用于促進(jìn)血管生成的肽及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及促進(jìn)血管生成的肽及其新用途。更具體地，本發(fā)明涉及促進(jìn)血管生成的肽，以及該肽在促進(jìn)血管生成以及預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病中的用途。本發(fā)明的肽對(duì)促進(jìn)血管生成具有卓越的效果。因此，其對(duì)于預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病以及對(duì)于制備皮瓣的再生、創(chuàng)傷和燒傷愈合、人造皮膚的植入以及用于移植的血管的制備是有用的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于促進(jìn)血管生成的肽及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)要求2010年3月26日提交的韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0-2010-0027374的優(yōu)先權(quán)，其在此通過(guò)引用并入。
[0002]本發(fā)明涉及用于促進(jìn)血管生成的肽及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及促進(jìn)血管生成的肽，以及該肽在促進(jìn)血管生成以及預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病中的用途。

【背景技術(shù)】
[0003]血管供給的發(fā)展是許多生理和病理過(guò)程的基本需求。生長(zhǎng)活躍的組織如胚胎和腫瘤需要充足的血液供給。它們通過(guò)產(chǎn)生促血管生成因子而滿足這種需要，所述促血管生成因子通過(guò)被稱(chēng)為血管生成的過(guò)程而促進(jìn)新血管的形成。血管形成是復(fù)雜而有序的生物學(xué)事件，涉及以下步驟的全部或部分:a)由現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖出內(nèi)皮細(xì)胞，或者由祖細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞；b)EC遷移并聚集形成索樣結(jié)構(gòu)；c)血管索接著經(jīng)過(guò)管生成過(guò)程而形成具有中央管腔的導(dǎo)管；d)現(xiàn)有的索或?qū)Ч荛L(zhǎng)出萌芽而形成次級(jí)導(dǎo)管；e)早期血管叢經(jīng)過(guò)進(jìn)一步重塑和整形；以及f)內(nèi)皮外細(xì)胞被募集以包圍內(nèi)皮管，為導(dǎo)管提供維持和調(diào)節(jié)功能；這樣的細(xì)胞包括細(xì)小毛細(xì)血管的周細(xì)胞，較大導(dǎo)管的平滑肌細(xì)胞，以及心臟中的心肌細(xì)胞(Hanahan, D., Science, 1997, 277, 48 ；Hogan, B.L.&Kolodziej, P.A.Nature ReviewsGenetics, 2002, 3, 513)。
[0004]血管的發(fā)育受到嚴(yán)格控制。目前為止，已知由外周細(xì)胞產(chǎn)生的大量分泌因子調(diào)控EC的分化、增殖和遷移以及聚集成索樣結(jié)構(gòu)。迄今已報(bào)道的促血管生成因子主要可被分成幾組。它們大部分是誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子，具有免疫活性的細(xì)胞因子、激素或脂類(lèi)產(chǎn)物(Bussolino F et al., Trends B1chem.Sc1., 22 (7), pp.251-256, 1997)。
[0005]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已被鑒定為是參與刺激血管生成和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子(Ferrara et al., Endocr.Rev.18:4-25, 1997)。已鑒定了一種鼠 VEGF基因，并且分析了其在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。在鄰近內(nèi)皮如脈絡(luò)叢和腎臟的腎小球的矛形上皮細(xì)胞中觀測(cè)到VEGF的持續(xù)表達(dá)。這些數(shù)據(jù)與VEGF作為調(diào)控EC生長(zhǎng)和分化的多功能因子的作用相一致(Breier, G.et al., Development, 1992, 114, 521)。
