脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑及制備方法，利用脂肪酸與白蛋白特異性位點(diǎn)之間的高親和力及其穩(wěn)定結(jié)合特性，在高剪切力的作用下制得以脂肪酸為核心的納米粒子，并使“水不溶性”或“水溶性”藥物以“溶液”或“超微納米粒子”形式、一種或幾種“包裹”或“結(jié)合”其中，而獲各型納米粒子混懸液，經(jīng)去除有機(jī)溶劑，除菌，干燥，獲得凍干制劑。本發(fā)明產(chǎn)品僅由白蛋白、藥物和脂肪酸組成，不含任何輔料，具有在體外溶液中和體內(nèi)血液循環(huán)中納米粒子完整性與穩(wěn)定性高，顯著增加富含gp60受體細(xì)胞內(nèi)或腫瘤組織中的藥物含量，顯著提高荷載藥物的LD50和MTD，封閉所“包裹”或“結(jié)合”蛋白的抗原位點(diǎn)等生物學(xué)性質(zhì)。
【專利說明】脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種納米粒子凍干制劑及制備方法，尤其涉及一種脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑及制備方法，屬于醫(yī)藥制備【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]人血清白蛋白(Human Serum Albumin,簡稱HSA)是人血衆(zhòng)中的主要蛋白，是非糖基化蛋白，由585個(gè)氨基酸組成，分子量為66kD。健康人血漿中HSA濃度為35?55g/L，半衰期約為19天。HSA對維持血液膠體滲透壓、組織細(xì)胞的氨基酸與能量代謝、以及脂溶性物質(zhì)如膽紅素、脂肪酸和藥物等的轉(zhuǎn)運(yùn)均具重要作用。HSA來源充足，可由人血中提取所得，也可由基因重組技術(shù)生產(chǎn)，HSA無毒、無免疫原性、代謝機(jī)制清楚，是理想的納米粒子制備材料。而且，早在上世紀(jì)五十年代Babson等@就發(fā)現(xiàn)HSA可聚集在腫瘤組織局部；HSA通過細(xì)胞膜gp60蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，某些腫瘤組織如乳腺癌可特異性表達(dá)SPARC蛋白(secretedprotein, acidic and rich in cysteine),后者促進(jìn)gp60受體對HSA的轉(zhuǎn)運(yùn)作用；有報(bào)道指出白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Albumin-bound pacIitaxeI，Abraxane)在高表達(dá)SPARC蛋白的實(shí)體腫瘤的化療中療效更佳。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,簡稱BSA),是牛血清中的一種主要蛋白，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66kDa，與HSA的氨基酸序列高度同源，且蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似。
[0003]紫杉醇是從天然植物中提取出的、具明顯抗癌作用的雙萜類化合物，通過對微管蛋白的獨(dú)特作用而阻止細(xì)胞有絲分裂和增殖。紫杉醇水溶性很低(水溶解度在0.0005mg/mL)，而紫杉醇經(jīng)過化學(xué)修飾與改造所獲得的半合成多烯紫杉醇更是幾乎不溶于水，除體外抗癌活性提高外，其它理化性質(zhì)與紫杉醇相同。因此，目前臨床上主要應(yīng)用的紫杉醇和多烯紫杉醇靜脈注射劑都添加了大量表面活性劑助溶，如泰素是以紫杉醇添加聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和無水乙醇助溶、多烯紫杉醇采用吐溫_80助溶,而大劑量CremophorEL或吐溫80輸注可導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)等毒副反應(yīng)，甚或明顯限制了化療藥給用藥劑量的提高，也限制了紫杉醇的臨床療效。鑒于此，1997年美國生物科學(xué)有限公司申請的ZL97199720.9 (USP08/720, 756)等系列專利，公布了 “一種不溶于水的藥理活性物質(zhì)，如紫杉醇，以包有白蛋白包衣(作為穩(wěn)定劑)的懸浮顆粒形式輸運(yùn)”;且這種“懸浮顆?！笔窃跊]有表面活性劑和顆粒的聚合物材料存在的情況下，僅由白蛋白與可溶解于有機(jī)溶液中的紫杉醇、在高剪切處理的條件下形成；這種獨(dú)特的輸送系統(tǒng)，有效避免了因添加Cremophor EL或吐溫80等而導(dǎo)致的毒副反應(yīng)，而且，采用這種技術(shù)所開發(fā)出的白蛋白結(jié)合型紫杉醇注射劑(商品名=Abraxane),在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的化療中，取得了明顯優(yōu)于泰素的臨床療效。但是，這種制備白蛋白結(jié)合紫杉醇“懸浮顆?！钡募夹g(shù)(后稱為nab-technology)，僅僅利用了白蛋白疏水區(qū)域與水不溶性藥物(疏水性)的“微弱”結(jié)合力，卻沒有利用同樣可以溶解于有機(jī)溶液中、且可與白蛋白特異性結(jié)合、且結(jié)合力較強(qiáng)的脂肪酸；也沒有利用白蛋白還可與許多水溶性藥物包括蛋白和多肽等結(jié)合的性質(zhì)和功能；更沒有聯(lián)想到因脂肪酸與白蛋白的結(jié)合作為構(gòu)成納米粒子的主要“力量”和成分，使在有機(jī)溶劑中“懸浮”的水溶性藥物超微納米粒子如粒徑小于等于50nm的粒子,也可以形成白蛋白包裹的納米級粒子甚或是小于10nm的納米粒子。因此,前述nab-technology存在明顯的納米粒子形成機(jī)制上的缺陷和應(yīng)用限制。
[0004]脂肪酸(Fatty acids，F(xiàn)A)在哺乳類動(dòng)物的能量代謝、細(xì)胞膜磷脂合成和信號傳導(dǎo)中均具重要作用。但FA的水溶性很低，體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)需FA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而血液中的血清白蛋白(Serum Albumin, SA)是細(xì)胞外液中最主要的FA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。早在上世紀(jì)五十年代，Goodman DS等?就發(fā)現(xiàn):SA分子上有2個(gè)FA的高親和性結(jié)合位點(diǎn)、5個(gè)中等親和性結(jié)合位點(diǎn)和超過20個(gè)低親和性結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)A如油酸鹽(Oleate)高、中、低親和力分別是
1.1X108，4.0 X106andl X 13M+1。SA蛋白結(jié)構(gòu)的研究揭示了 FA的特異性結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合方式，即FA與SA的特異結(jié)合通過結(jié)合位點(diǎn)處堿性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)與脂肪酸羧基之間的“鹽橋”作用(salt bridge interact1ns)而實(shí)現(xiàn)?近年批準(zhǔn)上市的新一代長效胰島素(Insulin Detemir, ID)就是依據(jù)這種游離脂肪酸與SA的特異性結(jié)合性質(zhì)而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的長效藥理作用，ID由肉豆蘧酸(Myristic acid, MA)與胰島素B鏈29位賴氨酸殘基定點(diǎn)偶聯(lián)而成，注射ID后，其分子上的脂肪酸可與血液中的SA特異結(jié)合，從而避免了小分子胰島素在體內(nèi)的快速清除；這同時(shí)證實(shí)，在人體血液循環(huán)和生理?xiàng)l件下，注射保留羧基的脂肪酸胰島素類似物制劑，其脂肪酸分子可與血清白蛋白特異、有效和穩(wěn)定的結(jié)合氣早在上世紀(jì)60?70年代，Spector AA等@在Ehrlich腹水瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞的系列工作證實(shí):腫瘤細(xì)胞可快速攝取游離脂肪酸(FFA)，而作為FFA載體的白蛋白和低密度脂蛋白，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的這種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
[0005]阿霉素(doxorubicin, D)是臨床上重要、常用、廣譜抗癌一線藥,但抗癌療效受限于其對心臟等的毒性；盡管各種納米粒子制備技術(shù)曾經(jīng)應(yīng)用于開發(fā)阿霉素的給藥系統(tǒng)，其中隱形脂質(zhì)體阿霉素(Doxil)納米制劑是最成功的開發(fā)范例之一。Doxil顯著降低了阿霉素的心臟毒性，但其療效并未因此而顯著提高；這也是“隱形脂質(zhì)體”技術(shù)并未廣泛應(yīng)用于其它抗癌藥的原因之一。阿霉素是水溶性化療藥，在一定條件下可與HSA結(jié)合，Langer等?曾利用此性質(zhì)制備以化學(xué)交聯(lián)的HSA作為基架的納米粒子，但該種納米粒子的粒徑較大(大于250nm)、載藥量較低、化學(xué)交聯(lián)的白蛋白納米粒子難以白蛋白單分子形式通過gp60受體轉(zhuǎn)運(yùn)等。表阿霉素(EpirUbicin，EP)是通過半合成途徑合成的一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，與阿霉素的區(qū)別僅在氨基糖部分4’位的羥基由順式變成反式，這種立體結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化并未影響其理化性質(zhì)，故本專利所涉及的阿霉素納米粒子的制備方法同樣可以適用于表阿霉素。
[0006]假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A, PE)具極強(qiáng)的細(xì)胞毒性,與抗腫瘤特異性抗體融合，而成所謂immunotoxin (免疫毒素，IT)，是治療惡性腫瘤和白血病的特異性靶向藥物，被稱為“生物導(dǎo)彈”，其中一種稱為PE38的假單胞菌外毒素(PE38)的IT經(jīng)臨床II試驗(yàn)，其腫瘤特異性抗原的靶向性得以證實(shí)；PE38甚或可以治愈毛細(xì)胞白血病的病人，后者恰是不能對PE38產(chǎn)生抗體的病人，這提示IT分子抗原性對其療效的重要性。特異性抗體融合PE38，可顯著提高抗腫瘤的靶向性，卻不能有效避免PE38毒素的抗原性及其對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用，導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性，特別是血管滲漏綜合癥@。因此，對于PE毒素等一類在血液循環(huán)中可導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用的分子和藥物，僅通過氨基酸序列的優(yōu)化提高抗體的親和力和/或降低PE38毒素的抗原性是不夠的。 申請人:意外發(fā)現(xiàn)，通過HSA與PE38的結(jié)合，可有效“封閉”PE38的抗原位點(diǎn)，相信也會(huì)降低PE38毒素對人血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷；而通過白蛋白納米粒子對腫瘤組織的靶向與富集作用、以及在腫瘤局部利用HSA和脂肪酸的跨膜機(jī)制實(shí)現(xiàn)PE38對腫瘤組織的特異性殺傷，更是一種新的治療策略，且經(jīng)檢索還未見有類似報(bào)道。
[0007]參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的第一個(gè)目的是要克服現(xiàn)有技術(shù)以白蛋白為主要基架的納米粒子荷載藥物的局限性，提供一種既適用于“水不溶性”又適用于“水溶性”藥物的脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑。
[0018]本發(fā)明的第二個(gè)目的是要克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0020]一種脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0021](I)液體A:為水不相溶的有機(jī)溶劑,或體積比為10?5:5?I的水不相溶的有機(jī)溶劑和無水乙醇的混合液，所述水不相溶的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯，為色譜純試劑；溶液B:用液體A配制濃度為0.0033?360mg/ml的靜脈注射用脂肪酸溶液，優(yōu)選濃度為0.01mg/ml?50mg/ml，所述靜脈注射用脂肪酸為油酸、亞油酸、肉豆蘧酸或甘油三酯，為可人體靜脈輸注的脂肪乳劑的組成成分；液體C:無菌條件下，用注射用水配制濃度為10?200mg/ml的白蛋白水溶液，按體積比為1:6.67?333的比例將液體A滴入以5，000?15，OOOrpm轉(zhuǎn)速攪拌的白蛋白溶液中，繼續(xù)攪拌2?10分鐘，使與白蛋白結(jié)合的脂肪酸萃取于液體A中，制得液體C ；
[0022](2)脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子混懸液的制備:
[0023]用下述幾種方式制備:
[0024]方式一:
[0025]用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為12.5mg/ml?600mg/ml，優(yōu)選濃度為20mg/ml?400mg/ml的液體D，按體積比為0.1 %?7.2 %的比例，將液體D滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；
[0026]或者，用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為12.5mg/ml?600mg/ml的液體D，優(yōu)選濃度為10mg/ml?400mg/ml，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4± 1°C，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；
[0027]所述水不溶性藥物選紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、依托泊苷、甲氨蝶呤中的一種或幾種；是相對水溶性較低或很低的化療藥物或其他藥物，可溶解于至少一種“有機(jī)溶劑或其混合液”，并可與白蛋白結(jié)合；不同的“水不溶性”藥物與不同的“有機(jī)溶劑或其混合液”的溶解度不同，“溶解度”是決定“水不溶性”藥物“濃度范圍”的重要因素。
[0028]在FBA-1D/So納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與溶解水不溶性藥物的溶液B的體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為0.4 %?17.8 %，優(yōu)選I %?6.5 % ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.0001%?5%，優(yōu)選0.001%?1%;水不溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?20%，優(yōu)選1% ?10%。
[0029]方式二:
[0030]I)按I?1mg: Iml的比例將水不溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；或按I?1mg:lml的比例將水不溶性藥物與含50?100mg/ml維生素C的注射用水混合；在4±1°C、避光，壓力為15，000?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4°C下、避光、20，000?35，OOOrpm離心10?60min，去除上清液，獲得水不溶性藥物超微納米粒子；按4011^/1]11?600mg/ml比例,將水不溶性藥物超微納米粒子混懸于溶液B中，獲得液體D’，為含脂肪酸、水不溶性藥物超微納米粒子和有機(jī)溶劑的懸液；
