SBA和IgGELISA結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-10)(續(xù)表A-10)0天：在第1次注射前抽取的基線期血液樣品。60天：在第1次注射后60天和第2次注射前抽取的血液樣品。90天：在第2次注射后30天抽取的血液樣品。上升≥4倍的％：第1次注射后：與0天相比在60天GMT值上升≥4倍的幼兒的百分比；第2次注射后：與0天相比在90天GMT值上升≥4倍的幼兒的百分比。N：可評價受試者的數(shù)量。*對于SBA數(shù)據(jù)計算GMT；對于IgGELISA數(shù)據(jù)計算GMC。表A-11總結(jié)了按照劑量、病人年齡和血清群的GMT。表A-11：按照劑量、病人年齡和血清群的GMT的總結(jié)III期在嬰兒中的劑量研究此臨床試驗是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。在III期中，90個健康嬰兒(6-12周)接受了三次TetraMenD疫苗的單劑量。嬰兒受試者分別在2個月(第1次注射)、4個月(第2次注射)和6個月大(第3次注射)時接種TetraMenD疫苗。在兩個時間點抽取血清樣品用于血清學(xué)分析：6個月(第2次注射TetraMenD疫苗后2個月)和7個月(第3次注射后1個月)。分析所有可得樣品的抗腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135莢膜多糖的SBA，并且通過ELISA法分析抗這些相同血清群的IgG抗體。對于所有血清群的SBA和IgGELISA結(jié)果總結(jié)如下。結(jié)果總結(jié)于下表。表A-13：III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的7個月(第3次注射后1個月)時SBA滴度分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-13)表A-14：III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的6個月(第3次注射前)和7個月(第3次注射后)時達到SBA閾值的比例(符合方案數(shù)據(jù)分析)N：在每一時間點(6個月；7個月)可評價受試者的數(shù)量。表A-15：III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的6個月(第3次注射前)和7個月(第3次注射后)的嬰兒的SBA和IgGELISA結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-15)N：可評價受試者的數(shù)量。*對于SBA數(shù)據(jù)計算GMT；對于IgGELISA數(shù)據(jù)計算GMC。表A-16顯示了按照病人年齡和血清群的GMT總結(jié)。表A-16：按照病人年齡和血清群的GMT總結(jié)在嬰兒內(nèi)接種TetraMenD的同時施用兒科疫苗目前，按照當前ACIP建議和當?shù)貙嵺`對嬰兒接種常規(guī)兒科疫苗。在本研究中，嬰兒同時接種TetraMenD和兒科疫苗。在嬰兒2、4和6個月時施用DTacP()和Hib（)?？梢越臃N脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗(IPV)或口服脊髓灰質(zhì)炎病毒活疫苗(OPV)；在第一次和第二次注射TetraMenD時(在2個月和4個月時)施用IPV。按照當?shù)貙嵺`接種乙型肝炎疫苗；乙型肝炎疫苗的施用在一些2個月的受試者中進行，但在4個月或6個月的受試者中不施用。在開展嬰兒階段的該試驗過程中，得到許可并且收到了常規(guī)使用的ACIP建議。在本試驗中唯一一個受試者在4個月和6個月時接種了在6個月和7個月時評價了對常規(guī)施用的嬰兒疫苗抗原的抗體反應(yīng)。結(jié)果總結(jié)于各表中。試驗中的嬰兒受試者在2、4和6個月時接種DTacP和PRP疫苗；在第3次注射這些疫苗后一個月抽取7-月血液。對于這些疫苗抗原(白喉、破傷風(fēng)、百日咳FHA、百日咳PT和PRP)的每一種，所觀察到的抗體水平表明在接種TetraMenD的3個劑量組中沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(所有的P值>0.05)。(見表A-17)在本試驗中，在嬰兒2個月和4個月時接種IPV。在第2次注射IPV后3個月抽取7-月血液。對于1型和2型脊髓灰質(zhì)炎，所觀察到的GMT、NA≥1:4的比例和NA≥1:8的比例表明在接種TetraMenD的3個劑量組中沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(所有的P值>0.05)。根據(jù)NA≥1:8的比例可見，在所有接種TetraMenD的3個劑量組中至少95.0％以上表現(xiàn)為抗1型和2型脊髓灰質(zhì)炎的保護作用。對于3型脊髓灰質(zhì)炎，1μg、4μg和10μg組的GMT分別為562.7、164.0和113.3。3型脊髓灰質(zhì)炎各組間的GMT值存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.001，ANOVA)。但是，通過NA≥1:8的比例(分別為100.0％[22/22]、100.0％[21/21]和94.1％[16/17])可見所有接種TetraMenD的3個劑量組中全部表現(xiàn)為抗3型脊髓灰質(zhì)炎的保護作用。這些比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＝0.283，F(xiàn)isher精確性檢驗)。而且，這三種血清型脊髓灰質(zhì)炎的GMT值均正好位于所公布的在2個月和4個月時兩次接種IPV之后的GMT值范圍之內(nèi)，并且本試驗也采用了該IPV疫苗接種方案。在最近一次接種乙型肝炎疫苗后的最少5個月時抽取7-月血液。通過GMT和≥10mIU/mL的比例所觀察到的乙型肝炎病毒表面抗體水平在接種TetraMenD的3個劑量組中不存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(兩個p值均≥0.649)。值得注意的是，本試驗中沒有嬰兒在6個月隨訪時接種乙型肝炎疫苗，此時是第3次接種本疫苗的最早推薦時期。這可以解釋為什么在7個月嬰兒中乙型肝炎表面抗體滴度≥10mIU/mL的比例與所公布的疫苗初始劑量之后產(chǎn)生可檢測抗體的嬰兒比例范圍一致，而低于所預(yù)計的在全部三次接種后產(chǎn)生保護性抗體水平的嬰兒比例。本研究結(jié)果總結(jié)于下表。表A-17：III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的7個月的嬰兒中伴隨疫苗的免疫原性(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表A-17)*GMT的比較使用F-檢驗。百分比的比較使用Fisher精確性檢驗。p值<0.05實施例11.研究B-在2-10歲的兒童中的1個月和6個月研究本研究是對2-10歲的健康兒童進行的隨機、陽性對照(active-control)的研究，其中比較了單一劑量的TetraMenD和單一劑量的Menomune。分別在接種前的0天、接種后28天和6個月抽取血液樣品。TetraMenD的總體安全性與Menomune是可比的。本研究結(jié)果總結(jié)于下表。SBA-BR抗體滴度分布表B-1顯示了對于每一血清群的基線期、28天和6個月時SBA-BR抗體滴度分布的頻率。表B-1:疫苗接種后0天、28天和6個月時SBA-BR抗體滴度的分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表B-1)(續(xù)表B-1)(續(xù)表B-1)(續(xù)表B-1)表B-2總結(jié)了按照受試者年齡和TetraMenD血清群的滴度幾何均數(shù)GMT)。表B-2：按照受試者年齡和TetraMenD血清群的GMT總結(jié)表B-3顯示了對于血清群A、C、Y和W-135從基線期到28天SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量和比例。對于每一血清群，TetraMenD組中的百分比高于組中的百分比。對于血清群A、C、Y和W-135，比例的差異分別為：-0.0397、-0.0452、-0.1092和-0.0562。表B-3:符合方案數(shù)據(jù)分析的初步假設(shè)(PrimaryHypothesis)檢測總結(jié)n：從基線期滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量。N：所使用群體中受試者總數(shù)。Pt和Pm：分別為TetraMenD組和組中接種疫苗后SBA升高≥4倍的受試者比例。表B-3總結(jié)了接種后28天SBA抗體滴度≥32的受試者的比例。表B-3：接種后28天SBA-BR抗體滴度≥32的受試者的百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：n/N。n：接種后28天滴度≥32的受試者數(shù)量。N：本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數(shù)。表B-4總結(jié)了接種后28天SBA-BR抗體滴度≥128的受試者比例。表B-4：接種后28天SBA-BR抗體滴度≥128的受試者的百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：n/N。n：接種后28天滴度≥128的受試者數(shù)量。N：本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數(shù)。SBA-BR抗體滴度至少升高4倍的受試者比例表B-5顯示了接種后28天和6個月時SBA抗體滴度較基線期升高≥4倍的受試者比例。在接種TetraMenD28-56天內(nèi)，大多數(shù)受試者經(jīng)歷了針對疫苗所含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度升高≥4倍。