[0006]VEGF參與所有結(jié)締組織(例如肺臟、心臟、胎盤(pán)和實(shí)體瘤)中的血管生成(Binetruy-Tourniere et al., EMBO J.2000，19，1525)。例如，VEGF 通過(guò)刺激腫瘤相關(guān)的血管生成而參與實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(Lu et al.，J.B1l.Chem.2003，278，43496)。此外，由于VEGF表達(dá)在結(jié)締組織修復(fù)中是必需的，因而提出利用VEGF來(lái)修復(fù)結(jié)締組織。
[0007]事實(shí)上，Chen等在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,073,492(1991年12月17日)中公開(kāi)了在合適的環(huán)境中協(xié)同增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括向環(huán)境中添加VEGF，效應(yīng)物和血清來(lái)源的因子。此外，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)制備了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C亞基DNA。該DNA編碼可作為異型二聚體或同型二聚體存在的蛋白。該蛋白是哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，并且如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2302750.2 (1992年9月30日)中所述，實(shí)際上已知其具有促進(jìn)血管發(fā)育和修復(fù)的用途。
[0008]盡管關(guān)于VEGF仍在發(fā)展，但是進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，由于其較大的分子大小(與其他蛋白類(lèi)似)而不能穿過(guò)血液屏障，并且由于其較短的半衰期而在短時(shí)間內(nèi)被消除。雖然還在積極進(jìn)行研究以發(fā)現(xiàn)參與血管生成的重要的EC特異性基因，并因而治療各種血管生成相關(guān)疾病，但是目前還實(shí)質(zhì)性結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]技術(shù)問(wèn)題
[0010]本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)了可替代血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的肽。通過(guò)合成幾種新的肽，之后重復(fù)取代、添加和缺失它們的殘基以及篩選有效的衍生物，本發(fā)明人合成了具有促進(jìn)血管生成作用的新的肽。
[0011]本發(fā)明涉及提供了用于促進(jìn)血管生成的分離的肽，其具有通式(I)或(II)所示的氨基酸序列:
[0012](I) [N-末端-X1X2X3X4X5X6 - C-末端]
[0013](II) [C-末端-X1X2X3X4X5X6 - N-末端]
[0014]其中Xl表示不存在或?yàn)橘?lài)氨酸，X2表示不存在或?yàn)楸彼峄蚬劝滨０?，X3為甘氨酸或脯氨酸，X4表示不存在或?yàn)閴A性氨基酸，X5表示酸性氨基酸，以及X6為絲氨酸。
[0015]此外，本發(fā)明涉及提供了用于促進(jìn)血管生成的分離的肽，其具有通式(III)所示的氨基酸序列:
[0016](III) [N-末端-X1X2X5X6 - C-末端]
[0017]其中Xl為天冬酰胺，X2為谷氨酰胺，X5為酸性氨基酸，以及X6為絲氨酸。
[0018]本發(fā)明還涉及提供了用于促進(jìn)血管生成的肽在制備皮瓣的再生、創(chuàng)傷和燒傷愈合，人造皮膚的植入以及用于移植的血管的制備中的用途。
[0019]本發(fā)明還涉及提供了所述肽在預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病中的用途，所述血管生成相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓,缺血性心肌病,缺血性腦病，心力衰竭，急性后循環(huán)缺血(acute poster1r ischemia),褥瘡,慢性潰瘍,脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。
[0020]技術(shù)方案
[0021]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了具有通式⑴或(II)所示的氨基酸序列的分離的肽:
[0022](I) [N-末端-X1X2X3X4X5X6 - C-末端]
[0023](II) [C-末端-X1X2X3X4X5X6 - N-末端]