[0031]2)按體積比為0.3%?4.0%的比例，將液體D’滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30, OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌15?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；或按體積比為0.3%?4.0 %的比例，將液體D’滴入攪拌速度為3，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5 土 I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光、壓力為15，OOOpsi?30，OOOpsi下，連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；
[0032]其中，“水不溶性”藥物選紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、依托泊苷和甲氨蝶呤等一種或幾種；不同的“水不溶性”藥物的密度和溶解度不同，懸浮于“有機(jī)溶劑或其混合液”中所需溶液體積不同，在此，“懸浮”的界定較“濃度范圍”的界定更為重要。
[0033]在FBA-1D/Su納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與液體D’中溶液B體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:0.6%?15.6% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.0001%?1% ;水不溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?25%，優(yōu)選1.0%?10% ；
[0034]方式三:
[0035]I)按5?1mg:1ml的比例將水溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；在4±1°〇、避光，壓力為15，000?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4±1°C下、避光、5，000?30，OOOrpm持續(xù)離心10?60min，去除上清液，獲得水溶性藥物超微納米粒子；按6.6mg/ml?375mg/ml比例，優(yōu)選16.67mg/ml?166.67mg/ml比例，將水溶性藥物超微納米粒子混懸于溶液B中，獲得液體D’，為含脂肪酸、水溶性藥物超微納米粒子和有機(jī)溶劑的懸液；
[0036]2)按體積比為0.8%?7.0%的比例，將液體D’滴入攪拌速度為12，OOOrpm?32, OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5?30分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；或按體積比為0.8%?7.0 %的比例，將液體D’滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4± 1°C，避光、壓力為15，OOOpsi?30，OOOpsi下，連續(xù)3?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；
[0037]在FBA-SD/Su納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與液體D’中溶液B的體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:1%?15.8% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.001%?1.4% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?20% ；
[0038]其中，“水溶性”藥物包括阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素(PE38)等化學(xué)、蛋白或多肽類藥物等一種或幾種；所述“水溶性”藥物可溶于水，在“有機(jī)溶劑或其混合液”中的溶解度很低；所述不同的“水溶性”藥物的密度不同，懸浮于“有機(jī)溶劑或其混合液”中所需溶液的體積不同，在此，“懸浮”的界定較“濃度”的界定更為重要。
[0039]方式四:
[0040]I)調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入液體C中，在100?100rpm下攪拌I?4小時(shí)，使水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合制得白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液，即液體C’ ；
[0041]2)按體積比為0.8%?7.5%的比例將溶液B，滴入攪拌速度為15，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；或按體積比為0.8%?7.5%的比例將溶液B，滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光，壓力為10，OOOpsi?25，OOOpsi下，連續(xù)I?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；
[0042]“水溶性”藥物包括阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素(PE38)等化學(xué)、蛋白或多肽類藥物等一種或幾種。不同的“水溶性”藥物與白蛋白的體外結(jié)合率不同，在此，“水溶性”藥物與液體C中白蛋白的“結(jié)合”濃度以及白蛋白溶液的濃度，決定“水溶性”藥物的加入量或濃度。
[0043]液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和為油相，而白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:1%?16% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.002%?15% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?25% ;
[0044]方式五:
[0045]按體積比為1.4 %?3.3 %的比例，將溶液B滴入攪拌速度為20，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?20分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液；或按體積比為1.4%?3.3%的比例，將溶液B滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5 土 I分鐘后，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4 土 1°C下，避光，壓力為10，OOOpsi?25，OOOpsi下，連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液；
[0046]將所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35 ± 2°C、20mmHg減壓下，60?80轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20?30分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，獲半透明乳液；
[0047]調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入半透明乳液中，在250rpm?500rpm下攪拌2?4小時(shí),使水溶性藥物與半透明乳液中白蛋白結(jié)合制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子空粒結(jié)合型乳液；
[0048]所述水溶性藥物包括阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素PE38等化學(xué)、蛋白或多肽類藥物等一種或幾種。不同的“水溶性”藥物與白蛋白的結(jié)合率不同，不同粒徑的FBA-Enp表面白蛋白的“量”不同，在此，“水溶性”藥物與FBA-Enp表面白蛋白的“結(jié)合”濃度，決定“水溶性”藥物的加入量或加入濃度。
[0049]在FBA-SD/Eb納米粒子乳液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和為油相，半透明乳液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:2.0%?16.4%;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.001%?3.1% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:2.5%?15% ；
[0050]方式六:
[0051]I)用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D ；
[0052]2)按5?1mg:1ml的比例將水溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；在4±1°〇、避光，壓力為15，OOO?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4±1°C下、避光、5，000?30，OOOrpm持續(xù)離心10?60min，去除上清液，獲得水溶性藥物超微納米粒子；
[0053]3)用液體D混懸水溶性藥物超微納米粒子，得到含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；或用液體D混懸水溶性藥物超微納米粒子，得到含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液，按體積比為0.1 %?7.2%的比例，將含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5±1分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4土1°C，避光，壓力為3，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；
[0054]方式七:
[0055]I)用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D ；
[0056]2)調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入液體C中，在100?100rpm下攪拌I?4小時(shí)，使水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合制得白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液，為液體C’ ；
[0057]3)按積比為0.1 %?7.2 %的比例，將液體D滴入攪拌速度為15，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；或按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；
[0058]方式八
[0059]I)用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D ；
[0060]2)按積比為0.1 %?7.2 %的比例，將液體D滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；或按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；
[0061]3)將脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35±2°C、20mmHg減壓下，60?80轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20?30分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，獲半透明乳液；調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入半透明乳液中，在250rpm?500rpm下攪拌2?4小時(shí)，使水溶性藥物與半透明乳液中白蛋白結(jié)合制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子空粒結(jié)合型混懸液；
[0062](3)乳液的制備
[0063]將步驟(2)中方式一?方式四、方式六和方式七制備的混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35±2°C，負(fù)壓下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10?30分鐘，去除混懸液中全部有機(jī)溶劑，制得半透明的穩(wěn)定的納米粒子乳液；
[0064](4)凍干制劑的制備
[0065]將步驟(3)獲得的乳液經(jīng)0.22um膜過濾除菌,或經(jīng)0.45um和0.22um膜過濾除菌，獲無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24?36小時(shí)，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑；所述白蛋白為人血清白蛋白或牛血清白蛋白；所述人血清白蛋白由血液提取或重組技術(shù)制備；
[0066]步驟⑴中液體A與白蛋白溶液的體積比優(yōu)選為1:36?100。
[0067]所述步驟(3)經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后的白蛋白混合液中的白蛋白的二級結(jié)構(gòu)不變、白蛋白含有“裸露”的脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)、并以該位點(diǎn)特異性結(jié)合脂肪酸，白蛋白分子的疏水區(qū)域依疏水性與水不溶性藥物結(jié)合，白蛋白分子的親水區(qū)域依親水性與水溶性藥物結(jié)合。
[0068]所述步驟(4)方式一?方式八中所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子均由溶解于溶液B中的靜脈注射用脂肪酸與液體C或液體C’中的白蛋白結(jié)合形成。
[0069]所述步驟(4)方式一、方式六、方式七或方式八中所述水不溶性藥物溶解于溶液B中與靜脈注射用脂肪酸共同構(gòu)成油相核心。
[0070]所述步驟(4)方式二或方式三中所述水不溶性藥物超微納米粒子或水溶性藥物超微納米粒子懸浮于溶液B中與靜脈注射用脂肪酸共同構(gòu)成油相核心。
[0071]所述步驟(4)方式四或方式五中所述水溶性藥物與液體C中的或納米粒子表面的白蛋白結(jié)合位于水相，靜脈注射用脂肪酸為油相核心。
[0072]所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑，僅由白蛋白、藥物和靜脈注射用脂肪酸組成，不含有機(jī)溶劑或任何輔料，其組分及含量以質(zhì)量百分比計(jì)為:靜脈注射用脂肪酸為0.0001%?8%、優(yōu)選為0.001%?I %，白蛋白為75%?99%、優(yōu)選為80%?95%，藥物為0.1%?25%、優(yōu)選為1.0 %?20% ;所述藥物為水不溶性藥物和水溶性藥物至少一種。
[0073]上述方法制備的脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑，具有如下性質(zhì):
[0074](I)所述凍干制劑和Abraxane復(fù)溶后，在體外溶液中4°C條件下，測定納米粒子的完整性與穩(wěn)定性分別在136?160小時(shí)和96小時(shí)；
[0075](2)所述凍干制劑和Abraxane復(fù)溶后，測定體內(nèi)血液循環(huán)中的所述納米粒子的完整性與穩(wěn)定性分別在35?45小時(shí)和25小時(shí)；
[0076](3)所述凍干制劑荷載的藥物進(jìn)入富含gp60受體細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度與同一藥物的靜脈注射劑進(jìn)入同系細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度之比為2?6 ;
[0077](4)所述凍干制劑荷載的藥物的LD5tl是同一藥物靜脈注射劑LD5tl的44?60倍；
[0078](5)所述凍干制劑荷載的藥物的MTD是同一藥物靜脈注射劑MTD的53?71倍；
[0079](6)所述凍干制劑降低所包裹或結(jié)合的假單胞菌外毒素PE38蛋白的抗原性20倍。
[0080]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法中，脂肪酸在納米粒子形成中的作用，如下:
[0081 ] 1、有機(jī)溶劑或其混合液處理血漿白蛋白是一個(gè)脂肪酸“萃取”和“富集”在油相中的過程，因?yàn)槌匐x心30，000rpm5小時(shí)有機(jī)溶劑或其混合液處理過的HSA溶液即液體C，可見油相與水相的分層，分別取油相和水相的樣品，測定游離脂肪酸含量和HSA的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn):60%以上的游離脂肪酸分布在油相之中；且若增加有機(jī)溶劑的量，則可增加油相中脂肪酸的總量。
[0082]2、添加不同劑量脂肪酸影響FBA-Drug NP納米粒子的形成
[0083]配制50mg/ml HSA溶液1ml ;“萃取”處理白蛋白；添加不同劑量的脂肪酸如肉豆蘧酸O (不加),5mg, 15mg和30mg與紫杉醇10mg溶于200ul氯仿和乙醇混合溶液中，高速勻漿或高壓勻漿法制備納米粒子，可獲半透明乳液，經(jīng)粒度分析表明:不加脂肪酸或加入過量脂肪酸，其紫杉醇納米粒子的粒徑均呈雙峰，且平均粒徑均大于300nm ;而加入“適量”的脂肪酸如添加5mg和15mg的肉豆蘧酸，可獲得了粒徑在80?150nm和90?240nm之間穩(wěn)定的平均粒徑小于180nm的納米粒子。
[0084]3、同樣制備條件與工藝，若去除HSA溶液中的脂肪酸，且在油相中不加脂肪酸，則不能形成納米粒子。
[0085]4、納米粒子核心區(qū)和外周白蛋白游離脂肪酸的含量分析，進(jìn)一步提供了脂肪酸對納米粒子形成具重要作用的證據(jù)。
[0086]即采用超濾技術(shù)，以10kDa分子量截流的超濾管5000rpm離心超濾20分鐘，分離納米粒子核心區(qū)和外周白蛋白，分別測定其游離脂肪酸的含量，意外地發(fā)現(xiàn):平均粒徑小于160nm的納米粒子溶液，納米粒子的核心區(qū)白蛋白游離脂肪酸的含量超過納米粒子外周白蛋白游離脂肪酸3倍以上，且核心區(qū)每一白蛋白分子平均結(jié)合2?5個(gè)脂肪酸分子。
[0087]5、FBA-SD/Ab和FBA-SD/Eb法制備納米粒子的實(shí)踐表明，單純脂肪酸就可以形成納米粒子，即在制備納米粒子的油相中，僅加入脂肪酸，就可以形成納米粒子，且這種納米粒子較油相核心含有紫杉醇等“水不溶性”藥物納米粒子的體外穩(wěn)定性無異甚或略優(yōu)。
[0088]6、FBA-1D/Su、FBA-SD/Su和FBA-1D&SD/Su法制備納米粒子的實(shí)踐表明，由于脂肪酸與白蛋白的特異性結(jié)合，懸浮于有機(jī)溶劑中的“水不溶性”或“水溶性”藥物超微納米粒子，也可被包裹在油相核心，且FBA-1D/Su-Drug FBA-SD/Su-Drug和FBA-1D/So&SD/Su-Drugs納米粒子在體外穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期等性質(zhì)上與FBA-1D/So-Drug相當(dāng)。
[0089]上述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米凍干制劑的基本材料，如“靜脈注射用脂肪酸”、“人血清白蛋白”、“有機(jī)溶液或其混合液”和“藥物”等，其基本特征如下:
[0090]1、本發(fā)明所述“靜脈注射用脂肪酸”，具備下列特征:
[0091](I)為脂肪酸，如油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、乙酸乙酯；(2)為可人體靜脈輸注的脂肪乳劑的組成成分；(3)為靜脈注射級的脂肪酸；(4)與有機(jī)溶液相溶，且不發(fā)生任何結(jié)構(gòu)改變或化學(xué)反應(yīng)；(5)可與白蛋白特異性結(jié)合。
[0092]2、本發(fā)明所述“人血清白蛋白”，具備下列特征:
[0093](I)為經(jīng)有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與無水乙醇混合液“萃取”處理的白蛋白，即“裸露”脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)的HSA ； (2)保持完整生理結(jié)構(gòu)的HSA ； (3)無免疫原性或抗原性，包括荷載“水溶性”藥物的HSA ； (4)保持gp60跨膜機(jī)制的HSA ； (5)可有血液中提取獲得或采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)獲得。
[0094]3、本發(fā)明所述“有機(jī)溶劑或其混合液”，具備下列特征:
[0095](I)是與水不相溶或僅微溶于水的有機(jī)溶劑；(2)可以溶解脂肪酸；(3)可以溶解、微溶或不溶解藥物，但不可與藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或改變藥物的性質(zhì)或結(jié)構(gòu)；(4)不與脂肪酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或改變脂肪酸的性質(zhì)或結(jié)構(gòu)；(5)有機(jī)溶液或其混合液及其處理方法不能影響或改變HSA的結(jié)構(gòu)和各種體內(nèi)、體外生物學(xué)性質(zhì)；(6)為色譜純試劑。
[0096]4、本發(fā)明所述“藥物”，具備下列特征:
[0097](I)在有機(jī)溶劑和水溶液中穩(wěn)定，不發(fā)生降解、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)變化或化學(xué)反應(yīng)；
[0098](2) “藥物”必需是可與HSA結(jié)合的“藥物”，如依疏水性而與HSA疏水域結(jié)合、或依親水性而與白蛋白親水基團(tuán)結(jié)合；
[0099](3)由于所選有機(jī)溶液和水為互不相溶或僅微溶的有機(jī)溶液，根據(jù)藥物在此兩種溶液介質(zhì)中溶解度的不同，可選擇不同的納米粒子制備技術(shù):
[0100]①可溶于有機(jī)溶劑，不溶于或微溶于水的藥物，如紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、依托泊苷、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿和甲氨蝶呤等，可選用本發(fā)明所述FBA-1D/So的制備方法；
[0101]②不溶于有機(jī)溶劑，可溶于水的藥物，如藥物阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素(PE38)等化學(xué)、蛋白或多肽類藥物等，首選本發(fā)明所述FBA-SD/Su的制備方法，還可選擇FBA-SD/Ab和FBA-SD/Eb的制備方法。
[0102]③不溶于有機(jī)溶劑，也不溶于水的藥物，如甲氨喋呤，可選擇本發(fā)明所述FBA-1D/Su的制備方法。
[0103](4)由有機(jī)溶劑構(gòu)成的油相中，所述藥物以溶解狀態(tài)或超微納米粒子(粒徑(50nm)狀態(tài)存在，這兩種物理“狀態(tài)”均可制備出水包油型納米粒子。
[0104]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的理化性質(zhì)、體外和體內(nèi)性質(zhì)與特征
[0105]1、分析比較HSA、Abraxane分解所獲HSA的圓二色光譜掃描圖及其本發(fā)明所述各種制備方法所獲FBA-Drug NP分解后所獲HSA的圓二色光譜掃描圖，均未見明顯改變，說明不同的制備方法并未顯著影響白蛋白的二級結(jié)構(gòu)。
[0106]2、本發(fā)明所述各種納米制劑在室溫和4°C下的納米粒子分析表明:各種FBA-DrugNP的體外溶液中的完整性和穩(wěn)定性明顯優(yōu)于白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane)納米粒子。
[0107]3、細(xì)胞膜表面富含HSA轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白gp60的HUVEC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，各種FBA-DrugNP的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)顯著增強(qiáng)，使進(jìn)入HUVEC細(xì)胞內(nèi)的藥物含量比相應(yīng)藥物的靜脈注射劑高約2?6倍；這同時(shí)表明，各種納米粒子的制備方法，均未影響HSA的生理功能和體內(nèi)性質(zhì)。
[0108]4、在荷瘤裸鼠移植瘤的模型上，初步證實(shí):與Abraxane相比，各種FBA_ID/So_P的血漿半衰期延長50%以上、腫瘤組織內(nèi)紫杉醇含量增加2?3倍、并產(chǎn)生了更高的抑瘤療效。
[0109]5、在小鼠KB移植瘤上，與Doxil相比，各種FBA_SD/Su_D納米粒子的血漿半衰期顯著延長3?8倍、抑瘤效果顯著增強(qiáng)。此外，F(xiàn)BA-SD/Su-D對人乳腺癌細(xì)胞的跨膜作用也明顯高于Doxil。
[0110]6、FBA-SD/Ab-Drug的制備技術(shù)顯著降低了 PE38毒素的抗原性，大幅提高PE38LD5。劑量約60倍，故FBA-SD/Ab-PE38具人體應(yīng)用開發(fā)的潛力。
[0111]7、與泰素相比，各種FBA-1D/So-P和Abraxane凍干制劑的小鼠LD5tl和MTD或LDltl均極顯著增高，增幅分別為44?56倍和53?71倍；而FBA-1D/So-P與Abraxane之間LD5tl和MTD值未見顯著性差別。
[0112]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0113]本發(fā)明的制備方法既可以適用于水不溶性藥物，也可以適用于水溶性藥物，既可以以溶液形式作為油相的核心，也可以以超微納米粒子的形式作為油相的核心，所構(gòu)成納米粒子主要依賴脂肪酸與白蛋白之間的特異性結(jié)合而形成；因此，所形成的納米粒子在體外溶液中和體內(nèi)的血液循環(huán)中的完整性和穩(wěn)定性較高，并可借納米尺度富集于實(shí)體腫瘤局部，通過白蛋白gp60受體通道促進(jìn)藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，大幅提高荷載藥物的LD5tl和MTD， 進(jìn)而顯著提高化療藥物的抗癌藥效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0114]圖1為FBA-1D/So-Pl透射電鏡掃描圖，其中:左圖為粒子粒徑分布情況，右圖為單個(gè)粒子的形態(tài)。
[0115]圖2為FBA-1D-DoOO透射電鏡掃描圖，其中:左圖為粒子粒徑分布情況，右圖為單個(gè)粒子的形態(tài)。
[0116]圖3為FBA-SD/C-D25透射電鏡掃描圖，其中:左圖為粒子粒徑分布情況，右圖為單個(gè)粒子的形態(tài)。
[0117]圖4為各種納米粒子凍干制劑白蛋白圓二色譜圖，其中:——HSA，分解所得白蛋白:一Abraxane，一 FBA-1D/So-P-l，F(xiàn)BA-1D/So-Ml, FBA-1D/So-Vl, FBA-1D/Su-E25,FBA-1D/So-SN381FBA-1D/Su-MTX20 — — FBA_SD/Su_D25， FBA-SD/Ab_EP20，F(xiàn)BA-1D/So-P&C, FBA-P/So&CP/Su、FBA-Do/So&PE38/Ab，F(xiàn)BA-R/So&D/Eb。
[0118]圖5為各種FBA-1D/So-P與泰素HUVEC細(xì)胞結(jié)合率的相比。
[0119]圖6為FBA-1D/So-P類納米粒子與Abraxane荷瘤小鼠藥效試驗(yàn)。
[0120]圖7為MCF-7腫瘤細(xì)胞體外跨膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0121]圖8為FBA-SD-D類納米制劑與Doxil和多柔比星抑制腫瘤增長的比較。

【具體實(shí)施方式】
[0122]本發(fā)明利用靜脈注射用脂肪酸(FA)與白蛋白特異結(jié)合的性質(zhì)，制備脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子(Fatty-acid-Binding Albumin-Drug Nanoparticle, FBA-DrugNP)凍干制劑，其中，F(xiàn)BA-Drug NP是“水包油型”、以脂肪酸為核心或核心之一結(jié)合白蛋白特異性位點(diǎn)而形成的納米粒子，荷載的藥物主要位于油相核心，也可與白蛋白結(jié)合位于水相，包括5種荷載藥物的基本方式，單獨(dú)或組合形成各種FBA-Drug NP, 5種荷載藥物的基本方式如下:
[0123]①“水不溶性”藥物與脂肪酸一起“溶解”于有機(jī)溶劑或其混合液中，構(gòu)成“油相”，脂肪酸和“水不溶性”藥物共同與白蛋白結(jié)合，形成脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”藥物納米粒子 / 溶液型(FBA Insoluble-Drug Solut1n Nanoparticle, FBA-1D/So NP)；
[0124]②“水不溶性”藥物以超微納米粒子形式“懸浮”于脂肪酸溶解的有機(jī)溶劑或其混合液中，構(gòu)成“油相”，利用脂肪酸與白蛋白的結(jié)合，形成脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”藥物納米粒子/ 懸液型(FBA Insoluble-Drug Suspens1n Nanoparticle, FBA-1D/Su NP)；
[0125]③“水溶性”藥物以超微納米粒子的形式“懸浮”于溶解脂肪酸的有機(jī)溶劑或其混合液中，構(gòu)成“油相”，利用脂肪酸與白蛋白的結(jié)合，形成脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水溶性”藥物納米粒子 / 懸液型(FBA Soluble-Drug Suspens1n Nanoparticle, FBA-SD/Su NP)；
[0126]④“水溶性”藥物與白蛋白溶液中的白蛋白結(jié)合構(gòu)成“水相”，共同包裹在以脂肪酸為核心的納米粒子周圍，形成脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水溶性”藥物納米粒子/蛋白結(jié)合型(FBA Soluble-Drug Albumin-binding Nanoparticle, FBA-SD/Ab NP)；
[0127]⑤脂肪酸“溶解”于有機(jī)溶劑或其混合液中，構(gòu)成“油相”，以白蛋白溶液作為“水相”，制備脂肪酸結(jié)合型白蛋白“空”納米粒子(Empty Nanoparticle, Enp),再與“水溶性”藥物混合，使“水溶性”藥物與FBA-Enp外周的白蛋白結(jié)合，形成脂肪酸結(jié)合型白蛋白_ “水溶性”藥物納米粒子 / 空粒結(jié)合型(FBA Soluble-Drug Enp-binding Nanoparticle, FBA-SD/Eb NP)；
[0128]上述①和③的組合，為脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”和“水溶性”藥物納米粒子/懸液型(FBA-1D/So&SD/Su NP);上述①和④的組合，為脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”和“水溶性”藥物納米粒子/蛋白結(jié)合型(FBA-1D/So&SD/Ab NP);和上述①和⑤的組合，為脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”藥物和“水溶性”藥物納米粒子/空粒結(jié)合型(FBA-1D/So&SD/Eb NP)等等。
[0129]在制備上述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子的過程中， 申請人:還發(fā)現(xiàn)油相中脂肪酸的含量或比例是能否形成藥物納米粒子的關(guān)鍵因素之一，而且通過控制油相中脂肪酸的“添加量”和經(jīng)有機(jī)溶劑或其混合液“萃取”處理白蛋白溶液中與白蛋白結(jié)合的脂肪酸的過程，使脂肪酸“萃取”有機(jī)溶劑或其混合液中并“富集”油相核心，在高剪切力作用下，形成不同粒徑尺度的“水包油型”納米粒子混懸液，去除有機(jī)溶劑或其混合液后，脂肪酸與白蛋白特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的納米粒子乳液液，經(jīng)過濾除菌和冷凍干燥，進(jìn)而形成可長期保存的納米粒子凍干制劑。更值得一提是上述FBA-1D/Su NP和FBA-SD/Su NP中，是以脂肪酸和“水不溶性”或“水溶性”藥物的超微納米粒子構(gòu)成“油相”核心，而這一手段顛覆了傳統(tǒng)上有機(jī)溶液作為油相制備水包油型粒子的基本概念，極大地?cái)U(kuò)展了這種白蛋白納米粒子遞藥體系的功能和應(yīng)用范圍。