表B-5：接種后28天和6個月時SBA-BR抗體滴度較基線期升高≥4倍的受試者的百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：n/N。n：較基線期升高≥4倍的受試者數(shù)量。N：所使用群體中受試者總數(shù)。在0天檢測不到滴度(<8)而在接種后28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例在兩個處理組中并且對于所有疫苗血清群，在基線期檢測不到SBA-BR滴度(<8)的受試者中的大部分在28天時SBA滴度升高≥4倍(表B-6)。在TetraMenD組中，在0天檢測不到滴度(<8)而在28天時SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者比例為86.21％-98.57％；在組，比例為75.00-94.64％。表B-6：在0天檢測不到滴度(<8)而在接種后28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的數(shù)量和比例*n：每一血清群中在0天時滴度<8而在28天時滴度≥32的受試者數(shù)量。N：每一血清群中在0天時滴度<8的受試者數(shù)量。百分比的精確95％置信區(qū)間。SBA-BR抗體的GMT和升高的平均倍數(shù)表B-7顯示了基線期、接種后28天和6個月時SBAGMT以及SBAGMT升高的倍數(shù)。表B-7：基線期、接種后28天和6個月時SBA-BR血清學(xué)結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表B-7)*滴度或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時的滴度/0天時的滴度。N：計算所用的受試者總數(shù)。血清群A、C、W-135和Y的IgG的ELISA結(jié)果表B-8顯示了基線期、接種后28天和6個月時IgGGMC值以及IgGGMC的升高倍數(shù)。表B-8：基線期、接種后28天和6個月的IgG血清學(xué)結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表B-8)*滴度或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時的滴度/0天時的滴度N：計算所用的受試者總數(shù)。接種本研究疫苗TetraMenD后28-56天，大多數(shù)受試者對于疫苗所包含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度均升高≥4倍?？傮w來說，有77％的TetraMenD接種者表現(xiàn)為抗所有血清群抗體滴度均升高4倍。血清群Y的接種前抗體水平高于血清群C或W-135。這可能與這樣一種事實相關(guān)，即受試者在此階段天然暴露于血清群Y比先前預(yù)想的更普遍。較高的循環(huán)抗體水平反映了近期天然暴露的情況，并可能降低了呈現(xiàn)為抗體反應(yīng)升高4倍或更高的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比，這種現(xiàn)象明顯出現(xiàn)于血清群Y反應(yīng)中。血清群Y受試者抗體滴度呈現(xiàn)4倍升高的比例是56.6％，而血清群C是73.4％，血清群A是87.7％，血清群W-135是91.0％。高接種前抗體水平的現(xiàn)象也可以見于血清群A。這可能是受試者長時間間斷性暴露于各種天然存在的交叉反應(yīng)抗原的結(jié)果。為了進一步評價預(yù)先存在的抗體滴度的影響并研究血清陽轉(zhuǎn)率(定義為：對于任何血清群接種前抗體滴度<1:8，而接種后抗體呈現(xiàn)4倍升高的受試者比例)，對接種疫苗所包含的4種血清群中任何一種血清群的接種前抗體滴度<1:8的受試者進行單獨分析。在以幼兔作為補體來源的SBA測定法中<1:8的抗體滴度被認為是循環(huán)抗體為不可檢測水平。當用這種標準來評價受試者時，可見接種TetraMenD后，對于血清群A血清陽轉(zhuǎn)率為98.6％，對于血清群C為87.9％，對于血清群W-135為96.0％，并且對于血清群Y為86.2％。根據(jù)對軍隊新兵的檢查結(jié)果，Goldschneider提出，使用人補體來源的SBA測定法中≥1:4的最小抗體滴度與抗血清群C侵襲性疾病的保護作用相關(guān)聯(lián)。但是，由于測定標準化的需要以及缺乏可靠的人補體來源，所以建議將幼兔補體作為備選來源?？雌饋砟X膜炎球菌對幼兔補體比對人補體更敏感，這導(dǎo)致檢測出更高的抗體滴度。一些作者建議，在使用幼兔補體的SBA測定中，≥1:128的滴度預(yù)示著具有保護作用，而<1:8的滴度預(yù)示著至少對血清群C易感。盡管這種水平對于評價多糖疫苗是合適的，但是可能并不適用于綴合疫苗。Borrow建議，在接種單價C綴合疫苗并且接種后SBA滴度在8-64之間的受試者中，如果用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗接種幾個月后證實產(chǎn)生了記憶應(yīng)答，則表明這些個體同樣也受到了保護，抗體水平達到≥1:128。對于接種TetraMenD疫苗并且針對每一血清群的SBA-BR滴度≥1:128的受試者的結(jié)果列于表中。當對疫苗所包含每一血清群使用這些標準時，總體來說，接種TetraMenD且接種后SBA-BR滴度≥1:32的受試者占96.2％，滴度≥1:128的占90.5％。此臨床研究中的一部分血清也用于評價使用幼兔補體和人補體的SBA測定法間的關(guān)聯(lián)，并且結(jié)果在隨后的研究中提供。在組中抗血清群C、Y和W-135的總的IgG反應(yīng)明顯高于接種TetraMenD組。但是，在TetraMenD組中抗血清群A、C、Y和W-135的接種后SBAGMT水平明顯較高。表B-9提供了各血清群的GMC和GMT滴度的比較。表B-9各血清群IgGGMC和SBAGMT滴度的對比綴合疫苗誘導(dǎo)的較低水平的IgG產(chǎn)生了比多糖疫苗更高的殺菌活性，此現(xiàn)象強有力地表明綴合疫苗抗體反應(yīng)的質(zhì)量和親和性優(yōu)于非綴合多糖疫苗產(chǎn)生的抗體。高親和性抗體與功能活性和記憶應(yīng)答相關(guān)。這種效應(yīng)在一些已公開的研究中也可以見到。這些資料證實TetraMenD在2-10歲的兒童中具有高度的免疫原性，對于四個血清群中的每一個，在TetraMenD組中所觀察到的GMT均優(yōu)于Menomune組，并且所達到的滴度預(yù)示著存在保護作用。最后，看來TetraMenD產(chǎn)生了針對疫苗所包含每一血清群的較高親和性的抗體反應(yīng)。本試驗過程中，在4個特異時間點監(jiān)測了安全性：報告即刻反應(yīng)(接種后30分鐘內(nèi))、接種后第一個7天內(nèi)的誘發(fā)局部和全身反應(yīng)、接種后28天的時間內(nèi)所有不良事件以及接種后0天至6個月間的持續(xù)AE(0-28天)和嚴重不良事件。對于所有的受試者，兩個處理組中所報告的大多數(shù)局部誘發(fā)反應(yīng)(LocalSolicitedReaction)是輕微的并且可以在接種3天內(nèi)恢復(fù)。對于每一處理組局部反應(yīng)的發(fā)生頻率是相似的。在接受TetraMenD的組中58.8％的受試者報告有至少1種局部反應(yīng)，而在接受的組中58.3％的受試者有同樣的反應(yīng)。此外，對青少年肌肉注射單價CCRM197綴合疫苗出現(xiàn)局部反應(yīng)的比例與本研究中接種TetraMenD出現(xiàn)局部反應(yīng)的比例非常相似。大多數(shù)所報告AE是不嚴重的、可逆的并且與疫苗無關(guān)。本研究中沒有報告新發(fā)支氣管哮喘、糖尿病或自身免疫病。實施例12.研究C-對11-18歲的兒童進行1個月的研究研究C是對11-18歲的健康兒童進行的隨機的、具有陽性對照的研究，對在0天接受單一劑量的TetraMenD和單一劑量的的兒童進行比較。分別在0天即接種前和28天抽取血清并分析，如結(jié)果中所描述對來自病人血清的一部分進行進一步評價。對于所有的受試者，兩個處理組中所報告的大多數(shù)局部誘發(fā)反應(yīng)是輕微的并且可以在接種2天內(nèi)恢復(fù)。在接受TetraMenD的組的局部反應(yīng)頻率(72.4％)比接受的組(34.7％)更普遍。此結(jié)果可能是因為綴合疫苗的性質(zhì)(包含白喉載體蛋白質(zhì))而不是因為施用途徑(采用肌肉注射)造成的。該研究結(jié)果總結(jié)于下表。表C-1顯示了基線期和接種后28天對于每一血清群的SBA-BR抗體滴度的頻率分布。表C-1：0天和接種后28天時SBA-BR抗體滴度的分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表C-1)(續(xù)表C-1)(續(xù)表C-1)表C-2總結(jié)了按照受試者年齡及TetraMenD血清群的GMT水平。表C-2：按照受試者年齡及TetraMenD血清群的GMT的總結(jié)表C-3顯示了從基線期到接種后28天時對于血清群A、C、Y和W-135SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量和百分比。對于每一血清群，在TetraMenD組中的這些百分比高于組。表C-3：從基線期至接種后28天SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量和百分比SBA-BR抗體滴度≥32的頻率接種后28天SBA抗體滴度≥32的受試者的比例總結(jié)于表C-4。表C-4：接種后28天SBA抗體滴度≥32的受試者百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：n/N。n：接種后28天滴度≥32的受試者數(shù)量。N：本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數(shù)。SBA-BR抗體滴度≥128的頻率接種后28天SBA抗體滴度≥128的受試者比例總結(jié)于表C-5。