[0024]其中Xl表示不存在或?yàn)橘?lài)氨酸，X2表示不存在或?yàn)楸彼峄蚬劝滨０罚琗3為甘氨酸或脯氨酸，X4表示不存在或?yàn)閴A性氨基酸，X5表示酸性氨基酸，以及X6為絲氨酸。
[0025]為實(shí)現(xiàn)另一目的，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)血管生成的分離的肽，其具有通式(III)所示的氨基酸序列:
[0026](III) [N-末端-X1X2X5X6 - C-末端]
[0027]其中Xl為天冬酰胺，X2為谷氨酰胺，X5為酸性氨基酸，以及X6為絲氨酸。
[0028]為實(shí)現(xiàn)另一目的，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)血管生成的組合物，其包含所述肽作為活性成分。
[0029]為實(shí)現(xiàn)另一目的，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含所述肽作為活性成分，所述血管生成相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓,缺血性心肌病,缺血性腦病，心力衰竭，急性后循環(huán)缺血，褥瘡，慢性潰瘍，脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。為實(shí)現(xiàn)又一目的，本發(fā)明提供了選自本發(fā)明肽、用作治療劑或診斷劑的肽。
[0030]為實(shí)現(xiàn)再一目的，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽在制備促進(jìn)血管生成的藥劑中的用途。
[0031]為實(shí)現(xiàn)另一目的，本發(fā)明提供了通過(guò)給予有需要的個(gè)體有效量的本發(fā)明的肽來(lái)促進(jìn)血管生成的方法。
[0032]為實(shí)現(xiàn)另一目的，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽在制備用于預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病的藥劑中的用途，所述血管生成相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓，缺血性心肌病，缺血性腦病，心力衰竭，急性后循環(huán)缺血，褥瘡，慢性潰瘍，脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。
[0033]為實(shí)現(xiàn)又一目的，本發(fā)明提供了通過(guò)給予有需要的個(gè)體有效量的本發(fā)明的肽來(lái)預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病的方法，所述血管生成相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓,缺血性心肌病，缺血性腦病，心力衰竭，急性后循環(huán)缺血，褥瘡，慢性潰瘍，脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。
[0034]以下，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0035]本文所使用的氨基酸根據(jù)IUPAC-1UB命名法描述如下:
[0036]精氨酸:R，組氨酸:H
[0037]賴(lài)氨酸:K，天冬氨酸:D
[0038]谷氨酸:E，絲氨酸:S
[0039]蘇氨酸:T，天冬酰胺:Ν
[0040]谷氨酰胺:Q，半胱氨酸:C
[0041]甘氨酸:G，脯氨酸:P
[0042]丙氨酸:A，異亮氨酸:I
[0043]亮氨酸:L，蛋氨酸:M
[0044]苯丙氨酸:F，色氨酸:W
[0045]酪氨酸:Y，纈氨酸V
[0046]本發(fā)明提供了用于促進(jìn)血管生成的肽，其具有通式(I)或(II)所示的氨基酸序列:
[0047](I) [N-末端-Χ1Χ2Χ3Χ4Χ5Χ6 - C-末端]
[0048](II) [C-末端-Χ1Χ2Χ3Χ4Χ5Χ6 - N-末端]
[0049] 具有通式(I)或(II)所示的氨基酸序列的肽表征如下:X1表示不存在或?yàn)橘?lài)氨酸，X2表示不存在或?yàn)楸彼峄蚬劝滨０罚琗3為甘氨酸或脯氨酸，X4表示不存在或?yàn)閴A性氨基酸，X5表示酸性氨基酸，以及X6為絲氨酸。
[0050]本發(fā)明的肽具有非極性氨基酸-X-酸性氨基酸-絲氨酸的基本結(jié)構(gòu)，并且在非極性氨基酸和酸性氨基酸(X)之間可以具有堿性氨基酸，并且在非機(jī)械氨基酸的前面還可以包含賴(lài)氨酸和/或(丙氨酸或谷氨酰胺)添加序列(通式(I))。此外，本發(fā)明的肽可以包含所述氨基酸序列的反向序列。
[0051]本發(fā)明提供了用于促進(jìn)血管生成的肽，其具有通式(III)所示的氨基酸序列:
[0052](III) [N-末端-X1X2X5X6 - C-末端]