[0130]本發(fā)明提出的脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子的制備技術(shù)大大突破了nab-technology制備技術(shù)僅限于包裹水不溶性藥物的限制,具廣泛的應(yīng)用前景；并且，由此技術(shù)開發(fā)的藥物納米粒子如脂肪酸結(jié)合白蛋白-紫杉醇納米粒子(Fatty-acid BindingAlbumin Paclitaxel, FBA-1D/So-P)與Abraxane相比,令人意外地發(fā)現(xiàn)具有粒徑更小、體內(nèi)外更穩(wěn)定和腫瘤組織局部紫杉醇富集增高等特征。
[0131]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白(Fatty-acid Binding Albumin, FBA)- “水不溶性”藥物(Insoluble Drug, ID)納米粒子/溶液型(Solut1n, So)凍干制劑(Nanoparticle, NP)的制備方法,簡稱FBA-1D/So法,步驟包括:
[0132]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0133]無菌條件下，取人血清白蛋白(HSA),加注射用水，配制10?200mg/ml,優(yōu)選20mg?80mg/ml HSA溶液；使用與水不相溶的有機(jī)溶劑如三氯甲烷(氯仿)、二氯甲烷、乙酸乙酯或其與乙醇的混合溶液(10?5:5?l，v/v)即液體A，“處理”白蛋白分子結(jié)合的脂肪酸，有機(jī)溶劑或其混合液與HSA溶液的體積比為0.3%?15%，優(yōu)選0.5%?5.0% ;具體方法是將液體A緩慢滴入5，000?15，OOOrpm、優(yōu)選8，000?10，OOOrpm連續(xù)攪拌的HSA溶液中，繼續(xù)攪拌2?10分鐘，優(yōu)選5±1分鐘，獲得液體C。此過程稱為“萃取”處理白蛋白，是白蛋白結(jié)合的脂肪酸萃取與富集于油相的過程(詳見實(shí)施例5)。
[0134]2、油相構(gòu)成--------溶液B和液體D的制備
[0135]將靜脈注射用脂肪酸溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中，獲溶液B，再用溶液B溶解“水不溶性”藥物，獲液體D ；
[0136]其中靜脈注射用脂肪酸包括油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、甘油三酯等，為可人體靜脈輸注的脂肪乳劑的組成成分；“水不溶性”藥物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、依托泊苷和甲氨蝶呤等一種或幾種，是相對水溶性較低或很低的化療藥物或其他藥物，可溶解于至少一種“有機(jī)溶劑或其混合液”，并可與白蛋白結(jié)合；“有機(jī)溶劑或其混合液”選三氯甲烷(氯仿)、二氯甲烷、乙酸乙酯或其與無水乙醇等的混合液，為色譜純試劑；其中，靜脈注射用脂肪酸以0.01mg/ml?50mg/ml濃度溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中，“水不溶性”藥物以12.5mg/ml?600mg/ml濃度、優(yōu)選20mg/ml?400mg/ml濃度溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中；不同的“水不溶性”藥物與不同的“有機(jī)溶劑或其混合液”的溶解度不同，“溶解度”是決定“水不溶性”藥物“濃度范圍”的重要因素。
[0137]3、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0138]將液體D按與液體C的體積比為0.1%?7.2%的比例，緩慢滴入高速攪拌的、液體C中，攪拌速度為3000rpm?30，OOOrpm,持續(xù)時(shí)間為10?60分鐘；優(yōu)選攪拌速度為12，OOOrpm?30，OOOrpm,持續(xù)時(shí)間為10?20分鐘，高速勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；此為高速攪拌法制備FBA-1D/So納米粒子，簡稱 FBA-1D/So HS 法。
[0139]或者將液體D，按與液體C的體積比為0.1%?7.2%的比例，緩慢滴入高速攪拌的、液體C中，攪拌速度為10，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為5±1分鐘；再將這種處理后的混合懸液迅速加入高壓微射流機(jī)(M-110P Microfluidizer)進(jìn)料容器中，在6，OOOpsi?30，OOOpsi高壓、避光、4°C條件下，經(jīng)連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；此為高壓勻漿法制備FBA-1D/So納米粒子，簡稱FBA-1D/So HP 法。
[0140]在FBA-1D/So納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與溶解水不溶性藥物的溶液B的體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為0.4%?17.8% ;優(yōu)選1.靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.0001%?5%，優(yōu)選0.001%?1%;水不溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?20%，優(yōu)選1% ?10%。
[0141]4、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0142]將納米粒子混懸液迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10?20分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，可獲半透明乳液。
[0143]5、無菌凍干制劑的制備
[0144]該半透明乳液經(jīng)0.45u和/或0.22u過濾膜濾過可去除乳液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌乳液；這種無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，獲得FBA-1D/So-Drug ；FBA-1D/So-Drug加生理鹽水復(fù)溶后，所獲FBA-1D/So-Drug溶液納米粒子的粒徑與該無菌乳液凍干前一樣。
[0145]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白(FBA)-“水不溶性”藥物(Insoluble Drug, ID)納米粒子/懸液型(Suspens1n, Su)凍干制劑(Nanoparticle, NP)的制備方法,簡稱FBA-1D/Su法,步驟包括:
[0146]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0147]同前FBA-1D/So 法所述。
[0148]2、油相構(gòu)成--------溶液B和液體D’的制備
[0149]將靜脈注射用脂肪酸溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中，獲溶液B，其中脂肪酸包括油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、甘油三酯等；其中，脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為:0.001%?1%。
[0150]“水不溶性”藥物超微納米粒子(Super nanoparticle, Snp)的制備:各種技術(shù)與方法如機(jī)械粉碎法、離子濺射法、冷凍干燥法、激光誘導(dǎo)氣相化學(xué)反應(yīng)法等所獲“水不溶性”藥物超微納米粒子，均可用于本方法，其中“超微納米粒子”是指粒徑小于等于50nm的納米粒子(粒徑<50nm)。本發(fā)明披露的一種“超微納米粒子”的制備方法，為高壓勻漿法，具體步驟是:將“水不溶性”藥物以I?10mg/ml的濃度混合于與該藥不相溶的藥用級大豆油和維生素E溶液(維生素E含量在0.4?2mg/ml)中，或者與該藥不相溶的注射用水和維生素C (Vitamin C，Vit C)溶液(維生素C含量在50?100mg/ml)中，在4°C、避光條件下，經(jīng)20，000?30，OOOpsi高壓勻漿處理I?3次，獲“水不溶性”藥物超微納米粒子大豆油或注射用水混懸液，再經(jīng)4°C下、避光、20，000?35，OOOrpm高速離心,持續(xù)10?60mins,去除上清，收集水不溶性藥物超微納米粒子；按3.0mg/ml?600mg/ml的比例，將“水不溶性藥物超微納米粒子”混懸于溶液B中，獲得液體D’，為含脂肪酸、水不溶性藥物超微納米粒子和有機(jī)溶劑的懸液；
[0151]其中，“水不溶性”藥物選紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、依托泊苷和甲氨蝶呤等一種或幾種；不同的“水不溶性”藥物的密度和溶解度不同，懸浮于“有機(jī)溶劑或其混合液”中所需溶液體積不同，在此，“懸浮”的界定較“濃度范圍”的界定更為重要。
[0152]3、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0153]將液體D’，按與液體C的體積比為0.3%?4.0 %的比例，緩慢滴入高速攪拌的、液體C中，避光，攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為15?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；此為高速攪拌法制備FBA-1D/Su納米粒子，簡稱FBA-1D/Su HS法。
[0154]或者將液體D’，按與液體C的體積比為0.3%?4.0 %的比例，緩慢滴入高速攪拌的、液體C中，攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm,持續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)(M-110P Microfluidizer)進(jìn)料容器中，在 20，OOOpsi ?30，OOOpsi 高壓、避光、4°C下，經(jīng)連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；此為高壓勻漿法制備FBA-1D/Su納米粒子，簡稱FBA-1D/Su HP法。
[0155]在FBA-1D/Su納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與液體D’中溶液B體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:0.6%?15.6% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.0001%?1% ;水不溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?25%，優(yōu)選1%?10%。
[0156]5、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0157]同前FBA-1D/So 法所述。
[0158]6、無菌凍干制劑的制備
[0159]同前FBA-1D/So 法所述。
[0160]所述FBA-SD/Su-Drug凍干制劑加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA-SD/Su-Drug溶液納米粒子的粒徑與其無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0161]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白(FBA)- “水溶性”藥物(Soluble Drug, SD)納米粒子/懸液型(Suspens1n, Su)凍干制劑(Nanoparticle, NP)的制備方法,簡稱FBA-SD/Su法，步驟包括:
[0162]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0163]同前FBA-1D/So 法所述。
[0164]2、油相構(gòu)成--------溶液B和溶液D’的制備
[0165]將靜脈注射用脂肪酸溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中，獲溶液B，其中脂肪酸包括油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、甘油三酯等；其中，脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為:0.001%?1%。
[0166]“水溶性”藥物超微納米粒子的制備:各種技術(shù)與方法如機(jī)械粉碎法、離子濺射法、冷凍干燥法、激光誘導(dǎo)氣相化學(xué)反應(yīng)法等所獲“水溶性”藥物超微納米粒子，均可用于本方法，其中“超微納米粒子”是指粒徑小于等于50nm的納米粒子(粒徑彡50nm)。本發(fā)明披露的一種“超微納米粒子”的制備方法，即高壓勻漿法，具體步驟是:將“水溶性”藥物以5?10mg/ml的濃度混合于與該藥不相溶的藥用級維生素E (Vitamin E, Vit E)，含量在0.4?2mg/ml的大豆油中，在4°C、避光條件下,經(jīng)15，000?30，OOOpsi高壓勻衆(zhòng)處理I?3次，獲“水溶性”藥物超微納米粒子大豆油混懸液，再經(jīng)4°C下、避光、5000?30，OOOrpm高速離心，持續(xù)5?60mins，去除大豆油上清；或者經(jīng)截流分子量為30?10kDa的超濾膜超濾處理，離心1，000?5，OOOrpm, 10?30分鐘，去除超濾液；獲得水溶性藥物超微納米粒子；按6.6mg/ml?600mg/ml比例，將水溶性藥物超微納米粒子混懸于溶液B中，獲得液體D’，為含脂肪酸、水溶性藥物超微納米粒子和有機(jī)溶劑的懸液；
[0167]其中，“水溶性”藥物包括阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素(PE38)等化學(xué)、蛋白或多肽類藥物等一種或幾種；所述“水溶性”藥物可溶于水，在“有機(jī)溶劑或其混合液”中的溶解度很低；所述不同的“水溶性”藥物的密度不同，懸浮于“有機(jī)溶劑或其混合液”中所需溶液的體積不同，在此，“懸浮”的界定較“濃度”的界定更為重要。
[0168]3、水相構(gòu)成
[0169]由液體C構(gòu)成,其中HSA溶液的濃度為10?200mg/ml,優(yōu)選20mg?80mg/ml ；
[0170]4、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0171]按體積比為1.5%?2.0%的比例，將液體D’滴入攪拌速度為12，OOOrpm?22，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5?20分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；此為高速攪拌法制備FBA-SD/Su納米粒子，簡稱FBA-SD/Su HS法。
[0172]或按體積比為1.5%?2.0%的比例，將液體D’滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘,加入高壓微射流機(jī)(M-110P Microfluidizer)進(jìn)料容器中，在4± 1°C，避光、壓力為20，OOOpsi?30，OOOpsi下，連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；此為高壓勻漿法制備FBA-SD/Su納米粒子，簡稱FBA-SD/Su HP法。
[0173]在FBA-SD/Su納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與液體D’中溶液B的體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:1%?15.8% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.001%?1.4% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?20% ；
[0174]5、納米粒子去除油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0175]同前FBA-1D/So 法所述。
[0176]6、無菌凍干制劑的制備
[0177]同前FBA-1D/So 法所述。
[0178]所述FBA-SD/Su-Drug加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA-SD/Su-Drug溶液納米粒子的粒徑與其無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0179]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白(FBA)- “水溶性”藥物(SD)納米粒子/蛋白結(jié)合型(Albumin Binding, Ab)凍干制劑的制備方法,簡稱FBA-SD/Ab法,步驟包括:
[0180]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0181]同前FBA-1D/So 法所述。
[0182]2、油相構(gòu)成--------溶液B的制備
[0183]將靜脈注射用脂肪酸溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中，獲溶液B，其中脂肪酸包括油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、甘油三酯等；其中，靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為:0.001% ?1%。
[0184]3、水相構(gòu)成-----白蛋白與藥物的結(jié)合
[0185]調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入液體C中，在100?100rpm下攪拌I?4小時(shí)，使水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合制得白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液，為液體C’ ；
[0186]例如，當(dāng)配制“水溶性”藥物阿霉素(doxorubicin, D)或表阿霉素((Epirubicin,EP)與白蛋白的結(jié)合溶液時(shí)，使用0.0lM?0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)20?100mg/ml HSA溶液的pH至5.5?6.5 ;使用注射用水配制2mg/ml阿霉素(doxorubicin, D)或表阿霉素((Epirubicin，EP)，獲得高濃度D或EP溶液；將此高濃度溶液緩慢加入HSA溶液中，1，OOOrpm土 10rpm磁力攪拌2小時(shí)，獲HSA-阿霉素或HSA-表阿霉素結(jié)合溶液。
[0187]“水溶性”藥物包括阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素(PE38)等化學(xué)、蛋白或多肽類藥物等一種或幾種。不同的“水溶性”藥物與白蛋白的體外結(jié)合率不同，在此，“水溶性”藥物與液體C中白蛋白的“結(jié)合”濃度以及白蛋白溶液濃度，決定“水溶性”藥物的加入量或濃度。
[0188]4、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0189]按體積比為0.8 %?7.5 %的比例將溶液B，滴入攪拌速度為15，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；此為高速攪拌法制備FBA-SD/Ab納米粒子，簡稱FBA-SD/Ab HS法。
[0190]或者，按體積比為0.8%?7.5%的比例將溶液B，滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C，中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)(M-110P Microfluidizer)進(jìn)料容器中，在4土 1°C，避光，壓力為10，OOOpsi?25，OOOpsi下，連續(xù)I?5個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；此為高壓勻漿法制備FBA-SD/Ab納米粒子，簡稱FBA-SD/Ab HP法。
[0191 ] 在FBA-SD/Ab納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和為油相，而白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:1%?16% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.002%?15% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?25% ；
[0192]5、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0193]同前FBA-1D/So 法所述。
[0194]6、無菌凍干制劑的制備
[0195]同前FBA-1D/So 法所述。
[0196]所述FBA-SD/Ab-Drug加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA_SD/Ab_Drug溶液納米粒子的粒徑與其無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0197]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白(FBA)- “水溶性”藥物(SD)納米粒子/空粒結(jié)合型(Empty-Nanoparticle Binding, Eb)凍干制劑的制備方法,簡稱FBA-SD/Eb法,步驟包括:
[0198]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0199]同前FBA-1D/So 法所述。
[0200]2、油相構(gòu)成--------溶液B的制備
[0201]將靜脈注射用脂肪酸溶解于有機(jī)溶劑或其混合液中，獲溶液B，其中脂肪酸包括油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、甘油三酯等；其中，靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為:0.001% ?1%。
[0202]3、水相構(gòu)成
[0203]水相由液體C構(gòu)成，其中，HSA溶液的濃度為10?200mg/ml,優(yōu)選20mg?80mg/ml ；
[0204]4、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0205]按體積比為1.4 %?3.3 %的比例，將溶液B滴入攪拌速度為20，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?20分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液；此為高速勻漿法制備FBA-SD/Eb納米粒子，簡稱FBA-SD/Eb HS法。
[0206]或者，按體積比為1.4%?3.3%的比例，將溶液B滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘后，再加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4± 1°C下，避光，壓力為10，OOOpsi?25，OOOpsi下，連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液；此為高壓勻漿法制備FBA-SD/Eb納米粒子，簡稱FBA-SD/EbHP法。
[0207]5、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0208]將所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35 ± 2°C、20mmHg減壓下，60?80轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20?30分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，獲半透明乳液；其中所含納米粒子為FBA，該粒子是由脂肪酸和白蛋白構(gòu)成的“空”納米粒子(FBA-EmptyNanoparticle, FBA-Enp)；
[0209]6、FBA-SD/Enp 載藥過程
[0210]調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入半透明乳液中，在250rpm?500rpm下攪拌2?4小時(shí),使水溶性藥物與半透明乳液中的FBA-Enp表面白蛋白結(jié)合，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白_水溶性藥物納米粒子空粒結(jié)合型乳液，F(xiàn)BA-SD/Eb乳液；
[0211]所述水溶性藥物包括阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素PE38等。不同的“水溶性”藥物與白蛋白的結(jié)合率不同，不同粒徑的FBA-Enp表面白蛋白的“量”不同，在此，“水溶性”藥物與FBA-Enp表面白蛋白的“結(jié)合”濃度，決定“水溶性”藥物的加入量或加入濃度。
[0212]在FBA-SD/Eb納米粒子乳液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和為油相，半透明乳液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:2.0%?16.4%;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.001%?3.1% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:2.5%?15% ；
[0213]7、無菌凍干制劑的制備
[0214]該半透明乳液經(jīng)0.45u和/或0.22u過濾膜濾過可去除乳液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌乳液；這種無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，獲得FBA-SD/Eb-Drug ；FBA-SD/Eb-Drug加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA-SD/Eb-Drug溶液納米粒子的粒徑與該無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0215]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”和“水溶性”藥物納米粒子/懸液型凍干制劑的制備方法，簡稱FBA-1D/So&SD/Su法，為前述FBA-1D/So和FBA-SD/Su兩種粒子制備方法的結(jié)合，步驟包括:
[0216]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0217]同前FBA-1D/So 法所述。
[0218]2、油相構(gòu)成--------溶液B和液體D的制備
[0219]I)將靜脈注射用脂肪酸溶解于液體A中，獲溶液B，再用溶液B溶解“水不溶性”藥物使?jié)舛葹?0mg/ml?400mg/ml，制得液體D ;
[0220]2)按5?1mg:1ml的比例將水溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；在4±1°〇、避光，壓力為15，000?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4±1°C下、避光、5，000?30，OOOrpm持續(xù)離心10?60min或經(jīng)截留分子量為30?10kDa的濾膜超濾，去除上清液，獲得水溶性藥物超微納米粒子；
[0221]3、水相構(gòu)成
[0222]為液體C,由10?200mg/ml,優(yōu)選20mg?80mg/ml的HSA溶液構(gòu)成；
[0223]4、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0224]用液體D混懸水溶性藥物超微納米粒子，得到含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液，即FBA-1D/So&SD/Su納米粒子混懸液；
[0225]或者，用液體D混懸水溶性藥物超微納米粒子，得到含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液，按體積比為0.1 %?7.2%的比例，將含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4土 TC，避光，壓力為3，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液，即FBA-1D/So&SD/Su納米粒子混懸液；
[0226]在FBA-1D/So&SD/Su納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和構(gòu)成油相，而HSA溶液的體積構(gòu)成本體系的水相，油相體積與水相體積之比為:3.5%，靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.033%，“水溶性”藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:3.33% ;“水不溶性”藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:3.33%。
[0227]5、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0228]同前FBA-1D/So 法所述。
[0229]6、無菌凍干制劑的制備
[0230]同前FBA-1D/So 法所述。
[0231]所述FBA-1D/So&SD/Su-Drug加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA-1D/So&SD/Su-Drug溶液的粒徑與其無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0232]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”和“水溶性”藥物納米粒子/蛋白結(jié)合型凍干制劑的制備方法，簡稱FBA-1D/So&SD/Ab法，為前述FBA-1D/So和FBA-SD/Ab兩種制備方法的結(jié)合，具體步驟包括:
[0233]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0234]同前FBA-1D/So 法所述。
[0235]2、油相構(gòu)成--------溶液B和液體D的制備
[0236]同前FBA-1D/So 法所述。
[0237]即將靜脈注射用脂肪酸溶解于液體A中，獲溶液B，再用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D ；
[0238]3、水相構(gòu)成:
[0239]同前FBA-SD/Ab 法所述。
[0240]調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入液體C中，在100?100rpm下攪拌I?4小時(shí)，使水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合制得白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液，為液體C’ ；
[0241 ] 4、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備:
[0242]按積比為0.1 %?7.2 %的比例，將液體D滴入攪拌速度為15，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液，即FBA-1D/So&SD/Ab納米粒子混懸液；
[0243]或者，按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌2?5分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4土 TC，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液，即FBA-1D/So&SD/Ab納米粒子混懸液；
[0244]在FBA-1D/So&SD/Ab納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和，構(gòu)成本體系的油相，而液體C的體積構(gòu)成本體系的水相，其中，油相體積與水相體積之比為:4.5%，靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.083%，“水溶性”藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:0.083% ;“水不溶性”藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:3.33%。
[0245]5、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備:
[0246]同前FBA-1D/So 法所述。
[0247]6、無菌凍干制劑的制備:
[0248]同前FBA-1D/So 法所述。