表C-5：接種后28天SBA抗體滴度≥128的受試者百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：表示為百分比的n/N。n：接種后28天滴度≥128的受試者數(shù)量。N：本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數(shù)。SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者百分比表C-6顯示了接種后28天SBA抗體滴度比基線期升高≥4倍的受試者百分比。表C-6：接種后28天SBA抗體滴度比基線期升高≥4倍的受試者百分比和數(shù)量*％：表示為百分比的n/N。n：自基線期滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量。N：所使用群體的受試者總數(shù)。在0天無法檢測到滴度(<8)的受試者中在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者百分比在兩個處理組以及對于所有疫苗血清群，在基線期未檢測到SBA滴度（<8)的受試者中，大部分在28天時SBA滴度升高≥4倍。在0天SBA滴度<8的受試者中，從基線期到28天SBA滴度升高≥4倍的受試者的比例范圍為98.17％-100.0％(表C-7)。表C-7：在0天未檢測到滴度(<8)的受試者中，在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的數(shù)量和百分比*n＝在每一血清群中0天時滴度<8的受試者中，28天時滴度≥32的受試者數(shù)量。N＝在每一血清群中0天時滴度<8的受試者數(shù)量。百分比的精確95％置信區(qū)間SBA-BR抗體GMT和升高的平均倍數(shù)表C-8顯示了基線期和接種后28天的SBAGMT以及SBAGMT升高的倍數(shù)。表C-8：基線期和接種后28天SBA血清學(xué)結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)*滴度或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時滴度/0天時滴度。N：計算所使用受試者總數(shù)。血清群A、C、W-135和Y的IgGELISA結(jié)果表C-9顯示了基線期和接種后28天IgGGMC(μg/mL)以及IgGGMC升高的倍數(shù)。表C-9：基線期和接種后28天的IgG血清學(xué)結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)*滴度或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時滴度/0天時滴度。N：計算所使用受試者總數(shù)。血清群A、C、Y和W-135的IgMELISA結(jié)果表C-10顯示了基線期和接種后28天IgMGMC以及IgMGMC的升高倍數(shù)。表C-10：基線期和接種后28天的IgM血清學(xué)結(jié)果(符合方案數(shù)據(jù)分析)*滴度或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時滴度/0天時滴度。N：計算所使用受試者總數(shù)。接種本研究疫苗TetraMenD后28-56天內(nèi)，大多數(shù)受試者對于疫苗所包含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度均升高≥4倍?？傮w來說，對于所有血清學(xué)，90.7％的TetraMenD接種者的抗體滴度升高4倍。血清群Y的接種前抗體水平比血清群C或W-135的高。這可能與以下事實相關(guān)，即血清群Y是目前與美國該年齡階段侵襲性腦膜炎球菌疾病相關(guān)的最普遍的血清群，并且天然暴露于該血清群可能為更普遍。較高的循環(huán)抗體水平反映了近期天然暴露情況，并可能降低了呈現(xiàn)為4倍或更高抗體反應(yīng)的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比時發(fā)現(xiàn)這似乎是對血清群Y反應(yīng)的情況。對于血清群Y升高4倍的受試者比例是81.8％，而對于血清群C是91.7％，對于血清群W-135是96.7％。高接種前抗體水平的現(xiàn)象也可見于血清群A。這可能是受試者長時間間斷性暴露于多種天然存在的交叉反應(yīng)抗原中的結(jié)果。為了進一步評價預(yù)先存在的抗體滴度的影響并研究血清陽轉(zhuǎn)率(定義為：對于任何血清群接種前抗體滴度<1:8，而接種后抗體呈現(xiàn)4倍升高的受試者比例)，對接種疫苗所包含的4種血清群中任何一種血清群的接種前抗體滴度<1:8的受試者進行單獨分析。在以幼兔作為補體來源的SBA測定法中<1:8的抗體滴度被認為是循環(huán)抗體為不可檢測水平。當用這種標準來評價受試者時，可見接種TetraMenD后，對于血清群A血清陽轉(zhuǎn)率為100％，對于血清群C為98.1％，對于血清群W-135為98.1％，并且對于血清群Y為98.3％。如在另一個研究中中進行的先前的討論一樣，根據(jù)對軍隊新兵的檢查結(jié)果，Goldschneider提出，使用人補體來源的SBA測定法中≥1:4的最小抗體滴度與抗血清群C侵襲性疾病的保護作用相關(guān)聯(lián)。但是，由于測定標準化的需要以及缺乏可靠的人補體來源，所以建議將幼兔補體作為備選來源。看起來腦膜炎球菌對幼兔補體比對人補體更敏感，這導(dǎo)致檢測出更高的抗體滴度。一些作者建議，在使用幼兔補體的SBA測定中，≥1:128的滴度預(yù)示著具有保護作用，而<1:8的滴度預(yù)示著至少對血清群C易感。盡管這種水平對于評價多糖疫苗是合適的，但是可能并不適用于綴合疫苗。Borrow建議，在接種單價C綴合疫苗并且接種后SBA滴度在8-64之間的受試者中，如果用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗接種幾個月后證實產(chǎn)生了記憶應(yīng)答，則表明這些個體同樣也受到了保護，抗體水平達到≥1:128。對于接種TetraMenD疫苗并且針對每一血清群的SBA-BR滴度≥1:128的受試者的結(jié)果列于表中。當對疫苗所包含每一血清群使用這些標準時，總體來說，接種TetraMenD且接種后SBA-BR滴度≥1:128的受試者占99.2％。使用標準ELISA測定法評價了部分受試者的IgG和IgM反應(yīng)。接種后，TetraMenD接種者對每一血清群的IgG抗體平均水平>2μg。在兩個處理組中對每一血清群的IgM反應(yīng)非常相似。對于血清群C、Y和W-135的IgG反應(yīng)，組高于TetraMenD組。然而，接種后對于血清群C、Y和W-135的SBAGMT水平在每一處理組中非常相似，見表C-11。表C-11：IgG和IgM對總的殺菌活性的相對作用*GMC單位是μg/mL綴合疫苗誘導(dǎo)的較低水平的IgG產(chǎn)生了與多糖疫苗相似的殺菌活性，此現(xiàn)象強有力地表明綴合疫苗抗體反應(yīng)的質(zhì)量和親和性優(yōu)于非綴合多糖疫苗產(chǎn)生的抗體。正是高親和性抗體與功能活性和記憶應(yīng)答相關(guān)。這種效應(yīng)在一些已公開的研究中也可以見到。這些資料表明TetraMenD在青少年群體中具有高度的免疫原性。對于兩種疫苗中四個血清群中的每一個，GMT基本上相同，并且所達到的滴度預(yù)示著存在保護作用，并且看起來TetraMenD產(chǎn)生了對疫苗所包含的每一血清群的較高親和性的抗體反應(yīng)。研究D研究D是對18-55歲成人進行的隨機的、具有陽性對照的研究，對在0天接受單一劑量的TetraMenD和單一劑量的的成人進行比較。分別在0天即接種前和28天抽取血清并分析。一般來說，在安全性方面TetraMenD和Menomune是可比的，尤其是已報告的誘發(fā)局部反應(yīng)(0-7天)、誘發(fā)全身反應(yīng)(SolicitedSystemicReaction)(0-天)、非誘發(fā)不良事件(UnsolicitedAdverseEvent)(0-28天)、非誘發(fā)明顯不良事件和SAE(29天-6個月)以及嚴重不良事件(0-6個月)出現(xiàn)的比例都是Menomune的2-3％。本研究結(jié)果提供于下表。SBA-BR抗體滴度的分布表D-1顯示了基線期和接種后28天對于每一血清群的SBA-BR抗體滴度的頻率分布。表D-1：在0天和接種后28天SBA-BR抗體滴度的分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(續(xù)表D-1)表D-2總結(jié)了按照受試者年齡和TetraMenD血清群的滴度幾何均數(shù)(GMT)。表D-2：按照受試者年齡和TetraMenD血清群的GMT總結(jié)(續(xù)表D-2)表D-3顯示了從基線期到接種后28天對于血清群A、C、Y和W-135SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者的數(shù)量和百分比。在TetraMenD組中對于血清群A(1028/1278，80.4％)；C(1131/1278，88.5％)；Y(941/1278，73.6％)和W-135(1142/1278，89.4％)的受試者的數(shù)量和百分比與組中對于血清群A(929/1099，84.5％)；C(985/1099，89.6％)；Y(872/1099，79.3％)和W-135(1036/1099，94.3％)的受試者的數(shù)量和百分比是可比的。表D-3：按照血清群的從基線期SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者的數(shù)量和百分比*檢驗零假設(shè)H0：-PTetraMenD≥0.10對Ha：-PTetraMenD<0.10。n/N：n＝從基線期滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量/N＝符合方案數(shù)據(jù)分析的受試者的總數(shù)。