[0053]具有通式(III)所示的氨基酸序列的肽表征如下:X1為天冬酰胺，X2為谷氨酰胺，X5為酸性氨基酸，以及X6為絲氨酸。
[0054]具有本發(fā)明通式(III)所示的氨基酸序列的肽具有天冬酰胺-谷氨酰胺-酸性氨基酸-絲氨酸的基本結(jié)構(gòu)。
[0055]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了具有選自序列通式(I)至(III)這種結(jié)構(gòu)的肽促進(jìn)血管生成的作用。
[0056]優(yōu)選地，在具有選自序列通式⑴至(III)的通式所示的氨基酸序列的肽中，所述堿性氨基酸可以是精氨酸、組氨酸或賴(lài)氨酸。所述酸性氨基酸可以是天冬氨酸或谷氨酸。
[0057]本發(fā)明的肽可以是具有選自序列通式⑴至(III)的通式所示的氨基酸序列的任何一種肽，但是優(yōu)選地，其可以是具有選自SEQ ID N0.1至4的氨基酸序列的肽。
[0058]本發(fā)明的肽顯示出促進(jìn)血管生成的作用。其長(zhǎng)度雖然并未被特別限定，只要其包含選自序列通式(I)至(III)的通式所示的氨基酸序列即可，但是優(yōu)選地，其可以包含選自序列通式(I)至(III)的通式所示的氨基酸序列且由4至50個(gè)氨基酸組成，更優(yōu)選由4至30個(gè)氨基酸組成。更優(yōu)選地，其可以是具有選自序列通式(I)至(III)的通式所示的氨基酸序列的肽。最優(yōu)選地，本發(fā)明的肽可以是具有選自SEQ ID N0.1至4的氨基酸序列的肽。
[0059]此外，本發(fā)明的肽可以是C-末端被酰胺化的肽。為了防止肽在體內(nèi)受蛋白酶降解并增強(qiáng)穩(wěn)定性，用各種保護(hù)基團(tuán)修飾或保護(hù)N-末端和C-末端。也就是說(shuō)，可以修飾肽的C-末端以提高穩(wěn)定性。修飾并未被特別限定，但是優(yōu)選地，可以通過(guò)羥基(-OH)或氨基(-NH2)基團(tuán)來(lái)修飾。C-末端的酰胺化意味著用氨基(-NH2)基團(tuán)來(lái)修飾肽的C-末端。
[0060]此外，可以修飾肽的N-末端以提高穩(wěn)定性。修飾并未被特別限定，但是優(yōu)選地，可以通過(guò)選自乙?；④碳籽豸驶?Fmoc)、甲酰基、棕櫚?；?、肉豆蘧基、硬脂?；途垡叶?PEG)的基團(tuán)來(lái)修飾。
[0061]本發(fā)明的肽可以根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的方法來(lái)制備。例如，其可以利用自動(dòng)肽合成儀來(lái)合成，或其可以通過(guò)基因改造技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。例如，通過(guò)基因改造產(chǎn)生編碼融合蛋白(包含融合伴侶和本發(fā)明的肽)的融合基因之后，用融合基因轉(zhuǎn)染宿主微生物并在宿主微生物中表達(dá)融合蛋白，利用合適的蛋白酶或化合物可以從融合蛋白中切割并分離出本發(fā)明的肽。為此，可以在融合伴侶和本發(fā)明肽基因之間插入編碼可被蛋白酶(如Xa因子或腸激酶)或化合物(如CNBr或羥胺)切割的氨基酸殘基的DNA序列。例如，為了提供CNBr的切割位點(diǎn)，在要被限制性酶切割的融合伴侶的3’-末端插入包含蛋氨酸密碼子具有匹配的閱讀框的限制性位點(diǎn)(如 AflII1、Bsm1、BspH1、BspLUlI1、Nco1、Nde1、Nsi1、PpulO1、SphI或StyI)或其同裂酶位點(diǎn)。并且，可以在本發(fā)明肽的基因的5’-末端插入與閱讀框相連接的限制性位點(diǎn)，其被酶切割以連接融合伴侶和本發(fā)明肽的基因。
[0062]作為另一個(gè)實(shí)例，為了提供羥胺的切割位點(diǎn)，可以在融合伴侶基因和本發(fā)明肽的基因之間插入能夠編碼天冬酰胺-甘氨酸的DNA序列。例如，當(dāng)兩個(gè)基因融合時(shí)，可以在要被限制性酶切割的融合伴侶的3’-末端插入包含天冬酰胺密碼子具有匹配的閱讀框的限制性位點(diǎn)或其同裂酶位點(diǎn)，由此形成與酶相容的末端或平末端。并且，可以在本發(fā)明肽的基因的5’ -端插入包含甘氨酸密碼子并與其閱讀框相連接的限制性位點(diǎn)，接著其被限制性酶切割以連接融合伴侶基因和本發(fā)明肽的基因?？梢詫⒈景l(fā)明的基因構(gòu)建體插入到常用的表達(dá)載體中，例如質(zhì)粒、病毒或允許用于克隆的結(jié)構(gòu)基因插入或并入宿主細(xì)胞中的媒介。
[0063]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，利用自動(dòng)肽合成儀合成具有SEQ ID N0.1至7的氨基酸序列的肽，接著通過(guò)C18反相高效液相色譜分離。
[0064]本發(fā)明的肽具有促進(jìn)人或動(dòng)物血管生成的作用。
[0065]本發(fā)明首次鑒定了具有本發(fā)明的氨基酸序列的肽促進(jìn)血管生成的作用。