[0249]所述FBA-1D/So&SD/Ab-Drug加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA-1D/So&SD/Ab-Drug溶液納米粒子的粒徑與其無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0250]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”和“水溶性”藥物納米粒子/空粒結(jié)合型凍干制劑的制備方法，簡稱FBA-1D/So&SD/Eb法，前述FBA-1D/So和FBA-SD/Eb兩種粒子制備方法的結(jié)合，具體步驟包括:
[0251 ] 1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0252]同前FBA-1D/So 法所述。
[0253]2、油相構(gòu)成--------溶液B和液體D的制備
[0254]同前FBA-1D/So 法所述。
[0255]即用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的溶液D ；
[0256]3、水相構(gòu)成:
[0257]同前FBA-1D/So 法所述。
[0258]4、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備:
[0259]同前FBA-1D/So 所述。
[0260]按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；
[0261]或者，按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5 土 I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4 ± I °C，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；
[0262]5、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備:
[0263]將脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35±2°C、20mmHg減壓下，60?80轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20?30分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，獲半透明乳液；
[0264]6、FBA-1D/So 的載藥過程
[0265]調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入半透明乳液中，在250rpm?500rpm下攪拌2?4小時(shí),使水溶性藥物與半透明乳液中FBA-1D/So納米粒子表面白蛋白結(jié)合，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子空粒結(jié)合型乳液，即FBA-1D/So&SD/Eb-Drug乳液。
[0266]在FBA-1D/So&SD/Eb-Drug乳液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和，構(gòu)成本體系的油相，而FBA-1D/So納米粒子乳液的終體積構(gòu)成本體系的水相，其中，油相體積與水相體積之比為:7.5%，靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.033%，“水溶性”藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:3.33% ;“水不溶性”藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:3.33%。
[0267]7、無菌凍干制劑的制備:
[0268]同前FBA-1D/So 所述。
[0269]所述FBA-1D/So&SD/Eb-Drug凍干制劑加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA-1D/So&SD/Eb-Drug溶液納米粒子的粒徑與其無菌乳液冷凍干燥前一樣。
[0270]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-兩種“水不溶性”藥物納米粒子/溶液型凍干制劑的制備方法，簡稱FBA-1D/S0-D1&D2法，即前述FBA-1D/So法應(yīng)用于兩種“水不溶性”藥物，具體步驟包括:
[0271]1、“萃取”處理白蛋白--------液體A和液體C的制備
[0272]同前FBA-1D/So 法所述。
[0273]2、油相構(gòu)成--------溶液B和液體D的制備
[0274]將靜脈注射用脂肪酸溶解于液體A中，獲溶液B，再用溶液B溶解“水不溶性”藥物Dl和D2，獲液體D1&2 ;其中脂肪酸包括油酸、亞油酸、肉豆蘧酸、甘油三酯等，“水不溶性”藥物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、依托泊苷和甲氨蝶呤等任意兩種的組合，“有機(jī)溶劑或其混合液”如三氯甲烷(氯仿)、二氯甲烷、乙酸乙酯或其與無水乙醇等的混合溶液；其中，靜脈注射用脂肪酸濃度為0.01mg/ml?50mg/ml,兩種“水不溶性”藥物的濃度之和為5mg/ml?600mg/ml,優(yōu)選1mg/ml ?400mg/ml。
[0275]3、油相與水相的混合------FBA納米粒子混懸液的制備
[0276]按與溶液C的體積比為0.1 %?7.2 %的比例，將液體D1&2緩慢滴入高速攪拌溶液C中，以3，OOOrpm?30，OOOrpm攪拌、持續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”藥物D1&D2納米粒子溶液型混懸液；
[0277]或者，按與溶液C的體積比為5%?6.5%的比例，將液體D1&2緩慢滴入高速攪拌的、液體C中，攪拌速度為10，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為5±1分鐘；再將這種混合液加入高壓微射流機(jī)的進(jìn)料口，在20，OOOpsi?30，OOOpsi壓力下，避光、4°C下，循環(huán)5?8次；制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-“水不溶性”藥物D1&D2納米粒子溶液型混懸液；
[0278]上述FBA-1D/SO-D1&D2納米粒子混懸液體系中，液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和，構(gòu)成本體系的油相，而液體C中的白蛋白水溶液的體積構(gòu)成本體系的水相，油相體積與水相體積之比為:6.5%?11.5% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.05%?0.4% ;兩種“水不溶性”藥物之和與白蛋白的質(zhì)量比為:5%?10%。
[0279]4、去除納米粒子油相中的有機(jī)溶劑——穩(wěn)定的納米粒子乳液的制備
[0280]同前FBA-1D/So 法所述。
[0281]5、無菌凍干制劑的制備
[0282]同前FBA-1D/So 法所述。
[0283]所述FBA-1D/SO-D1&D2加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲FBA_ID/So_Dl&D2溶液納米粒子的粒徑與其無菌乳液凍干前一樣。
[0284]依據(jù)本發(fā)明所述各種脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，還可以演變或推導(dǎo)出FBA-1D/So&ID/Su法等多種納米粒子凍干制劑的制備方法及其產(chǎn)物，
不再一一贅述。
[0285]類似地，以上述制備一種“藥物”納米粒子凍干制劑的制備方法作為基本方法，單獨(dú)應(yīng)用于兩種或兩種以上同類藥物，或以上述兩種基本方法聯(lián)合應(yīng)用于兩種或兩種以上同類或不同類藥物(即“水不溶性”和“水溶性”藥物)，制備脂肪酸結(jié)合型白蛋白-兩種或兩種以上藥物納米粒子凍干制劑，均可行，均為本發(fā)明構(gòu)思范疇。
[0286]本發(fā)明所述FBA-Drug NP的制備方法中，脂肪酸在納米粒子形成中的作用進(jìn)一步闡述如下:
[0287]1、有機(jī)溶劑或其混合液處理血清白蛋白溶液的過程是“萃取”和“富集”脂肪酸于油相中的過程
[0288]HSA或BSA均含脂肪酸，不同的HSA或BSA提取方法影響脂肪酸的含量。將有機(jī)溶劑或其混合液處理過的HSA溶液，經(jīng)超速離心30，000rpm5小時(shí)，可見有機(jī)相(即油相)與白蛋白溶液相(即水相)的分層，分別取油相和水相的樣品，采用酶法(Cayman公司產(chǎn)品)測定游離脂肪酸含量、采用Lowry氏法測定HSA的含量，結(jié)果表明(詳見實(shí)施例5):有機(jī)溶劑處理HSA的過程實(shí)際上是一種“萃取”與“富集”脂肪酸的過程，且經(jīng)此處理有60%以上的游離脂肪酸分布在有機(jī)溶劑中，即油相之中；同樣的“萃取”處理?xiàng)l件下，若增加有機(jī)溶劑的量，則可增加油相中脂肪酸的含量或比例。
[0289]2、添加不同劑量脂肪酸影響FBA-Drug納米粒子的形成
[0290]如實(shí)施例6所述:稱取華蘭生物的HSA (10 % HSA, 50ml) 500毫克，加注射用水，配制成50mg/ml HSA溶液1ml ;將氯仿和乙醇混合溶液(8:3, v/v) 10ul,緩慢滴入5，OOOrpm的50mg/ml HSA溶液，持續(xù)10分鐘。分別將不同劑量的脂肪酸如肉豆蘧酸O (不加)，5mg, 15mg和30mg與紫杉醇10mg溶于200ul氯仿和乙醇混合溶液中，再將這種含有肉豆蘧酸、紫杉醇、氯仿和乙醇的混合溶液緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)“萃取”處理的50mg/mlHSA溶液中，攪拌速度為10，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為5分鐘；再將這種混合溶液經(jīng)高壓微射流機(jī)(M-110P Microfluidizer),在25，OOOpsi壓力下,4°C下,循環(huán)8次；將此混懸液迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，可獲得半透明乳液，樣品經(jīng)粒度分析(馬爾文Nano Zetasizer ZS90),表明:不加脂肪酸或加入過量脂肪酸，其紫杉醇納米粒子的粒徑均呈雙峰，且平均粒徑均大于300nm ;而加入“適量”的脂肪酸如前述添加5mg和15mg的肉豆蘧酸,均獲得了粒徑在80?150nm和90?240nm之間穩(wěn)定的平均粒徑小于ISOnm的納米粒子(詳見表2)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)施例7所述，提示:油相中脂肪酸的含量影響納米粒子的形成和粒徑的大小，脂肪酸含量過低或過高超出了有機(jī)溶液的溶解度均影響納米粒子的形成。
[0291]3、本制備體系與工藝中，若脂肪酸含量過低，則不能形成FBA-Drug納米粒子
[0292]如實(shí)施例7所述，采用常規(guī)的離子交換層析，純化HSA，使HSA溶液中脂肪酸的含量低于0.lug/mgHSA，同時(shí)，在油相中也不添加脂肪酸(如油酸、亞油酸、肉豆蘧酸等)，在其它制備條件與工藝參數(shù)不變的條件下，根本不能形成FBA-Drug納米粒子。這說明,脂肪酸是本FBA-Drug納米粒子形成機(jī)制中不可缺少的重要因素和主要構(gòu)成成分之一。
[0293]4、納米粒子核心區(qū)和外周白蛋白游離脂肪酸的含量分析，進(jìn)一步提供了脂肪酸對納米粒子形成具重要作用的證據(jù)。
[0294]如實(shí)施例8所述，采用超濾技術(shù)，分離納米粒子核心區(qū)白蛋白，即直接與納米核心紫杉醇和/或脂肪酸結(jié)合的白蛋白和納米粒子外周白蛋白，分別測定其游離脂肪酸的含量，意外地發(fā)現(xiàn):以本發(fā)明所述技術(shù)制備的平均粒徑小于160nm的納米粒子溶液，采用10kDa分子量截流的超濾管(Millipore公司)5000rpm離心超濾20分鐘，分別收集超濾液和過濾膜上的濃縮液，用Lowry氏法和酶法(Cayman公司產(chǎn)品)定量白蛋白和游離脂肪酸，據(jù)此計(jì)算出每毫克蛋白所含游離脂肪酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其共同特征是:納米粒子的核心區(qū)白蛋白游離脂肪酸的含量超過納米粒子外周白蛋白游離脂肪酸3倍以上，且核心區(qū)每一白蛋白分子平均結(jié)合2?5個(gè)脂肪酸分子。
[0295]5、FBA-1D/So-Drug和FBA-SD/Su-Drug納米粒子的形成機(jī)制表明，單純脂肪酸就可以形成納米粒子，如實(shí)施例4 (FBA)、9 (FBA-1D/So-Do00)和19 (FBA-SD/Ab-DO)所示，在制備納米粒子的油相中，僅加入脂肪酸，就可以形成納米粒子，且這種納米粒子較核心含有紫杉醇或外周白蛋白結(jié)合阿霉素所形成的納米粒子的體外穩(wěn)定性無異甚或略優(yōu)。
[0296]本發(fā)明所述各種FBA-Drug NP的理化性質(zhì)、體外和體內(nèi)活性與特征
[0297]1、圓二色光譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單而準(zhǔn)確的方法，可以在溶液狀態(tài)下、接近生理狀態(tài)下測定，對構(gòu)象變化靈敏，所以是目前研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要手段之一。比較華蘭生物HSA、Abraxane分解所獲HAS以及本發(fā)明專利所述各種制備方法所獲FBA-Drug NP如實(shí)施例7FBA-1D/So-P7_l和實(shí)施例15FBA_SD/Su_D25樣品等等分解后所獲HSA的圓二色光譜掃描圖，未見明顯改變，說明:不同的制備方法并未顯著影響白蛋白的二級結(jié)構(gòu)。掃描結(jié)果詳見實(shí)施例27。
[0298]2、本發(fā)明各種類型納米制劑在室溫和4°C下的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明:各種類型的脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子(FBA-Drug NP)的體外穩(wěn)定性明顯優(yōu)于白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane),詳見實(shí)施例28。
[0299]3、人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的細(xì)胞膜表面富含gp60受體，是HSA的生理轉(zhuǎn)運(yùn)通道。采用熒光標(biāo)記的紫杉醇，按1:50比例加入紫杉醇中，制備各種FBA-1D/So-P納米粒子，即F-FBA-1D/So-P ；以相同添加比例，制備熒光標(biāo)記的紫杉醇注射液，即F-Taxol。在HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)孔中，加入相同紫杉醇(Paclitaxel, P)濃度的F-FBA-1D/So-P和F-Taxol，37 °C下，孵育I小時(shí)后，發(fā)現(xiàn):各種F-FBA-1D/So-P與HUVEC細(xì)胞的結(jié)合率較F-Taxol高約10倍左右，這說明FBA-1D/So-P可加強(qiáng)細(xì)胞膜表面帶有g(shù)p60受體細(xì)胞紫杉醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明:各種FBA-Drug NP進(jìn)入HUVEC細(xì)胞內(nèi)的藥物含量比相應(yīng)藥物的靜脈注射劑高約2?6倍；這表明本發(fā)明所述各種納米粒子的制備方法，均未影響HAS的生理功能和性質(zhì)，詳見實(shí)施例29。
[0300]4、采用ELISA法測定血液循環(huán)中以完整納米粒子形式存在的各種FBA-1D/So-P的濃度，作為判斷其在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定性的指標(biāo)，即由包埋在96孔板底部的抗紫杉醇抗體捕獲血清中FBA-1D/So-P，再由生物素標(biāo)記的抗HSA抗體檢測“FBA-1D/So-P”的含量，計(jì)算出血漿半衰期；采用HPLC法測定組織中紫杉醇的含量，以判斷FBA-1D/So-P在腫瘤組織的聚集特征；在荷瘤裸鼠HT29移植瘤模型上，初步判斷FBA-1D/So-P的抑瘤藥效；結(jié)果表明:在動(dòng)物血液循環(huán)中各種FBA-1D/So-P具更好的穩(wěn)定性，其血漿半衰期較Abraxane長50%以上；紫杉醇在腫瘤組織內(nèi)的含量也增加約2?3倍，并產(chǎn)生了更好的抑瘤效果。實(shí)驗(yàn)詳細(xì)結(jié)果詳見實(shí)施例30和實(shí)施例31。