PTetraMenD：TetraMenD組中接種后SBA-BR滴度從基線期升高≥4倍的受試者的百分比?！欤航M中接種后SBA-BR滴度從基線期升高≥4倍的受試者的百分比。SBA-BR抗體滴度≥32的頻率接種后28天SBA-BR抗體滴度≥32的受試者比例總結(jié)于表D-4。表D-4：接種后28天SBA抗體滴度≥32的受試者的百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：n/N。n：接種后28天滴度≥32的受試者數(shù)量/N：該組中具有有效28天血液樣品的受試者總數(shù)。SBA-BR抗體滴度≥128的頻率接種后28天SBA-BR抗體滴度≥128的受試者的比例總結(jié)于表D-5。表D-5：接種后28天SBA抗體滴度≥128的受試者的百分比和數(shù)量(符合方案數(shù)據(jù)分析)*％：n/N。n：接種后28天滴度≥128的受試者數(shù)量。N：該組中具有有效28天血液樣品的受試者總數(shù)。表D-6：通過基線期共變量調(diào)整的GMT對處理效果的分析：從0天到28天滴度差異的反應(yīng)(符合方案數(shù)據(jù)分析)**處理效果的反對數(shù)計算為2的處理效果(-TetraMenD)的乘冪。SBA-BR抗體滴度至少升高≥4倍的受試者的比例表D-7顯示了從基線期至接種后28天SBA抗體滴度較升高≥4倍的受試者的比例。表D-7：從基線期至接種后28天SBA抗體滴度較升高≥4倍的受試者的數(shù)量和百分比*％：n/N。n：從基線期滴度升高≥4倍的受試者數(shù)量。N：每一血清群中抽取血液的受試者數(shù)量。在0天未檢測到滴度(<8)的受試者中，在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例表D-8顯示了在0天未檢測到滴度(<8)的受試者中，在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例。在兩個處理組中并且對于所有的疫苗血清群，在基線期未檢測到滴度(<8)的受試者中的大多數(shù)在28天時SBA滴度升高了≥4倍。在0天滴度<8的受試者中，從基線期至28天SBA滴度升高≥4倍的受試者比例范圍在TetraMenD組中為90.7％-100.0％，并且在組中為96.9％-99.3％。表D-8：在0天未檢測到滴度(<8)的受試者中，在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例*％：n/N。n：在每一血清群中在0天滴度<1:8而在28天滴度≥1:32的受試者數(shù)量。N：在每一血清群中在0天滴度<1:8的受試者數(shù)量。表D-9顯示了基線期和接種后28天SBAGMT以及SBAGMT的升高倍數(shù)。表D-9：按照血清群的抗體滴度幾何均數(shù)(GMT)和GMT升高倍數(shù)的總結(jié)(符合方案數(shù)據(jù)分析)*滴度或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時滴度/0天時滴度。N：每一血清群中抽取血液的受試者數(shù)量。注意：有一個受試者沒有取成第二次血液樣品。根據(jù)正常分布的近似值計算GMT的95％CI。接種本研究疫苗TetraMenD后28-56天內(nèi)，大多數(shù)受試者對于疫苗所包含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度均升高≥4倍。針對血清群A、C、Y和W-135的抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例分別是80.4％、88.5％、73.6％和89.4％。血清群Y的接種前抗體水平比血清群C或W-135的高。這可能與以下事實有關(guān)，即血清群Y是目前與美國該年齡階段侵襲性腦膜炎球菌疾病相關(guān)的最普遍的血清群，并且暴露于該血清群可能為更普遍。較高的循環(huán)抗體水平反映了近期天然暴露情況，并可能降低了呈現(xiàn)為4倍或更高抗體反應(yīng)的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比時發(fā)現(xiàn)這似乎是對血清群Y反應(yīng)的情況。對于血清群Y升高4倍的受試者比例是73.6％，而對于血清群C是88.5％，對于血清群W-135是89.4％。高接種前抗體水平的現(xiàn)象也可見于血清群A。這可能是受試者長時間間斷性暴露于多種天然存在的交叉反應(yīng)抗原中的結(jié)果。為了進一步評價預(yù)先存在的抗體滴度的影響并研究血清陽轉(zhuǎn)率(定義為：對于任何血清群接種前抗體滴度<1:8，而接種后抗體呈現(xiàn)4倍升高的受試者比例)，對接種疫苗所包含的4種血清群中任何一種血清群的接種前抗體滴度<1:8的受試者進行單獨分析。在以幼兔作為補體來源的SBA測定法中<1:8的抗體滴度被認為是循環(huán)抗體為不可檢測水平。當用這種標準來評價受試者時，可見接種TetraMenD后，對于血清群A血清陽轉(zhuǎn)率為100％，對于血清群C為99.4％，對于血清群W-135為96.5％，并且對于血清群Y為90.7％。如在另一個研究中中進行的先前討論一樣，根據(jù)對軍隊新兵的檢查結(jié)果，Goldschneider提出，使用人補體來源的SBA測定法中≥1:4的最小抗體滴度與抗血清群C侵襲性疾病的保護作用相關(guān)聯(lián)。建議將幼兔補體作為備選來源，但是看起來腦膜炎球菌對幼兔補體比對人補體更敏感，這導(dǎo)致檢測出更高的抗體滴度。一些作者建議，在使用幼兔補體的SBA測定中，≥1:128的滴度預(yù)示著具有保護作用，而<1:8的滴度預(yù)示著至少對血清群C易感。盡管這種水平對于評價多糖疫苗是合適的，但是可能并不適用于綴合疫苗。Borrow建議，在接種單價C綴合疫苗并且接種后SBA滴度在8-64之間的受試者中，如果用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗接種幾個月后證實產(chǎn)生了記憶應(yīng)答，則表明這些個體同樣也受到了保護，抗體水平達到≥1:128。當對疫苗所包含每一血清群應(yīng)用這些標準時，在接受TetraMenD的受試者中，接種后針對血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR滴度≥1:128的受試者百分比分別是99.8％、98.7％、96.9％和97.1％。實施例13.研究E-對10-18歲兒童中進行的Td加強免疫研究如通過測定具有針對破傷風(fēng)和白喉滴度的可接受反應(yīng)的受試者的比例，本研究比較了破傷風(fēng)和白喉類毒素(Td)在接受試驗性四價腦膜炎球菌白喉綴合疫苗(即TetraMenD)并伴隨Td的組中的加強反應(yīng)與在接受Td和安慰劑組中的反應(yīng)?？山邮芊磻?yīng)定義為：在接種后28天，從具有預(yù)先定義的低接種前滴度的受試者的基線期值升高至少4倍，和從預(yù)先定義的高接種前滴度的受試者的基線期值升高至少2倍。為了比較TetraMenD和Td一起施用時對血清群A、C、Y和W-135的抗體反應(yīng)與Td疫苗施用后28天再施用TetraMenD中的反應(yīng)，測定了針對每一血清群滴度至少升高4倍的受試者的比例。本實驗是隨機、改良雙盲、陽性對照的多中心試驗，將1024位受試者隨機分成兩個處理組：A和B。在11-17歲的兒童中選擇出作為常規(guī)兒童免疫接種方案一部分將會進行正常Td疫苗免疫的個體。此外，此年齡范圍兒童已經(jīng)被確認為發(fā)展成侵襲性腦膜炎球菌疾病的高危人群，并且將是腦膜炎球菌綴合疫苗一經(jīng)許可后最可能接種的候選人群。為了正確評價疫苗的安全性，采用了一種使用安慰劑作為對照的改進雙盲設(shè)計。第一次隨訪時，注射疫苗的護士是非盲的，根據(jù)方案施用于每一手臂；TetraMenD(IM)或安慰劑接種于右臂，Td接種于左臂。第二次隨訪時，每一處理組均左臂接種。檢測局部和全身反應(yīng)和不良事件的評價護士是不知情的。在11-17歲的兒童中選擇出作為常規(guī)兒童免疫接種方案一部分將會進行正常Td疫苗免疫的個體。此外，此年齡范圍兒童已經(jīng)被確認為發(fā)展成侵襲性腦膜炎球菌疾病的高危人群，并且將是腦膜炎球菌綴合疫苗一經(jīng)許可后最可能接種的候選人群。在接種前0天(基線期)和第1次接種后28天，抽取用于血清學(xué)測試的血液樣品(至少5mL全血)。在第二次隨訪后28天從受試者第3次抽血。測試每一時間點血清中的腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135、抗白喉抗體以及抗破傷風(fēng)抗體。為了評價TetraMenD接種者的抗體功能，對所有可得樣品進行針對每一疫苗血清群的利用幼兔補體的SBA(SBA-BR)測定分析。一個免疫學(xué)的判定終點是每一處理組中SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者比例。通過測試血清保護Vero細胞免受白喉毒素攻擊的能力來測定抗白喉抗體的水平。通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定抗破傷風(fēng)抗體的水平。本研究通過檢測GMT值，比較了兩組受試者對TetraMenD血清群A、C、Y和W-135的抗體反應(yīng)，一組來自前面的研究即研究C，其中受試者接受一次劑量的TetraMenD，另一組為接種Td的同時以及28天后施用TetraMenD的受試者。用于血清學(xué)分析的血清樣品取自接種前基線期(0天)、接種后28天(窗口期(window)：+28天)和6個月。在接種前以及接種后28天檢測針對破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素(Td)疫苗的抗體滴度。測定所有可得接種前和接種后28天血液樣品中抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR抗體滴度?？傮w上，組A和組B的安全性是可比的。研究結(jié)果總結(jié)于下表。表E-1：按照受試者年齡和血清群的GMT水平總結(jié)表E-2顯示了在28天破傷風(fēng)和白喉抗體升高至少4倍或2倍的受試者的數(shù)量和比例。