[0066]通過(guò)利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證促進(jìn)血管生成作用。
[0067]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，測(cè)試了用本發(fā)明的肽處理HUVEC是否能促進(jìn)HUVEC的增殖。結(jié)果證實(shí)了用本發(fā)明的肽處理促進(jìn)了 HUVEC的增殖(實(shí)施例2)。
[0068]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，研究了本發(fā)明的肽對(duì)HUVEC遷移的作用。將本發(fā)明的肽放到具有聚碳酸酯濾膜(其下有孔)的腔室的底部并在腔室的上部添加HUVEC，孵育后對(duì)遷移到底部的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并與對(duì)照組相比較。結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的肽促進(jìn)了 HUVEC的遷移(實(shí)施例3)。
[0069]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)例中，研究了本發(fā)明的肽對(duì)HUVEC管腔形成的作用。在平板上施加基質(zhì)膠(Matrigel)并使其硬化之后，添加本發(fā)明的肽和HUVEC的混合物(在緩沖液中)，觀測(cè)HUVEC在基質(zhì)膠中是否形成管腔。結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的肽促進(jìn)HUVEC的管腔形成(實(shí)施例4)。
[0070]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，進(jìn)行體內(nèi)基質(zhì)膠塞(Matrigel plug)分析以測(cè)定本發(fā)明的肽促進(jìn)血管生成的能力。用本發(fā)明的肽和基質(zhì)膠的混合物皮下注射小鼠之后，I周后取出基質(zhì)膠塞并定量血管形成的程度。結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比，注射本發(fā)明的肽顯示出明顯更優(yōu)的血管形成(實(shí)施例5)。
[0071]同樣地，本發(fā)明的肽通過(guò)血管細(xì)胞的增殖、遷移和分化來(lái)促進(jìn)血管生成。因此，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)血管生成的組合物，其包含本發(fā)明的肽作為活性成分。此外，本發(fā)明提供了用作治療劑和診斷劑的肽。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽在制備用于促進(jìn)血管生成的藥劑中的用途。另外，本發(fā)明提供了通過(guò)給予有需要的個(gè)體有效量的本發(fā)明的肽來(lái)促進(jìn)血管生成的方法。
[0072]此外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含本發(fā)明的肽作為活性成分。另外，本發(fā)明提供了所述肽在制備用于預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病的藥劑中的用途，所述血管生成相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓,缺血性心肌病,缺血性腦病,心力衰竭，急性后循環(huán)缺血，褥瘡，慢性潰瘍，脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。此外，本發(fā)明提供了通過(guò)給予有需要的個(gè)體有效量的本發(fā)明的肽來(lái)預(yù)防或治療血管生成相關(guān)疾病的方法，所述血管生成相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓,缺血性心肌病,缺血性腦病,心力衰竭，急性后循環(huán)缺血，褥瘡，慢性潰瘍，脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。
[0073]本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的肽作為有效成分的組合物，本發(fā)明的組合物可以與另一種生物活性劑如生物活性化合物、肽等組合給予。本發(fā)明的組合物還可以包含能夠分化成內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的細(xì)胞。優(yōu)選地，能夠分化成EC的細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或造血干細(xì)胞。