[0301]5、基于前述“3”和“4”同樣的方法，發(fā)現(xiàn):各種FBA-SD/Su-D納米粒子的血漿半衰期顯著長于Doxil3?8倍，且與Doxil和阿霉素注射液相比，顯著增強(qiáng)了對KB移植瘤的抑制作用。此外，F(xiàn)BA-SD/Su-D對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的跨膜作用也明顯高于Doxil。
[0302]6、FBA_SD/Ab的制備技術(shù)顯著降低了抗原性很強(qiáng)的PE38毒素的抗原性，也大幅提高了 PE38LD5(i劑量約60倍，因此，F(xiàn)BA-SD/Ab-PE38是具有人體應(yīng)用開發(fā)的潛力的納米制劑。
[0303]7、使用Babl/c小鼠，在標(biāo)準(zhǔn)GLP的環(huán)境下，單次靜脈注射各種FBA-1D/So-P和Abraxane凍干制劑復(fù)溶液以及泰素溶液，測定小鼠的LD5tl和MTD或LDltl,結(jié)果表明:各種FBA-1D/So-P和Abraxane凍干制劑復(fù)溶液的LD5tl和MTD值均顯著高于泰素，增幅分別為44?56倍和53?71倍；而FBA-1D/So-P與Abraxane之間以及各種FBA-1D/So-P之間LD5tl和MTD值未見顯著性差別，詳見實(shí)施例33。
[0304]本發(fā)明所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米凍干制劑(FBA-Drug NP)的制備方法，有效利用了脂肪酸與白蛋白的生理性、高親和力與穩(wěn)定的結(jié)合特性，在高剪切力的作用下，制備以脂肪酸為核心之一的納米粒子，實(shí)現(xiàn)了 “水不溶性”或“水溶性”藥物、以“溶液”或“超微納米粒子”形式、一種或幾種“包裹”或“結(jié)合”其中，極大地?cái)U(kuò)展了以白蛋白為主要支架材料的納米粒子制備方法的應(yīng)用范圍；所獲FBA-Drug NP僅由白蛋白、藥物和脂肪酸組成，不含其它任何輔料或有機(jī)溶劑等；所獲FBA-Drug NP，體內(nèi)血液循環(huán)和體外溶液的完整性與穩(wěn)定性顯著提高，通過HSA的gp60生理轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,大幅提高了富含gp60受體細(xì)胞內(nèi)或腫瘤組織中的化療藥含量，并進(jìn)而導(dǎo)致荷瘤裸鼠抑瘤率的顯著提高。此外，F(xiàn)BA-Drug NP還可封閉所“包裹”或“結(jié)合”蛋白的抗原位點(diǎn)，并可顯著提高荷載藥物的LD5tl和MTD。為新型藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0305]下面結(jié)合具體實(shí)施范例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明與闡述，但本發(fā)明所涉及的內(nèi)容與范圍不僅僅限于如下范例所述。
[0306]實(shí)施例1
[0307]脂肪酸結(jié)合型白蛋白(Fatty-acid Binding Albumin, FBA) “水不溶性”藥物(Insoluble Drug, ID)納米粒子/溶液型(Solut1n, So)凍干制劑的制備方法(簡稱FBA-1D/So 法)
[0308]-------FBA-1D/So法制備姜黃素(Curcumin，C)納米粒子凍干制劑(FBA-1D/
So-C)
[0309]無菌條件下，取Sigma人血清白蛋白(HSA) 100mg,加注射用水，配制10mg/mlHSAlOOml ;將氯仿和無水乙醇混合液300ul (10:1, v/v)即液體A緩慢滴入10，000轉(zhuǎn)/分鐘(10，OOOrpm)的10mg/ml HSA溶液中，繼續(xù)攪拌10分鐘，獲液體C (留樣SI)。
[0310]將Iug靜脈注射用油酸與1mg姜黃素(Curcumin, C)共溶于10ul氯仿乙醇混合溶液(9:1，v/v)中(液體D)，其中含溶液B即Iug靜脈注射用油酸/10ul氯仿乙醇混合溶液=0.01mg/ml)，再將這種含有油酸、姜黃素、氯仿和乙醇的混合溶液即液體D緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)氯仿乙醇處理的10mg/ml HSA溶液中，攪拌速度為3000rpm,持續(xù)時(shí)間為60分鐘；將這種黃色混懸液迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15分鐘，去除全部有機(jī)溶劑?？色@黃色乳液，其中姜黃素粒子的粒徑為52?116納米(nm)(英國 Malvern Nano Zetasizer ZS90)。
[0311]將此黃色乳液經(jīng)0.22U過濾膜濾過可去除溶液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌溶液；這種無菌溶液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，可得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-姜黃素納米粒凍干制劑(FBA-1D/So-C)。
[0312]實(shí)施例2:FBA-1D/So法制備雷帕霉素(Rapamycin, R)納米粒子凍干制劑(FBA-1D/So-R)
[0313]無菌條件下，取Sigma HSA1800毫克,加注射用水,配制100mg/ml HSA18ml ;將二氯甲烷500ul (液體A)，緩慢滴入8，OOOrpm的100mg/ml HSA溶液，持續(xù)5分鐘，獲液體C (留樣S2)。將90ug靜脈注射用亞油酸與20mg雷帕霉素(Rapamycin, R)共溶于1300ul 二氯甲烷溶液中(液體D)，再將這種含有亞油酸、雷帕霉素和二氯甲烷的混合溶液即液體D緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)二氯甲烷處理的100mg/ml HSA溶液中，攪拌速度為12，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為20分鐘；將這種混懸液迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，可獲半透明乳液，其中雷帕霉素納米粒子的粒徑為88?243nm。
[0314]該半透明乳液經(jīng)0.45u和0.22u過濾膜濾過可去除乳液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌乳液；這種無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，獲得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-雷帕霉素納米粒凍干制劑(FBA-1D/So-R) ；FBA-1D/So-R加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲雷帕霉素納米粒子的粒徑與凍干前一致。
[0315]實(shí)施例3:FBA-1D/So法制備紫杉醇(Paclitaxel, P)納米粒子凍干制劑(FBA-1D/So-P)
[0316]無菌條件下，取Sigma HSA900毫克，加注射用水，配制100mg/ml HSA9ml ;將氯仿和無水乙醇混合溶液(5:5, v/v) 250ul (液體A),緩慢滴入10，OOOrpm的100mg/ml HSA溶液，持續(xù)5分鐘，獲液體C(留樣S3)。將9mg靜脈注射用肉豆蘧酸與10mg紫杉醇(Paclitaxel, P)共溶于650ul氯仿和乙醇混合溶液中(液體D)，再將這種含有肉豆蘧酸、紫杉醇、氯仿和乙醇的混合溶液緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)上述有機(jī)溶劑處理的100mg/ml HSA溶液中，攪拌速度為20，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為10分鐘(此為高速勻漿法，即High SpeedHomogenizing, HS);所獲混懸液迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，可得半透明乳液，其中紫杉醇納米粒子的粒徑為73?221nm ；
[0317]該半透明乳液經(jīng)0.45u和0.22u過濾膜濾過可去除乳液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌乳液；這種無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，獲得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-紫杉醇納米粒凍干制劑(FBA-1D/So-P-1) ；FBA-1D/So-P-l加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲紫杉醇納米粒子的粒徑與凍干前相同。
[0318]實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例所述的高速勻漿法，也可以采用高壓勻漿法替代，獲得相似的結(jié)果，具體步驟如下:將這種含有肉豆蘧酸、紫杉醇、氯仿和乙醇的混合溶液緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)氯仿和乙醇混合溶液處理的100mg/ml HSA溶液中，攪拌速度為10，OOOrpm,持續(xù)時(shí)間為5分鐘，再將這種混合液經(jīng)高壓微射流機(jī)(M-110P Microfluidizer)，在20，OOOpsi壓力下，4°C下，循環(huán)6次(此為高壓勻衆(zhòng)法，即High Pressure Homogenizing, HP)；
[0319]實(shí)施例4:FBA-1D/So法制備紫杉醇納米粒子凍干制劑(FBA-1D/So-P)
[0320]無菌條件下，取Sigma人血白蛋白(HSA) 1800毫克，加注射用水，配制200mg/mlHSA9ml ;將乙酸乙酯溶液1350ul (液體A)，緩慢滴入15，OOOrpm的200mg/ml HSA溶液，持續(xù)2分鐘，獲液體C (留樣S4)。將90mg靜脈注射用甘油三酯與10mg紫杉醇(Paclitaxel，P)共溶于250ul乙酸乙酯溶液中(液體D)，或僅將90mg甘油三酯溶于250ul乙酸乙酯溶液中(溶液B)，再將這種含有甘油三酯、紫杉醇、乙酸乙酯的混合溶液或含有甘油三酯和乙酸乙酯的混合溶液分別緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)“乙酸乙酯”處理的200mg/ml HSA溶液中，攪拌速度為30，OOOrpm，持續(xù)時(shí)間為10分鐘；所得兩種混懸液，迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，可獲兩種半透明乳液，其中紫杉醇納米粒子的粒徑為83?255nm,不含紫杉醇的納米粒子的粒徑為57?181nm。
[0321]兩種半透明乳液經(jīng)0.22U過濾膜濾過可去除乳液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌乳液；這種無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，獲得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-紫杉醇納米粒凍干制劑(FBA-1D/So-P-3)和脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒凍干制劑(FBA) ;FBA和FBA-1D/So-P-3加生理鹽水或注射用水復(fù)溶后，所獲納米粒子的粒徑與凍干前一樣。
[0322]實(shí)施例5:有機(jī)溶劑“處理”白蛋白與脂肪酸在油相和水相中的分布
[0323]將前述實(shí)施例1?4中的樣品SI?S4分別在8°C下、超速離心30，000rpm5小時(shí)，可見有機(jī)相(即油相)與白蛋白相(即水相)的分層，分別取樣，采用酶法(Cayman公司產(chǎn)品)測定油相和水相的游離脂肪酸含量、采用Lowry氏法測定HSA的含量，結(jié)果詳見表I ;對實(shí)施例1Sl樣品增加有機(jī)溶劑處理，如Sl-1樣品和S1-2樣品為分別添加氯仿和乙醇混合液 450ul 和 600ul (9:1, v/v)。
[0324]表I有機(jī)溶劑“處理”白蛋白與脂肪酸在油相和水相中的分布
[0325]
樣品處理前FA/mgHSA* 油相FA 水相FA/mgHSA 油相FA/總FA%
515.4ug/mgHSA屮 Hg l.%ug/mgHSA 61 "
[0326]
S1-1 5.4ug/mg HSA 4.44mg 0.96ug/mgHSA
S1-2 5.4Lig/mgHAS 5.18mg (U2Lig/mgHSA %」％
525.4ug/ing HSA 8.42mg 0.5lug/mgHSAS6.6%
53] ,57ug/mg HSA69.()%
545.4ug/mgHSA 7.57mg 】.01ug/mgHSA77.9%
[0327]*為sigma HSA未經(jīng)處理每毫克白蛋白所含游離脂肪酸的含量。
[0328]由表I可以得出:有機(jī)溶劑處理HSA實(shí)際上是一種“萃取和富集脂肪酸”的過程(下簡稱“萃取”處理)，且經(jīng)處理60%以上的游離脂肪酸分布在有機(jī)溶劑中，即油相之中；而且在此“萃取”處理基礎(chǔ)上，按所述納米粒子制備方法，單純加入有機(jī)溶劑(不加脂肪酸和紫杉醇)“處理” HSA，則可增加油相中脂肪酸的含量或比例。
[0329]實(shí)施例6:加入不同劑量脂肪酸對FBA-1D/So-P粒徑的影響
[0330]無菌條件下，取華蘭生物工程股份有限公司的人血白蛋白(HSA，10% 50ml) 500毫克，加注射用水，配制成50mg/ml HSAlOml ;將氯仿和乙醇混合溶液(8:3, v/v) 10ul (液體A)，緩慢滴入5，OOOrpm的50mg/ml HSA溶液，持續(xù)10分鐘，獲液體C。分別將O, 5mg, 15mg, 30mg靜脈注射用肉豆蘧酸與10mg紫杉醇溶于350ul氯仿和乙醇混合溶液中(為液體 D，各樣品編號分別為 FBA-1D/So-ΡΟ, FBA-1D/So-Pl, FBA-1D/So_P2，F(xiàn)BA-1D/So-P4)，再將這種含有肉豆蘧酸、紫杉醇、氯仿和乙醇的混合溶液即液體D緩慢滴入高速攪拌的經(jīng)“萃取”處理的50mg/ml HSA溶液中，攪拌速度為10，OOOrpm,持續(xù)時(shí)間為5分鐘；這種混合溶液經(jīng)高壓微射流機(jī)，在25，OOOpsi壓力下，4°C下，循環(huán)8次；將此混懸液迅速放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35°C減壓下(20mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，可獲半透明乳液，其中紫杉醇納米粒子的粒徑分別為雙峰(平均粒徑大于300nm)，93?247nm, 85?15Inm和雙峰(平均粒徑大于300nm),詳見表2。
[0331]上述半透明乳液經(jīng)0.22u過濾膜濾過可去除乳液中的細(xì)菌等微生物，成為無菌乳液；這種無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24小時(shí)，獲得FBA-1D/So-P凍干制劑。
[0332]表2加入不同劑量脂肪酸對FBA-1D/So-P粒徑測定影響
[0333]