表E-2：在28天破傷風(fēng)和白喉抗體升高至少4倍或2倍的受試者的數(shù)量和比例抗破傷風(fēng)和白喉抗體滴度和抗血清群A、C、Y和W-135的SBA抗體滴度表E-2顯示了在28天時抗破傷風(fēng)和白喉抗體升高至少4倍或2倍的受試者的數(shù)量和比例。對于破傷風(fēng)和白喉比例的差異分別為2.78和-2.73。表E-2：接種破傷風(fēng)和白喉疫苗后28天破傷風(fēng)和白喉抗體反應(yīng)升高至少4倍或2倍的受試者總數(shù)和比例，初步假設(shè)1(符合方案數(shù)據(jù)分析)表E-3顯示了28天時抗血清群A、C、Y和W-135的抗體滴度升高至少4倍的受試者的數(shù)量和比例。表E-3：在接種TetraMenD后28天SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者的數(shù)量和比例，初步假設(shè)2(符合方案數(shù)據(jù)分析)表E-4顯示了在基線期具有高的白喉和破傷風(fēng)滴度的受試者的數(shù)量以及在28天時滴度升高2倍的受試者的數(shù)量和比例。表E-4：在基線期具有高的白喉和破傷風(fēng)接種前滴度受試者的數(shù)量(％)以及在28天時滴度升高2倍的受試者的數(shù)量和比例，符合方案數(shù)據(jù)分析表E-5顯示了在基線期具有低的白喉和破傷風(fēng)滴度的受試者的數(shù)量以及在28天時滴度升高4倍的受試者的數(shù)量和比例。表E-5：在基線期具有低的白喉和破傷風(fēng)接種前滴度受試者的數(shù)量(％)以及在28天時滴度升高2倍的受試者的數(shù)量和比例，符合方案數(shù)據(jù)分析表E-6顯示了伴隨TetraMenD或安慰劑進行破傷風(fēng)和白喉疫苗接種后28天，破傷風(fēng)和白喉抗體滴度≥1.0IU/ml的受試者的數(shù)量和比例。表E-6：接種破傷風(fēng)和白喉疫苗后28天，破傷風(fēng)和白喉抗體滴度≥1.0IU/ml的受試者的數(shù)量和比例，(符合方案數(shù)據(jù)分析)表E-7顯示了在破傷風(fēng)和白喉疫苗接種(伴隨TetraMenD或安慰劑施用)后28天，抗破傷風(fēng)和白喉抗體滴度的幾何均數(shù)(GMT)。表E-7：在破傷風(fēng)和白喉疫苗接種后28天，抗破傷風(fēng)和白喉抗體滴度的幾何均數(shù)(GMT)比較，(符合方案數(shù)據(jù)分析)[1]表E-8顯示了接種TetraMenD后28天，抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR抗體滴度的幾何均數(shù)(GMT)。對于血清群A、C、Y和W-135GMT比率分別是0.92、0.42、0.39和0.32。表E-8：在接種TetraMenD后28天，SBA-BR抗體滴度的幾何均數(shù)(GMT)的比較，(符合方案數(shù)據(jù)分析)[1]表E-9顯示了在Td+TetraMenD，安慰劑組接種TetraMenD后28天抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR抗體滴度的幾何均數(shù)(GMT)和研究MTA02中的相應(yīng)結(jié)果。對于血清群A、C、Y和W-135的GMT比率分別是0.48、0.38、0.34和0.39。表E-9：在Td+TetraMenD，安慰劑組中接種TetraMenD后28天SBA-BR的抗體滴度幾何均數(shù)(GMT)與研究C中相應(yīng)結(jié)果的比較，(符合方案數(shù)據(jù)分析)表E-10顯示了在Td+安慰劑，TetraMenD組接種TetraMenD后28天抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR的抗體滴度幾何均數(shù)(GMT)和研究MTA02中的相應(yīng)結(jié)果。對于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分別是0.53、0.90、0.99和1.05。表E-10：在組B中接種TetraMenD后28天SBA-BR抗體滴度的幾何均數(shù)(GMT)與研究C中相應(yīng)結(jié)果的比較，觀察假設(shè)(ObservationalHypothesis)(符合方案數(shù)據(jù)分析)[1]表E-11顯示了符合方案數(shù)據(jù)分析中按照血清群的接種TetraMenD后0天和28天SBA-BR抗體滴度分布(SBA-BR滴度從<8至1024)。表E-11：按照血清群的接種TetraMenD后0天和28天SBA-BR抗體滴度的分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(SBA-BR滴度從<8至1024)表E-12顯示了符合方案數(shù)據(jù)分析中按照血清群的接種TetraMenD后0天和28天SBA-BR抗體滴度分布(SBA-BR滴度從2048至524288)。表E-12：根據(jù)血清群的接種TetraMenD后0天和28天SBA-BR抗體滴度的分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)(SBA-BR滴度從2048至524288)表E-13：抗體滴度的總結(jié)：破傷風(fēng)和白喉滴度的分布(符合方案數(shù)據(jù)分析)[1]為了取得與許可的Td疫苗伴隨施用的MCV-4疫苗的安全性和免疫原性，在健康的10-17歲青少年中開展了相關(guān)性研究。簡而言之，在多中心隨機試驗中，對健康的10-17歲(平均年齡12.9歲)青少年同時(n＝509)或者在分開一個月的不同隨訪時(n＝512)接種TetraMenD(MCV-4)+Td。在接種后8天和28天對分別接種和伴隨接種的兩種疫苗進行安全性評價。通過抗白喉和破傷風(fēng)的抗體滴度以及抗腦膜炎球菌血清群的血清殺菌活性(SBA)來評價接種前和接種4周后的免疫反應(yīng)。單獨接種Td的受試者的安全性方面與接種Td+TetraMenD的受試者的安全性方面相似。Td+TetraMenD伴隨施用不干擾對破傷風(fēng)或者白喉類毒素的免疫應(yīng)答。對四種血清群的SBA反應(yīng)總結(jié)于下表E-14。表E-14：對四種血清群的SBA反應(yīng)本研究顯示同時施用Td和TetraMenD是安全的，所測試受試者耐受性良好。伴隨施用TetraMenD+Td不會對針對破傷風(fēng)和白喉類毒素的免疫應(yīng)答產(chǎn)生不利影響。MCV-4與Td同時施用可以增強對血清群C、Y和W135多糖的免疫應(yīng)答。本研究中所觀察到的增強免疫應(yīng)答是令人驚訝和意料之外的。實施例14.對使用幼兔補體和使用人補體的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、W-135和Y血清殺菌力測定的比較來自研究A中III期臨床試驗的一部分血清樣品用于本研究，以便將抗血清群C、W-135和Y的SBA-BR滴度結(jié)果與SBA-HC滴度結(jié)果進行比較。本試驗中登記的受試者年齡至少為2歲但還不到11歲，而且將每位受試者隨機指定為兩個疫苗接種組之一。在基線期(接種疫苗前)和接種后28天從每位受試者抽取大約5mL全血。在收集后4小時內(nèi)，將來自受試者的血液樣品離心。從血凝塊中取出血清，轉(zhuǎn)移至標記好的冷凍管并貯存于-20℃或更冷的溫控冰箱中。本報告分析中使用的所有血液樣品均來自在臨床研究中登記的第一批受試者的雙份血清，并且具有足夠的體積以完成全部計劃測試。除了一個樣品來自4歲的受試者以外，其余所有樣品均來自2歲至3歲的受試者。有兩個受試者為意向性分析類(intent-to-treatcategory)。其中一個來自TetraMenD疫苗接種組(接種后28天的血液樣品在24天時就收集了)，另一個來自疫苗接種組(接種后28天的血液樣品在9天時就收集了)。提前篩選出適于每一血清群特異性分析的幼兔補體(ClinicalSystemsLLC，BrownDeer，WI，產(chǎn)品編號31038)。適宜性標準包括：與使用先前合格批次的家兔補體對所定義部分的血清樣品(兩倍稀釋內(nèi))進行的SBA-BR檢測結(jié)果相一致。也可以使用滿足對參考血清和對照樣品的預(yù)先確定滴度的標準。將2.5ml兔補體的等分試樣貯存于-70℃或溫度更低直至準備分析。將等分試樣融化一次使用然后丟棄。為了鑒定能夠用于SBA-H的補體源，通過ELISA篩選所登記受試者血清的抗腦膜炎球菌多糖的IgG和IgM水平，并用SBA-BR測試功能性抗體。選擇人類來源補體所確定標準如下：(1)當使用SBA-BR測定法測定時缺乏可檢測的抗體；(2)當在測定法中用作補體源時缺乏內(nèi)在的殺菌活性；(3)當在一組陰性對照中用作補體源時得出的結(jié)果是可以接受的，其中使用RayBorrow博士在獨立的外部實驗室確定的先前具有陰性測試結(jié)果的血清，和(4)在一組24個樣品中的再現(xiàn)性可以接受。用于每一血清群特異性測定法中的外源性補體源來自不同的受試者。沒有一種補體來源用于一種以上血清群的測定法。同樣，在SBA測定法中使用的三個補體源中，對于每一血清群使用來自單一供體的補體源。血清群C來自具有可接受的低ELISA值(對于IgG和IgM都小于0.5μg/ml)的幾個受試者的血清用來證明殺菌活性。血清群Y用于血清群YSBA-H的補體源選自收集方案中登記的受試者。來自補體的血清通過ELISA顯示為低水平的血清群YIgG和IgM抗體，并且在SBA-BR測定中是陰性的。當該來源的血清用于SBA中時沒有內(nèi)在殺菌活性。血清群W-135用于血清群W-135SBA-H的補體源選自收集方案中登記的受試者。來自補體源的血清通過ELISA顯示為低水平的血清群W-135IgG和IgM抗體，并且在SBA-BR測定中是陰性的。當該來源的血清用于SBA中時沒有內(nèi)在殺菌活性。血清殺菌了測定簡而言之，腦膜炎球菌血清群C、Y和W-135菌株來自美國疾病控制中心,Atlanta,GA(CDC)。由剛剛?cè)诨难迦篊、Y和W-135的工作種子批制備用于測定的細菌靶菌株。每管劃線接種于一個ThayerMartin平板，于37℃±0.5℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜。第二天，用無菌拭子挑取單個菌落，并接種于已預(yù)熱至室溫的新鮮ThayerMartin平板的整個表面。將平板于37℃±0.5℃、5％CO2培養(yǎng)4小時，以獲取細菌生長匯合后形成的亮的菌幕，用無菌拭子收集后懸浮培養(yǎng)于DulbeccosPBS+0.1％葡萄糖緩沖液中達到規(guī)定的光密度(600nm處的吸光度)。用DulbeccosPBS+0.1％葡萄糖緩沖液制備規(guī)定濃度細菌的工作液，工作液須維持于室溫且在制備后30分鐘內(nèi)使用。將測試血清樣品于56℃熱處理30分鐘以失活內(nèi)源性補體。向96孔微量滴定板的所有孔中加入DulbeccosPBS+0.1％葡萄糖緩沖液，然后將測試血清以連續(xù)倍比稀釋分配于板內(nèi)，留下最后兩列孔作為補體和血清對照孔。每塊板中包括一個補體列([第11列]-血清/+補體)和一個血清對照列([第12列]+血清/-補體)。將剛剛?cè)诨难a體與工作濃度的細菌混合，并將混合物分別加入微量滴定板除血清對照孔之外的所有孔中。將未添加補體的細菌加入到血清對照孔中。蓋上滴定板并置于板振蕩器上振蕩1分鐘，然后轉(zhuǎn)移至37℃±0.5℃的CO2培養(yǎng)箱。對于血清群A測定，培養(yǎng)時間是90分鐘，而對于血清群C、Y和W-135測定，培養(yǎng)時間是60分鐘。培養(yǎng)后，向所有孔中小心加入100μl50℃±1℃的瓊脂糖覆層培養(yǎng)基，避免產(chǎn)生氣泡。在室溫中將微量滴定板蓋板微微敞開(避免形成水蒸汽)放置10分鐘后，蓋上蓋板并轉(zhuǎn)移到干的(沒有額外的濕氣)5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃±0.5℃條件下培養(yǎng)20±4小時。此次培養(yǎng)后，計數(shù)每孔中細菌菌落的數(shù)量。計算出補體對照孔中的每孔菌落的平均數(shù)，并除以2得到T0時的50％生存率。每一未知血清的殺菌滴度表示為與T0時50％生存率相比較達到≥50％致死的最終倒數(shù)型血清稀釋度。在SBA-BR中，樣品的起始稀釋倍數(shù)為1:8。對于SBA-H，如原始測定法中所述，樣品的起始稀釋倍數(shù)低至1:4。將文中描述的用于血清群A測定的SBA-BR方法與標準的SBA方法(CDC)和ManchesterPublicHealthLaboratoryServices，MeningococcalReferenceUnit，Manchester，UK所執(zhí)行的SBA方法(PHLS)進行比較，并列于表14-1。表14-1：血清殺菌力試驗方法的比較參考血清(CDC供體-R21654-3430107)從CDC的GeorgeCarlone博士得到，為瓶裝的凍干粉末，貯存于2℃至8℃直至使用。需要時，將每瓶粉末用0.5ml無菌水再水化，并以100μl的等分試樣工作液貯存于-80℃至-40℃。在這些條件下重新配制的參考血清的滴度是1:256±1，這是血清群A、C、Y和W-135的標準化SBA-BR中的兩倍稀釋液。在每天測定中的一組板中的不同板中對參考血清測定兩次。對于血清群A、C、Y和W-135的群特異兔抗血清從Difco購得，為瓶裝凍干粉末，使用前貯存于2℃至8℃。需要時，將每瓶粉末用1ml無菌水再水化，并以50μl的等分試樣貯存于-80℃至-40℃，以用作SBA中的質(zhì)量控制樣品的。為了確定臨床血液樣品中補體介導(dǎo)的對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、Y和W-135的抗多糖殺菌活性，文中提供了使用幼兔補體的血清殺菌力試驗(SBA-BR)結(jié)果，該結(jié)果在精度、稀釋度(線性)、特異性和檢測限是完全有效的。為了建立測定法的精度，使用同一批血清樣品在連續(xù)的5天內(nèi)重復(fù)進行SBA-H測定(對于血清群C)。SBA-BR敏感性和特異性的計算使用1:4和1:8的SBA-H基準滴度將從SBA-BR中得到的滴度分成真陽性(TP)(和假陽性[FP])和真陰性(TN)(和假陰性[FN])。敏感性按照TP/(TP+FN)來計算，特異性按照TN/(TN+FP)來計算。這些計算結(jié)果均用百分數(shù)來表示。SBA-BR對SBA-H的SBA滴度分布的比較表1和表4顯示了對于血清群C的免疫接種前和免疫接種后28天的SBA滴度，表2和表5顯示了對于血清群Y的免疫接種前和免疫接種后28天的SBA滴度，表3和表6顯示了對于血清群W-135的免疫接種前和免疫接種后28天的SBA滴度。在下面的分部分中總結(jié)了通過比較來自兩種補體源(BR和H)的測定結(jié)果對免疫接種前和免疫接種后SBA滴度的分析。血清群C的SBA滴度分布在101個免疫接種前血清樣品中，有63個為如下所定義的陰性，該定義即具有<1:4的SBA-H滴度和<1:8的SBA-BR滴度。有27個免疫接種前樣品用SBA-H測定時是陰性的(<1:4)，但用SBA-BR測定時是陽性的(≥1:8)。使用<1:8的SBA-BR截斷滴度(cutofftiter)的假陽性率為30％。在較高的SBA-BR截斷滴度時假陽性率降低了，在1:128的截斷滴度時假陽性率小于20％并且在1:512的截斷滴度時假陽性率小于10％。有7樣品為SBA-H測定陽性(≥1:4)而SBA-BR測定陰性(<1:8)。在免疫接種后血清中，48個樣品為SBA-H測定陰性，但通過SBA-BR測定時僅有11個為陰性。SBA-BR測定為陰性的11個樣品中，有3個為SBA-H測定陽性。在綴合疫苗接種組中的51個免疫接種后樣品中有17個(32％)為SBA-H測定陰性，但SBA-BR測定陽性(≥1:8)。對于多糖疫苗接種組，50個免疫接種后樣品中有23個(46％)為SBA-H測定陰性，但SBA-BR滴度測定陽性(≥1:8)。根據(jù)免疫接種后血清的陽性反應(yīng)，101個樣品中有90個(89％)為SBA-BR測定陽性(≥1:8)，但是只有53個(52％)為SBA-H測定陽性(≥1:4)。當比較來自兩個疫苗接種組的SBA滴度(BR對H)時，發(fā)現(xiàn)它們的陽性反應(yīng)率具有明顯差異。對于綴合疫苗接種組中的51個免疫接種后樣品，有33個(65％)為SBA-H測定陽性(≥1:4)且SBA-BR測定陽性(≥1:8)。當SBA-BR滴度閾值(thresholdtiter)為≥1:64或更高時，則改善了SBA滴度間(BR對H)一致性。在多糖疫苗接種組中的50個樣品中，有17個(34％)為SBA-H測定陽性(≥1:4)且SBA-BR測定陽性(≥1:8)。當SBA-BR滴度閾值為≥1:512或更高時，則改善了SBA滴度間(BR對H)的一致性。血清群Y的SBA滴度分布與血清群C免疫接種前血清不同，僅有9個血清群Y免疫接種前樣品為如下所定義的陰性，該定義即具有<1:4的SBA-H滴度和<1:8的SBA-BR滴度。在61個免疫接種前樣品中，有52個為SBA-H測定陰性(<1:4)但SBA-BR測定陽性(≥1:8)。使用<1:8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率為85％。在較高的SBA-BR截斷滴度時假陽性率降低了，在1:256的截斷滴度時假陽性率小于15％并且在1:512的截斷滴度時假陽性率小于2％。2個樣品為SBA-H測定陽性(≥1:4)但SBA-BR測定陰性(<1:8)。在免疫接種后血清樣品中，沒有一個是SBA-H滴度<1:4且SBA-BR滴度<1:8。19個樣品通過SBA-H測定為陰性(<1:4)但為SBA-BR測定陽性(≥1:8)。如對于血清群C所指出，假陰性結(jié)果的比例是有差異的。在綴合疫苗接種組中，48個樣品中有5個(9％)為SBA-H測定陰性(<1:4)但為SBA-BR測定陽性。在多糖疫苗接種組中，52個樣品中有14個(27％)為SBA-H測定陰性(<1:4)但為SBA-BR測定陽性。對于血清群Y免疫接種后血清的陽性反應(yīng)，兩個SBA滴度(BR對H)具有良好的一致性。對于100個總樣品中，所有100個免疫接種后樣品為SBA-BR滴度≥1:8，并且有81個樣品的SBA-H滴度≥1:4。如對于血清組C的SBA反應(yīng)中所指出，與多糖疫苗接種組的SBA滴度(RB對H)相比，綴合疫苗接種組的SBA滴度(RB對H)間具有較好的相關(guān)性。在綴合疫苗接種組的48個免疫接種后樣品中，有43個(90％)為SBA-H測定陽性(≥1:4)且SBA-BR測定陽性(≥1:8)。在48個樣品中只有一個樣品的SBA-BR滴度小于1:32，且該樣品為SBA-H測定陽性(≥1:4)。在多糖疫苗接種組中，SBA滴度間(BR對H)的一致性不好。在52個免疫接種后樣品中，只有38個樣品(73％)的SBA-H滴度≥1:4且SBA-BR滴度≥1:8。在SBA-BR滴度≥1:128時，多糖疫苗接種組中免疫接種后血清的SBA滴度間(BR對H)一致性得到改善。血清群W-135的SBA滴度分布對于血清群W-135，在100個樣品中有54個(54％)為陰性，其中SBA-H滴度<1:4且SBA-BR滴度<1:8。在81個免疫接種前樣品中，有27個為SBA-H測定陰性(<1:4)但SBA-BR測定陽性(≥1:8)。使用<1:8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率為33％。在較高的SBA-BR截斷滴度時，假陽性率降低了，在1:128的截斷滴度時假陽性率小于15％，并且在1:256的截斷滴度時假陽性率小于5％。11個樣品為SBA-H測定陽性(≥1:4)但為SBA-BR測定陰性(<1:8)。在免疫接種后樣品中，有3個為SBA-H測定陰性(<1:4)且SBA-BR測定陰性(<1:8)。39個免疫接種后樣品為SBA-H測定陰性(<1:4)，但SBA-BR滴度陽性(≥1:8)。在綴合疫苗接種組，47個樣品中有11個(23％)為SBA-H測定陰性但SBA-BR測定陽性。在多糖疫苗接種組，53個樣品中有28個(53％)為SBA-H測定陰性但SBA-BR測定陽性。免疫接種后樣品SBA-BR和SBA-H滴度間一致性與血清群C的相當，但不如血清群Y。如在血清群C和血清群Y中所提到，與比較兩個疫苗接種組時，對于W-135血清群的兩種SBA滴度間(BR對H)一致性有顯著差異。與多糖疫苗接種組相比，綴合疫苗接種組中兩種SBA滴度間(BR對H)一致性較好。