[0074]優(yōu)選地，用于促進(jìn)血管生成的本發(fā)明的組合物可以用于皮瓣的再生、創(chuàng)傷和燒傷愈合，人造皮膚的植入，或者用于移植的血管的制備，但是并不限于此。血管疾病是指由于多種原因?qū)е碌难墚惓Ｒ鹧夯蜓鯕夤┙o不足而發(fā)生或惡化的疾病。優(yōu)選地，非限制性示例可包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼，糖尿病足潰瘍，肺高血壓，缺血性心肌病，缺血性腦病，心力衰竭，急性后循環(huán)缺血，褥瘡，慢性潰瘍，脫發(fā)或頭發(fā)變白，肥胖相關(guān)的心血管疾病以及缺血。
[0075]諸如心肌梗塞、絞痛等的心血管疾病是由血管梗阻或狹窄引起的。通過(guò)血流的氧氣和營(yíng)養(yǎng)素供給不足致使組織和器官功能異常。如果心肌發(fā)生這樣的血管功能異常，心臟會(huì)停止跳動(dòng)，導(dǎo)致心肌梗塞或絞痛。如果在手或腳末端發(fā)生，會(huì)引起缺血性肢體病。在這種情況下，病人由于極端疼痛而必須服用精神活性鎮(zhèn)痛劑。在重度病例中，其結(jié)果為截肢或死亡。
[0076]缺血性心力衰竭是由于血管梗阻或狹窄致使血液供給減少而導(dǎo)致氧氣不足所引起的。
[0077]糖尿病神經(jīng)病變(足潰瘍)是最常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，發(fā)生于50%或更多的糖尿病患者。糖尿病患者的血管中高水平的血糖致使細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致足部毛細(xì)血管和神經(jīng)細(xì)胞死亡。
[0078]糖尿病視網(wǎng)膜病變起因于糖尿病引起的毛細(xì)血管壁的損傷(基底膜增厚，血管壁細(xì)胞減少，以及EC過(guò)度增殖)，導(dǎo)致毛細(xì)血管狹窄和梗阻，以及視網(wǎng)膜微脈管循環(huán)不足。
[0079]創(chuàng)傷是指皮膚組織的損傷，如外科手術(shù)切口，消化道潰瘍，燒傷，撕裂和皮膚潰瘍(如褥瘡)。通常，創(chuàng)傷的治療包括急救并等到傷口自我愈合，這需要很長(zhǎng)的時(shí)間。一般，傷口愈合受傷口處發(fā)生的細(xì)胞增殖和新結(jié)締組織或上皮組織形成的影響。對(duì)于傷口愈合，促進(jìn)或刺激細(xì)胞的增殖和分化是有效的。
[0080]脫發(fā)是由多種原因?qū)е碌?，但是已知由鄰近血管向發(fā)根充足供給營(yíng)養(yǎng)素有助于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)脫發(fā)。
[0081]上述疾病由于多種原因?qū)е卵墚惓Ｔ斐裳夯蜓鯕夤┙o不足而發(fā)生或惡化，并且可以通過(guò)血管植入或血管搭橋來(lái)改善。因此，所述包含本發(fā)明的肽作為有效成分的組合物可用于血管發(fā)生或者制備用于移植的血管，以改善或治療這些疾病。
[0082]本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)包含本發(fā)明的肽，或者包含本發(fā)明的肽與一種或多種藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。可以包含藥學(xué)可接受的載體，例如，用于腸胃外制劑或口服制劑的載體。用于腸胃外制劑的載體可以包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸。此外，用于腸胃外制劑的載體可以包括水、油、鹽水、含水葡萄糖和乙二醇，以及穩(wěn)定劑和防腐劑。穩(wěn)定劑的實(shí)例可以是抗氧化劑，例如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及抗壞血酸。防腐劑的實(shí)例可以是苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯以及氯代丁醇。藥學(xué)可接受載體的列表公開(kāi)于《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack 出版公司,Easton, PA, 1995)。
[0083]本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任何途徑給予包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。例如，其可以經(jīng)腸胃外或經(jīng)口給藥。對(duì)于腸胃外給藥，其可以通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、硬膜下、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、胃腸道、腸胃外、舌下或直腸經(jīng)腸胃外給藥，但并不限于此。對(duì)于局部給藥，其包括霜?jiǎng)④浉鄤?、凝膠和透皮貼劑，但并不限于此。