【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征是包括如下步驟: (1)液體A:為水不相溶的有機(jī)溶劑，或體積比為10?5:5?I的水不相溶的有機(jī)溶劑和無水乙醇的混合液，所述水不相溶的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯；溶液B:用液體A配制濃度為0.0033?360mg/ml的靜脈注射用脂肪酸溶液，所述靜脈注射用脂肪酸為油酸、亞油酸、肉豆蘧酸或甘油三酯；液體C:無菌條件下，用注射用水配制濃度為10?200mg/ml的白蛋白水溶液，按體積比為1:6.67?333的比例將液體A滴入以5，000?15，OOOrpm轉(zhuǎn)速攪拌的白蛋白溶液中，繼續(xù)攪拌2?10分鐘,使與白蛋白結(jié)合的脂肪酸萃取于液體A中，制得液體C ; (2)脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子混懸液的制備: 用下述幾種方式制備: 方式一: 用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為12.5mg/ml?600mg/ml的液體D，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液； 或者，用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為12.5mg/ml?600mg/ml的液體D，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4土 1°C，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液； 液體C中液體A的體積與溶解水不溶性藥物的溶液B的體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為0.4%?17.8%;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.0001%?5% ;水不溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為； 方式二: 1)按I?1mg:lml的比例將水不溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；或按I?1mg:lml的比例將水不溶性藥物與含50?100mg/ml維生素C的注射用水混合；在4±1°C、避光，壓力為15，000?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4°C下、避光、20，000?35，OOOrpm離心10?60min，去除上清液，獲得水不溶性藥物超微納米粒子；按4011^/1]11?600mg/ml比例,將水不溶性藥物超微納米粒子混懸于溶液B中，獲得液體D’，為含脂肪酸、水不溶性藥物超微納米粒子和有機(jī)溶劑的懸液； 2)按體積比為0.3 %?4.0 %的比例，將液體D’滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30, OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌15?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；或按體積比為0.3%?4.0 %的比例，將液體D’滴入攪拌速度為3，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5 土 I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光、壓力為15，OOOpsi?30，OOOpsi下，連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子懸液型混懸液； 液體C中液體A的體積與液體D ’中溶液B體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:0.6%?15.6% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.0001%?1% ;水不溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?25% ； 方式三: 1)按5?1mg:lml的比例將水溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；在4±1°C、避光，壓力為15,000?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4±1°C下、避光、5，000?30，OOOrpm持續(xù)離心10?60min，去除上清液，獲得水溶性藥物超微納米粒子；按6.6mg/ml?375mg/ml比例，將水溶性藥物超微納米粒子混懸于溶液B中，獲得液體D’，為含脂肪酸、水溶性藥物超微納米粒子和有機(jī)溶劑的懸液； 2)按體積比為0.8%?7.0%的比例，將液體D’滴入攪拌速度為12，OOOrpm?32，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5?30分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；或按體積比為0.8%?7.0 %的比例，將液體D’滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4± 1°C，避光、壓力為15，OOOpsi?30，OOOpsi下，連續(xù)3?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液； 液體C中液體A的體積與液體D ’中溶液B的體積之和為油相，液體C中的白蛋白水溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:1%?15.8% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.001%?1.4% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?20% ； 方式四: 1)調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入液體C中，在100?100rpm下攪拌I?4小時(shí)，使水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合制得白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液，即液體C’ ； 2)按體積比為0.8 %?7.5 %的比例將溶液B，滴入攪拌速度為15，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；或按體積比為0.8%?7.5%的比例將溶液B，滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光，壓力為10，OOOpsi?25，OOOpsi下，連續(xù)I?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液； 液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和為油相，而白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:1%?16% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.002%?15% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:1%?25% ; 方式五: 按體積比為1.4%?3.3%的比例，將溶液B滴入攪拌速度為20，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?20分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液；或按體積比為1.4%?3.3%的比例，將溶液B滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5± I分鐘后，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4土 1°C下，避光，壓力為10，OOOpsi?25，OOOpsi下，連續(xù)2?6個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液； 將所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白納米粒子混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35±2°C、20mmHg減壓下，60?80轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20?30分鐘，去除全部有機(jī)溶劑，獲半透明乳液； 調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入半透明乳液中，在250rpm?500rpm下攪拌2?4小時(shí),使水溶性藥物與半透明乳液中白蛋白結(jié)合制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水溶性藥物納米粒子空粒結(jié)合型乳液； 液體C中液體A的體積與溶液B的體積之和為油相，半透明乳液的體積為水相，油相體積與水相體積之比為:2.0%?16.4% ;靜脈注射用脂肪酸與白蛋白的質(zhì)量比為0.001%?3.1% ;水溶性藥物與白蛋白的質(zhì)量比為:2.5%?15% ; 方式六: 1)用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D； 2)按5?1mg:lml的比例將水溶性藥物與含0.4?2mg/ml藥用級維生素E的大豆油混合；在4±1°C、避光，壓力為15,000?30，OOOpsi下勻漿處理I?3次；再經(jīng)4±1°C下、避光、5，OOO?30，OOOrpm持續(xù)離心10?60min，去除上清液，獲得水溶性藥物超微納米粒子; 3)用液體D混懸水溶性藥物超微納米粒子，得到含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液；或用液體D混懸水溶性藥物超微納米粒子，得到含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液，按體積比為0.1%?7.2%的比例，將含脂肪酸、水不溶性藥物、水溶性藥物超微納米粒子的懸液滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5±1分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±1°C，避光，壓力為3，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子懸液型混懸液； 方式七: 1)用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D； 2)調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入液體C中，在100?100rpm下攪拌I?4小時(shí)，使水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合制得白蛋白-水溶性藥物結(jié)合溶液，為液體C’ ； 3)按積比為0.1 %?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為15，OOOrpm?25，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液；或按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C’中，繼續(xù)攪拌5 土 I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4±11:，避光，壓力為6，000?8丨?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子蛋白結(jié)合型混懸液； 方式八 1)用溶液B溶解水不溶性藥物，獲濃度為10mg/ml?400mg/ml的液體D； 2)按積比為0.1 %?7.2 %的比例，將液體D滴入攪拌速度為3，OOOrpm?30，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌10?60分鐘，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液；或按積比為0.1%?7.2%的比例，將液體D滴入攪拌速度為10，OOOrpm?12，OOOrpm的液體C中，繼續(xù)攪拌5土 I分鐘，加入高壓微射流機(jī)進(jìn)料容器中，在4± I°C，避光，壓力為6，OOOpsi?40，OOOpsi下，連續(xù)2?8個(gè)循環(huán)高壓勻漿處理，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液； 3)將脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性藥物納米粒子溶液型混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35±2°C、20mmHg減壓下，60?80轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20?30分鐘，去除全部有機(jī)溶齊U，獲半透明乳液；調(diào)節(jié)水溶性藥物與液體C中白蛋白結(jié)合的條件，將水溶性藥物粉末或水溶性藥物水溶液加入半透明乳液中，在250rpm?500rpm下攪拌2?4小時(shí)，使水溶性藥物與半透明乳液中白蛋白結(jié)合制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-水不溶性和水溶性藥物納米粒子空粒結(jié)合型混懸液； (3)乳液的制備 將步驟(2)中方式一?方式四、方式六和方式七制備的混懸液放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35±2°C，負(fù)壓下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10?30分鐘，去除混懸液中全部有機(jī)溶劑，制得半透明的穩(wěn)定的納米粒子乳液； (4)凍干制劑的制備 將步驟(3)獲得的乳液經(jīng)0.22um膜過濾除菌，或經(jīng)0.45um和0.22um膜過濾除菌，獲無菌乳液，經(jīng)真空冷凍干燥24?36小時(shí)，制得脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑；所述白蛋白為人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征在于步驟(I)中液體A與白蛋白溶液的體積比為1: 36?100。
3.如權(quán)利要求1或2所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征是所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑按質(zhì)量百分比由靜脈注射用脂肪酸0.0001%?8%，白蛋白75%?99%和藥物0.1 %?25%組成，不含有機(jī)溶劑或任何輔料，所述藥物為水不溶性藥物和水溶性藥物至少一種。
4.如權(quán)利要求3所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征是所述靜脈注射用脂肪酸為0.001 %?I %，白蛋白為80 %?95 %，藥物為1.0 %?20%。
5.如權(quán)利要求1、3或4所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征是所述水不溶性藥物是紫杉醇、多烯紫杉醇、雷帕霉素、姜黃素、絲裂霉素、長春新堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、依托泊苷和甲氨蝶呤中至少一種。
6.如權(quán)利要求1、3、或4所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征是所述水溶性藥物是阿霉素、表阿霉素、卡鉬、假單胞菌外毒素中至少一種。
7.如權(quán)利要求1所述脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑的制備方法，其特征是步驟(3)經(jīng)液體A萃取處理后的溶液C中的白蛋白的二級結(jié)構(gòu)不變、白蛋白含有“裸露”的脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)、并以該位點(diǎn)特異性結(jié)合脂肪酸，白蛋白分子的疏水區(qū)域依疏水性與水不溶性藥物結(jié)合，白蛋白分子的親水區(qū)域依親水性與水溶性藥物結(jié)合。
8.權(quán)利要求1?7之一的方法制備的脂肪酸結(jié)合型白蛋白-藥物納米粒子凍干制劑，其特征是具有如下性質(zhì): (1)所述凍干制劑和Abraxane復(fù)溶后，在體外溶液中4°C條件下，測定納米粒子的完整性與穩(wěn)定性分別在136?160小時(shí)和96小時(shí)； (2)所述凍干制劑和Abraxane復(fù)溶后，測定體內(nèi)血液循環(huán)中的所述納米粒子的完整性與穩(wěn)定性分別在35?45小時(shí)和25小時(shí)； (3)所述凍干制劑荷載的藥物進(jìn)入富含gp60受體細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度與同一藥物的靜脈注射劑進(jìn)入同系細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度之比為2?6 ;(4)所述凍干制劑荷載的藥物的LD5tl是同一藥物靜脈注射劑LD5tl的44?60倍；(5)所述凍干制劑荷載的藥物的MTD是同一藥物靜脈注射劑MTD的53?71倍；(6)所述凍干制劑降低所包裹或結(jié)合的假單胞菌外毒素PE38蛋白的抗原性20倍。
【文檔編號】A61K47/48GK104127881SQ201410378748
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】張旋, 王潔銀 申請人:天津派格生物技術(shù)有限公司