在綴合疫苗接種組47個免疫接種后樣品中，有36個(77％)樣品為SBA-H滴度≥1:4，并且全部樣品為SBA-BR測定陽性(≥1:8)。來自綴合疫苗接種組的所有樣品的免疫接種后SBA-BR滴度≥1:32。對于多糖疫苗接種組的免疫接種后樣品滴度，兩種SBA滴度間的相關(guān)性不好，53個樣品中僅有22個樣品(42％)的SBA-H滴度≥1:4并且50個樣品(94％)的SBA-BR滴度≥1:8。表1：對于血清群C，通過SBA-H測定為陽性和陰性血清中的SBA-BR滴度的比較表2：對于血清群Y，通過SBA-H測定為陽性和陰性血清中的SBA-BR滴度比較表3：對于血清群W-135，通過SBA-H測定為陽性和陰性血清中的SBA-BR滴度比較表4：通過SBA-BR和SBA-H測定的血清群C滴度分布的總結(jié)1樣品總數(shù)為101。表5：通過SBA-BR和SBA-H測定的血清群Y滴度分布的總結(jié)1樣品總數(shù)為100。表6：通過SBA-BR和SBA-H測定的血清群W-135滴度分布的總結(jié)1樣品總數(shù)為100。SBA-BR和SBA-H滴度的敏感性和特異性比較在進行兩種滴度的敏感性和特異性評價時，將SBA-BR滴度與SBA-H的保護滴度1:4和1:8進行比較。在該分析中使用了免疫接種前和免疫接種后的兩種血清。使用1:4和1:8的SBA-H基準滴度，計算了對于3個血清組的特異性和敏感性，并總結(jié)于表7、9和10。依次討論對于每一血清組的敏感性和特異性分析。對于血清群C，相對于1:4和1:8的SBA-H滴度，SBA-BR的閾值滴度為1:8、1:16和1:32的敏感性大于80％。但是，這些SBA-BR滴度的特異性低于60％。在1:64的SBA-BR滴度時特異性增加超過60％，在1:128的SBA-BR滴度時特異性超過70％。對于該后兩種SBA-BR滴度，其敏感性開始降低。在1:64的SBA-BR閾值滴度時，敏感性在75和78％之間，但在1:128的SBA-BR滴度時敏感性降至62和65％之間。在SBA-BR滴度>1:64時特異性繼續(xù)增加，范圍分別從1:128時的73％升至1:256時的83％。但是，其敏感性由43％降至低于20％。對于血清群C，在敏感性和特異性間達到最佳平衡的SBA-BR滴度范圍是1:32和1:128之間。本試驗中對于血清群C的敏感性和特異性結(jié)果與SantosGF等人(SantosGF等人，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8:616-623)通過不同組的血清樣品和試劑得到的結(jié)果(表8)是可比的，就Santos的結(jié)果來說，敏感性和特異性達到最好平衡是在SBA-BR滴度1:64和1:128之間，與之相對，兩個SBA-H滴度為1:4和1:8。表7：對于血清群C，在SBA-H保護滴度時SBA-BR滴度的敏感性和特異性表8：如Santos等人，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8:616-623中所報道，對于血清群C，在SBA-H保護滴度時SBA-BR滴度的敏感性和特異性對于血清群Y，當SBA-BR閾值滴度在1:8到1:64的范圍內(nèi)時敏感性最高，但是如所期望的那樣，在更高的SBA-BR閾值滴度時敏感性降低。與血清群C的結(jié)果相比，血清群Y的特異性結(jié)果起始非常低，直到SBA-BR閾值滴度為1:128時，特異性才達到高于50％的水平。對于血清群Y，敏感性和特異性達到最佳平衡的SBA-BR滴度位于1:64和1:256之間的范圍內(nèi)。在1:256時，敏感性降至大約55％，但是特異性從35％左右(mid-30％)升至大約82-83％。表9：對于血清群Y，在SBA-H保護滴度時SBA-BR滴度的敏感性和特異性對于血清群W135，敏感性數(shù)值與血清群C的敏感性數(shù)值更接近，但對于所有三種血清群而言總體模式相同。在SBA-BR閾值滴度為1:8時敏感性以較高的數(shù)值開始，在滴度≥1:128時敏感性降低。同樣，在SBA-BR閾值滴度為1:8時特異性以較低數(shù)值開始，直到滴度為1:256時才突破較低的水平。如對于血清群Y所觀察到的一樣，對于血清群W135，敏感性和特異性達到最佳平衡時的SBA-BR滴度范圍為1:64和1:256之間。表10：對于血清群W-135，在SBA-H保護滴度時SBA-BR滴度的敏感性和特異性表11總結(jié)了相對于免疫接種前SBA-BR滴度，血清群C、Y和W135的使用幼兔補體或人補體的SBA滴度升高4倍的比例。該分析分別在綴合疫苗接種組(TetraMenD)和多糖疫苗接種組()中開展，并且兩組分析示于表11。當比較三個血清群和兩個疫苗接種組中所誘導(dǎo)的殺菌反應(yīng)時，在四倍升高模式中存在一些可觀察到的差異。對于每一血清群和兩個疫苗接種組，依次討論反應(yīng)模式。表11：通過SBA-BR和SBA-H測定的腦膜炎球菌多糖滴度升高4倍的分層比較比率11此表顯示為通過SBA-BR滴度、疫苗和血清群各層次進行的、如每一測定法中所測定(免疫接種前和免疫接種后28天的成對樣品)的SBA滴度升高4倍的比率(和百分比)。對于血清群C，在綴合疫苗接種組中SBA-BR對SBA-H之間升高4倍的受試者比率密切一致。在此疫苗接種組內(nèi)出現(xiàn)這樣一種趨勢，即在低的免疫接種后滴度如1:32-1:128時，SBA-H升高4倍的受試者比率滯后于的SBA-BR升高4倍的受試者比率。但是，當免疫接種后SBA-BR滴度≥1:256時，通過SBA-H測定的達到升高4倍的受試者數(shù)量多于通過SBA-BR測定的達到升高4倍的受試者數(shù)量。通過比較，兩種補體源測定法間升高倍數(shù)的這種差異較小，并且可能是由于較高的免疫接種前SBA-BR滴度改變了達到SBA-BR升高4倍的比率。對于多糖疫苗接種組，SBA-BR對SBA-H之間的升高4倍的比率的一致性不如綴合疫苗接種組那樣相近。同樣，沒有明顯的趨勢顯示在較高的免疫接種后SBA-BR滴度時多糖疫苗接種組的SBA-H的4倍升高的比率比綴合疫苗接種組的更加敏感。對于血清群Y，兩個疫苗接種組中SBA-H和SBA-BR的4倍升高比率之間一致性非常接近。與血清群C的免疫接種后SBA-BR滴度相比，兩個疫苗接種組中的免疫接種后SBA-BR滴度很少有低于1:32的。因為該原因，與血清群C相比，對于血清群Y達到SBA-BR和SBA-H升高4倍的受試者比例出現(xiàn)在較高的免疫接種后SBA-BR滴度。對于血清群Y，在綴合疫苗接種組中當免疫接種后SBA-BR滴度為1:128時，升高4倍的受試者比例增加至≥50％，然而對于血清群C，此時的綴合疫苗接種組的SBA-BR閾值滴度則是1:32。與其它兩種血清群相比，血清群W135的SBA-H和SBA-BR升高4倍的比率之間的一致性不是很接近。如對于血清群Y中所觀察的一樣，在兩個疫苗接種組中只有有限數(shù)量的受試者其免疫接種后SBA-BR滴度小于1:32。在SBA-BR滴度≥1:256時，SBA滴度中升高4倍的比率之間(BR對H)是一致的。如與在血清群C中所提到的一樣，兩個疫苗接種組之間的升高4倍(BR對H)的比例存在差異，這種差異對于血清群Y是不明顯的。與其它兩種血清群多糖疫苗接種組中SBA滴度升高4倍的比率相比，多糖疫苗接種組中血清群W135的SBA滴度(BR對H)中升高4倍的比率間的一致性是最差的。為了測定用許可的四價腦膜炎球菌多糖疫苗()或者用試驗的四價腦膜炎球菌多糖綴合疫苗(TetraMenD)接種的2-3歲受試者中血清樣品的滴度，將使用幼兔補體的血清殺菌力試驗(SBA-BR)與相應(yīng)的使用人補體的血清殺菌力試驗(SBA-H)相比較。用于血清群C、Y和W135的補體源是經(jīng)鑒定的并且用于支持該種SBA比較。使用2種方法分析了來自該比較研究中的SBA結(jié)果。在一種方法中，通過測定兩個疫苗接種組的免疫接種前和免疫接種后滴度得到SBA-BR和SBA-H數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)混合用于分析。在第二種方法中，對來自兩個疫苗接種組的免疫接種前和免疫接種后滴度分別進行分析。該分析的目標之一是描述與陰性SBA-H血清滴度具有最佳相關(guān)性的SBA-BR血清滴度。第二個目標是確定與使用人補體試驗中測定的與對血清群C有保護作用相關(guān)聯(lián)的陽性滴度具有最佳相關(guān)性的使用幼兔補體所測定的滴度，并推斷出對于血清群Y和W135的保護性殺菌滴度。我們實驗室已經(jīng)公布了嘗試建立針對血清群C的SBA-BR相關(guān)聯(lián)的保護性閾值的結(jié)果。本研究的結(jié)果將與那些公布的結(jié)果相比較。最近，對使用兩種補體源所測定的免疫接種前和免疫接種后血清SBA滴度升高4倍的比率進行了比較。僅僅針對血清群C建立了SBA滴度與抵抗疾病的保護作用之間的關(guān)聯(lián)。對于血清群C，與保護作用關(guān)聯(lián)的SBA是在使用人補體的SBA測定中確定的。對于其它血清群，假設(shè)與血清群C中保護作用關(guān)聯(lián)的SBA-H(SBA滴度為1:4)同樣適用。對與血清群C的1:4的SBA滴度相關(guān)聯(lián)的SBA-BR滴度的定義在血清群間是不同的。在定義與陰性SBA-H血清滴度最佳關(guān)聯(lián)的SBA-BR方面，將免疫接種前和免疫接種后血清中<1:8的SBA-BR滴度比作<1:4的SBA-H滴度。所使用的<1:8的SBA-BR滴度是部分地基于WHO/CDC關(guān)于血清群CSBA滴度(BR對H)的比較研究結(jié)果以及最新發(fā)現(xiàn)，即<1:4的SBA-BR滴度與爆發(fā)于英國大學(xué)的血清群C疾病的易感性相關(guān)(Jones，G.R.等人，2000.J.Infect.Dis.181:1172-1175)。根據(jù)本研究得到的SBA滴度(BR對H)，對于血清群C使用<1:8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率為30％。使用較高的SBA-BR截斷滴度可以改善假陽性率，如下：在≥1:16時假陽性率降至26％；在≥1:32時假陽性率降至24％，在≥1:64時假陽性率降至22％，在≥1:128時假陽性率降至18％，在≥1:256時假陽性率降至14％，并且在≥1:512時假陽性率降至2％。