[0084]本發(fā)明的藥物組合物可以被制備成如上所述的口服制劑或腸胃外制劑的形式。
[0085]對(duì)用于口服給藥的配方而言，可以利用本領(lǐng)域已知的方法將本發(fā)明的組合物配制成粉劑、顆粒劑、片劑、丸劑和糖衣片劑、膠囊劑、液體、凝膠、糖漿、懸浮液和乳劑。例如，用于口服給藥的制劑可以通過(guò)將有效組分和固體賦形劑混合、研磨并添加合適的補(bǔ)充劑，接著生產(chǎn)成顆?；旌衔锏男问?，以片劑或糖衣片劑的形式獲得。合適的賦形劑的實(shí)例可以包括:糖類(lèi)，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇和麥芽糖醇；淀粉類(lèi)，包括玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素類(lèi)，包括纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基甲基纖維素；以及填料，包括明膠和聚乙烯吡咯烷酮。此外，如果需要，其可以包含交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或藻酸鈉作為溶解劑(soIut1nizer)。另外,本發(fā)明的藥物組合物可包含抗凝劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、矯味劑、乳化劑和防腐劑。
[0086]對(duì)用于腸胃外給藥的配方而言，可以利用本領(lǐng)域已知的方法將本發(fā)明的組合物配制成注射劑、霜?jiǎng)?、洗劑、軟膏劑、油、?rùn)濕劑、凝膠、洗眼劑、氣溶膠和鼻用吸入劑。
[0087]優(yōu)選地，無(wú)菌注射劑可以是無(wú)毒且腸胃外可接受的溶劑或懸浮液中的一種。對(duì)于藥學(xué)可接受的載體和媒介，有鹽水、緩沖鹽水、等滲鹽水(例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂或其混合物)、林格氏溶液、葡萄糖、水、無(wú)菌水、甘油、乙醇及其混合物。優(yōu)選地，作為溶劑或懸浮液介質(zhì)，使用1，3-丁二醇和無(wú)菌固定油。脂肪酸如油酸也可以用于制備注射劑。
[0088]洗眼劑可以是水溶性眼用溶液，水不溶性眼用溶液或眼用乳劑。本發(fā)明的洗眼劑通過(guò)將本發(fā)明的肽溶解或懸浮于水溶性溶劑(如無(wú)菌水或鹽水)或水不溶性溶劑(如棉籽油或大豆油的植物油)中制備。在這種情況下，等滲劑、PH調(diào)節(jié)劑、增稠劑、懸浮劑、乳化劑、防腐劑以及與其類(lèi)似的藥學(xué)可接受的添加劑。具體地，等滲劑包括氯化鈉、硼酸、硝酸鈉、硝酸鉀、D-甘露醇和葡萄糖。增稠劑的具體實(shí)例包括硼酸、無(wú)水硫酸鈉、鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、硝酸、乙酸鉀、碳酸鈉以及硼砂。pH調(diào)節(jié)劑的具體實(shí)例包括甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、硫酸軟骨素鈉以及聚乙烯吡咯烷酮。懸浮劑的具體實(shí)例包括聚山梨酯80和聚氧乙烯以及氫化蓖麻油。乳化劑的具體實(shí)例包括蛋黃卵磷脂和聚山梨酯80，但不限于此。防腐劑的具體實(shí)例包括苯扎氯銨、芐索氯銨、氯丁醇、苯乙醇以及對(duì)羥基苯甲酸酯，但不限于此。配方公布于《雷明頓藥物科學(xué)》(第15版，1975, Mack Publishing Company, Easton,PennsyIvanial8042, 87 章:Blaug, Seymour)。
[0089]優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物可包含0.001-99.999重量百分比和99.999-0.0001
重量百分比的藥學(xué)可接受的載體。
[0090]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)量是指向有需要的個(gè)體遞送的藥物的量，或者對(duì)促進(jìn)血管生成顯示起作用的量以及對(duì)預(yù)防或治療個(gè)體中血管生成相關(guān)疾病有作用的量，并且涉及哺乳動(dòng)物，優(yōu)選涉及包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，其可以是源自動(dòng)物的細(xì)胞、器官和組織。個(gè)體可以是需要治療疾病的病人。