升高SBA-BR截斷滴度的確改善了對對應(yīng)于<1:4的SBA-H滴度的陰性滴度定義的準確性，但是當使用較高的SBA-BR截斷滴度時，區(qū)分陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的敏感性則非常低。本報告資料顯示，當截斷滴度為1:8、1:16或1:32時，SBA-BR的敏感性最高(81-84％)。SBA-BR滴度大于1:32時，其敏感性降至80％以下。但是，當截斷滴度為1:8、1:16和1:32時該測定法的特異性為最低，范圍在51-58％之間。在選擇與人補體測定的陰性滴度相關(guān)聯(lián)的截斷滴度時，要在敏感性、特異性和假陽性率之間取得平衡。指定1:32作為SBA-BR截斷滴度將導(dǎo)致無謂地舍棄真陽性應(yīng)答反應(yīng)者。該研究結(jié)果指出，≥1:16的SBA-BR滴度可能是更合適的截斷滴度。根據(jù)WHO/CDC的研究分析(<1:8)和英國大學(xué)的爆發(fā)分析(<1:4)，認為在該滴度之上至少2倍稀釋的滴度是具有保護性的。對于血清群W135和Y的測定法中保護性截斷滴度的確定來自這樣一種假設(shè)：即它們的殺菌抗體保護作用與血清群C疾病的類似并且與對應(yīng)于人補體測定中陰性滴度的殺菌滴度相似。對于血清群Y，使用<1:8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率相當高，達到85％，而對于血清群C為30％。但是，和血清群C一樣，增加SBA-BR截斷滴度可以降低假陽性率。SBA-BR截斷滴度為1:16時假陽性率降至84％，在1:32時假陽性率是75％，在1:64時假陽性率是61％，在1:128時假陽性率是38％，在1:256時假陽性率是13％，并且在1:512時假陽性率是2％。即使血清群Y的假陽性率在開始時比血清群C高很多，但是當截斷滴度≥1:128時，兩種血清群測定中的假陽性率就變得相當接近了。然而，如此高的截斷滴度，可能夸大了陽性反應(yīng)的閾值滴度。根據(jù)敏感性和特異性分析，當SBA-BR截斷滴度為1:8-1:32時敏感性達到最大值，范圍為95-98％。但是，和血清群C一樣，在這些SBA-BR滴度時特異性相應(yīng)地較低，范圍為11-18％。當SBA-BR滴度為次高(1:64)時，敏感性從95％降至88％，但特異性急劇升至35％。在血清群Y測定中<1:64的截斷滴度與人補體測定中的陰性滴度最相當。對于血清群W135，在<1:8的SBA-BR截斷滴度時假陽性率為33％，這與血清群C相似。就像在血清群C和Y中提到的一樣，在較高的SBA-BR截斷滴度時，假陽性率降至較低的水平。當SBA-BR截斷滴度為1:16時假陽性率降至32％，在1:32時假陽性率降至28％，在1:64時假陽性率降至26％，在1:128時假陽性率降至12％，在1:256時假陽性率降至4％，且在1:512時假陽性率降至0％。SBA-BR滴度范圍在1:8-1:64之間時敏感性最高(86％-81％)。如所預(yù)期，在此SBA-BR滴度范圍內(nèi)，特異性最低(46％-52％)。即使血清群W135的假陽性率開始時比血清群Y低很多，但是與人補體測定的陰性滴度最相當?shù)慕財嗟味仁?lt;1:64。對于三個血清群，已經(jīng)確定了對應(yīng)于人補體測定中陰性滴度的滴度，對超過這些水平的SBA-BR滴度進行了作為陽性反應(yīng)的閾值滴度分析。對于血清群C，陽性反應(yīng)的閾值滴度是≥1:16，對于血清群Y，陽性反應(yīng)的閾值滴度是≥1:64，對于血清群W135，陽性反應(yīng)的閾值滴度是≥1:64。對于血清群C來說，≥1:128的SBA-BR閾值滴度提供了良好的保證，即相對于1:4或者1:8的SBA-H滴度達到了保護性滴度并且保護性滴度與血清群C的1:4的有效SBA-H滴度相關(guān)聯(lián)。此閾值滴度與WHO/CDC的有關(guān)血清群C的數(shù)據(jù)集合和Santos的數(shù)據(jù)集合非常相近。就象這兩種研究中提到的那樣，滴度≥1:128高度預(yù)示著具有保護作用，但是SBA-BR滴度小于1:128可能也具有保護性。對于WHO/CDC和Santos的數(shù)據(jù)集合，1:8、1:16、1:32、1:64的SBA-BR滴度被作為不確定滴度。因為文中作為對于血清群C的數(shù)據(jù)集合提到小于1:16的SBA-BR滴度被視為陰性，則該分析中不確定滴度為1:16-1:64，而1:16-1:64的滴度恰恰是另外兩個研究所得到結(jié)果的一個子集。在所有的這些分析中，正是對SBA-BR滴度與二十世紀60年代所收集的天然保護性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的SBA-H滴度(1:4或1:8)進行比較。最近，人們已經(jīng)努力將單價血清群C綴合物在英國的功效數(shù)據(jù)同SBA-BR滴度直接聯(lián)系起來(MillerE，等人，2002，Vaccine20:S58-S67)。在此分析中，發(fā)現(xiàn)≥1:8和≥1:128的SBA-BR滴度與迄今收集的功效數(shù)據(jù)有很好的相關(guān)性，這些數(shù)據(jù)是從接種單一劑量單價血清群C綴合物的15-17歲受試者中得到的結(jié)果。但是，當Miller及其同事對幼兒組(12-30個月)進行同樣的分析時，他們發(fā)現(xiàn)≥1:8的SBA-BR滴度與功效有很好的一致性，但是當SBA-BR滴度≥1:128時沒有如此接近的一致性。Miller于2002年9月1-6日在挪威奧斯陸(Oslo)舉行的第13屆國際致病性奈瑟菌屬(Neisseria)大會上展示了另外的數(shù)據(jù)，其中在接種后一個月達到SBA-BR滴度≥1:64的受試者的預(yù)測效能處于對于該年齡組的所觀察功效的95％置信區(qū)間之外。這些數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點，即1:8-1:64不確定區(qū)域內(nèi)的SBA-BR滴度有助于確保保護作用。根據(jù)該研究分析，1:16-1:64的SBA-BR滴度同樣也有助于確保對于血清群C的保護作用。在血清群Y測定中，在1:64的SBA-BR滴度時特異性僅為35％，但是當截斷滴度升高到1:128和1:256時，特異性分別升高至59％和84％?！?:256的閾值滴度很好地保證了人補體測定中1:4和1:8的保護性滴度。但是，對于血清群Y，在1:128的閾值滴度時，敏感性和特異性達到了較好的平衡。與同SBA-H保護性滴度相關(guān)聯(lián)的血清群C的SBA-BR滴度1:16-1:64的相應(yīng)范圍相比，血清群Y的SBA-BR滴度范圍1:64-1:128代表了滴度的不確定范圍。在血清群W-135測定中，在1:64的SBA-BR滴度時特異性為52％，但是當?shù)味壬叩?:128和1:256時，特異性分別升高至64％和77％。和血清群Y一樣，≥1:256的閾值滴度很好地保證了人補體測定中1:4和1:8的保護性滴度。與血清群Y一樣，當對于血清群W135，閾值滴度為1:128時，敏感性和特異性達到了較好的平衡。與同本研究中SBA-H保護性滴度相關(guān)聯(lián)的血清群C的SBA-BR滴度1:16-1:64的范圍相比，血清群W-135的SBA-BR滴度范圍1:64-1:128代表了滴度的不確定范圍。對于每一血清群計算了殺菌滴度中的4倍升高，并且使用兩種測定法按照疫苗接種組分別進行分析。應(yīng)當指出，對于全部三種血清群在SBA滴度(BR和H)中的4倍升高通常在較高的免疫接種后SBA-BR滴度中檢測到。按照血清群和按照疫苗接種組分析，SBA滴度(BR對H)的4倍升高均不同。對于血清群C，在較低的免疫接種后SBA-BR滴度的情況下，使用人補體測定的升高4倍的受試者比率比使用幼兔補體測定的滴度升高4倍的受試者比率要低。然而，在較高的免疫接種后SBA-BR滴度的情況下，使用人補體測定的4倍升高的受試者比率比較高。該模式似乎表明，在低的免疫接種后SBA-BR滴度時，使用人補體的測定法的敏感性比使用幼兔補體的測定法的敏感性低，但在高的免疫接種后SBA-BR滴度時，情況相反，也就是說，使用人補體的測定法變得更加靈敏。當測定樣品來自多糖疫苗接種組時，這種模式不明顯。當使用人補體的測定法時，這些樣品中滴度升高4倍的受試者比率較低。盡管還無法解釋樣品類型間出現(xiàn)的這種結(jié)果，但這的確表明對于具有較低滴度殺菌活性的血清樣品，使用人補體的測定法缺乏敏感性對于血清群Y，使用兩種補體源進行比較后發(fā)現(xiàn)SBA滴度4倍升高的比率非常一致。與多糖疫苗接種組相比，綴合疫苗接種組中SBA滴度(BR和H)4倍升高的比率稍高，但是這種差異不如血清群C組中的大。對于血清群W135，在兩個疫苗接種組的使用人補體或幼兔補體的SBA滴度升高4倍的比率的一致性不如其它兩種血清群好。在兩個疫苗接種組中SBA-BR滴度4倍升高的情況非常好，但是SBA-H滴度4倍升高的比率比其它兩種血清群低。在多糖疫苗接種組中SBA-H滴度4倍升高的受試者比率相當?shù)?，并且比其它兩種血清群SBA-H滴度4倍升高的比率都要低。使用BR補體的SBA滴度4倍升高已經(jīng)成為注冊腦膜炎球菌多糖疫苗的基準。最近，人們努力將SBA-BR滴度的4倍升高與臨床療效結(jié)合起來，此臨床療效是來自英國對單價血清群C綴合疫苗注冊后的監(jiān)視資料(BorrowR，等人，2001，Infect.Immun.69:1568-1573)。根據(jù)本分析，單價血清群C綴合疫苗對于12-30個月的幼兒的功效在第一次劑量后的16個月內(nèi)估計為88％(69-95％)。對于該年齡組，在單價血清群C綴合疫苗一次劑量之后，達到SBA-BR滴度4倍升高的受試者比例為89-100％。文中提供的SBA-BR資料提供了殺菌滴度值，與使用人補體作為補體源測定法中對于血清群C所獲得的殺菌滴度值具有可比性。因此，這些SBA-BR滴度與最初的研究有關(guān)，最初的研究確定了對血清群C腦膜炎球菌疾病保護性免疫的替代物，并且這些SBA-BR滴度支持對文中提供的保護作用的臨床結(jié)果的外推，并且對于血清群C的SBA-BR滴度與其它實驗室報道的那些結(jié)果是可比的。通過與血清群C模型的類比，使用人補體的SBA在確定針對血清群Y和W-135莢膜多糖的血清群特異性反應(yīng)中的表現(xiàn)支持：用于確定殺菌滴度的SBA-BR與血清群Y和W-135具有關(guān)聯(lián)性。