[0091]本發(fā)明組合物的總的有效量可以以單劑量給予病人，或者可以通過(guò)分次治療方案以多劑量給予。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度，本發(fā)明的藥物組合物可包含不同量的有效成分。優(yōu)選地，本發(fā)明肽的總量是約0.0001 μ g至500mg/kg體重/日，最優(yōu)選地，其可以是0.01 μ g至100mg/kg體重/日。然而，所述肽的劑量可以通過(guò)考慮多種因素而適當(dāng)?shù)卮_定，例如需要治療的個(gè)體的年齡、體重、健康狀況、性別，疾病嚴(yán)重程度、飲食和排泄，以及給藥時(shí)間和給藥途徑。因而，這些都被考慮時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于特定用途的組合物的合適劑量。本發(fā)明的藥物組合物可不限定制劑、給藥途徑和給藥方法，只要它們能顯示本發(fā)明的效果即可。
[0092]有益效果
[0093]由上述可見(jiàn)，本發(fā)明提供了新的肽，用于促進(jìn)血管生成的包含該肽作為活性成分的組合物。本發(fā)明的肽對(duì)促進(jìn)血管生成具有卓越的效果，本發(fā)明的藥物組合物促進(jìn)血管生成的作用優(yōu)于VEGF，并且由于其分子量更低，與VEGF相比更容易滲透入血管和組織。因此，包含所述肽的組合物對(duì)于預(yù)防和/或治療血管生成相關(guān)疾病和對(duì)于制備皮瓣的再生、創(chuàng)傷和燒傷愈合，人造皮膚的植入以及用于移植的血管的制備是有用的。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0094]圖1比較了本發(fā)明的肽對(duì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖的作用(No:陰性對(duì)照，VEGF:陽(yáng)性對(duì)照，Pep_7至10:SEQ ID N0.1至4的肽)；
[0095]圖2比較了本發(fā)明的肽對(duì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)遷移的作用(No:陰性對(duì)照，VEGF:陽(yáng)性對(duì)照，Pep_7至10:SEQ ID N0.1至4的肽)；以及
[0096]圖3顯示了由本發(fā)明的肽促進(jìn)的EC管腔形成的攝影圖片(No:陰性對(duì)照，VEGF:陽(yáng)性對(duì)照，Pep_7至10:SEQ ID N0.1至4的肽)。
[0097]實(shí)施方式
[0098]以下，將通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例僅是說(shuō)明的目的，并不應(yīng)當(dāng)解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0099]實(shí)施例1肽的制備
[0100]具有表1中所示的氨基酸序列的肽利用自動(dòng)肽合成儀(Milligen9050, Millipore, USA)合成，接著通過(guò) C18 反相高效液相色譜(HPLC) (WatersAssociates, USA)完全分離。使用了 ACQUITY UPLC BH1300C18 柱(2.1xlOOmm, 1.7um, WatersCo, USA)。
[0101]表1所制備的肽的氨基酸序列
[0102]

【權(quán)利要求】
1.分離的肽，其由SEQID NO:1所示的氨基酸序列組成。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的肽，其中所述肽在其C-末端處被酰胺化。
3.用于促進(jìn)血管生成的組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的肽作為活性成分。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述組合物用于皮瓣的再生、創(chuàng)傷和燒傷愈合、人造皮膚的植入或用于移植的血管的制備。
5.用于預(yù)防或治療缺血性心肌病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的肽作為活性成分。
6.用作治 療劑或診斷劑的權(quán)利要求1或2所述的分離的肽。
7.權(quán)利要求1或2所述的肽在制備用于促進(jìn)血管生成的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1或2所述的肽在制備用于預(yù)防或治療缺血性心肌病的藥物中的用途。
9.包含權(quán)利要求1或2所述的肽的組合物。
【文檔編號(hào)】A61P17/02GK104072584SQ201410332373
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2010年3月26日
【發(fā)明者】趙大鎬, 方士翊, 樸正敏, 尹善瑛, 金相潤(rùn), 李哈蘭, 樸琉棽, 孫周我 申請(qǐng)人:淑明女子大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán), 一洋藥品株式會(huì)社, 三星生命公益財(cái)團(tuán)