心腦欣膠囊在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了心腦欣膠囊在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證實(shí)了心腦欣膠囊能明顯降低大鼠的行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率、NO含量以及NOS活力，改善血液流變動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，并且可濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮的血管。
【專利說明】心腦欣膠囊在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及心腦欣膠囊在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，缺血性腦血管病嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量。腦缺血又稱腦梗死，是一類由于腦 血流供應(yīng)障礙引起缺血、缺氧，導(dǎo)致局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化的疾病，而腦缺血再 灌注損傷是引發(fā)多種腦血管疾病的重要病理生理機(jī)制。腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織 在恢復(fù)血液灌注后，腦組織損傷進(jìn)一步加重，其發(fā)生機(jī)制尚未徹底闡明。近年來，隨著臨床 醫(yī)學(xué)上休克治療的進(jìn)展及動(dòng)脈搭橋術(shù)和溶栓療法等的推廣應(yīng)用，使缺血再灌注損傷的研究 成為當(dāng)前關(guān)注的項(xiàng)目之一，其中藥物性保護(hù)作用也越來越受到重視。
[0003] 心腦欣膠囊為三普藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025866,主治益氣養(yǎng)陰、 活血化瘀。但作用在治療腦缺血再灌注損傷中還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供心腦欣膠囊的新應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明公開了心腦欣膠囊在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
[0006] 上述的心腦欣膠囊，優(yōu)選由以下重量份數(shù)組分組成：紅景天3?6份，枸杞5?15 份，沙棘3?9份。
[0007] 有益效果：本發(fā)明證實(shí)了心腦欣膠囊能明顯降低大鼠的行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率、N0 含量以及NOS活力，改善血液流變動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，并且可濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮的血管。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1為心腦欣膠囊對(duì)MCA0模型大鼠腦梗死的影響；
[0009] 圖2為心腦欣膠囊對(duì)MCA0模型大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響（HE染色，X100);
[0010] 圖3為心腦欣膠囊對(duì)MCA0模型大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響（HE染色，X200);
[0011] 圖4心腦欣膠囊對(duì)NE預(yù)收縮血管的舒張率的影響n=6)注：與假手術(shù)組比 較，#P〈0. 05, ##P〈0. 01 ;與模型組比較，*P〈0. 05, **P〈0. 01。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1 :
[0013] 心腦欣膠囊由重量份數(shù)為3份的紅景天、5份的枸杞和3份的沙棘混合而成。
[0014] 實(shí)施例2 :
[0015] 心腦欣膠囊由重量份數(shù)為4份的紅景天、10份的枸杞和6份的沙棘混合而成。
[0016] 實(shí)施例3:
[0017] 心腦欣膠囊由重量份數(shù)為5份的紅景天、12份的枸杞和8份的沙棘混合而成。
[0018] 實(shí)施例4:
[0019] 心腦欣膠囊由重量份數(shù)為6份的紅景天、15份的枸杞和9份的沙棘混合而成。
[0020] 實(shí)施例5:
[0021] 心腦欣膠囊治療腦缺血再灌注損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0022] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0023] 1. 1藥物與試劑
[0024] 心腦欣膠囊，內(nèi)容物為棕褐色粉末，0. 5g/粒，批號(hào)：120803,三普藥業(yè)股份有限公 司；實(shí)驗(yàn)時(shí)，去除膠囊外殼，研磨內(nèi)容物，用雙蒸水配置成所需濃度。喜得鎮(zhèn)，規(guī)格：lmg，批 號(hào)：2L850T，天津華津制藥有限公司；實(shí)驗(yàn)時(shí)，研磨為粉末，用雙蒸水配置成所需濃度。
[0025] -氧化氮（N0)試劑盒、一氧化氮合酶（N0S)試劑盒、考馬斯亮試劑盒均購(gòu)自南京 建成科技有限公司；TTC購(gòu)自南京優(yōu)思博有限公司。其他試劑均為分析純。
[0026] 1. 2儀器
[0027] 電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo,美國(guó)）；96孔培養(yǎng)板 (Costar，美國(guó)）；電動(dòng)勻漿機(jī)；北京賽科希德SA-6000血流變儀；北京賽科希德SC-2000血 小板聚集儀；臺(tái)式離心機(jī)Kubota5800(久保田公司，日本）；數(shù)控超級(jí)恒溫箱；肌張力傳感 器，型號(hào)JH-2 ;恒溫平滑肌槽，型號(hào)HW-400SE;BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，以上均為成都泰 盟科技有限公司產(chǎn)品。
[0028]1. 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0029] 成年雄性SD大鼠，體重200?250g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn) 許可證號(hào)：SCXK(蘇）2012-0004。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜節(jié)律，室溫22±1°C，自由飲 水?dāng)z食。
[0030] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0031] 2. 1給藥、分組及造模
[0032] 大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、陽性藥組、心腦欣膠囊低劑量組、中劑量組 及高劑量組。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7d;給藥劑量：喜得鎮(zhèn)組為0. 8mg/kg/d，心腦欣 低、中、高劑量組為100、200、4001^/1^/(1，末次給藥11 1后手術(shù)。模型組及假手術(shù)組灌胃相同 容積水。分別于再灌注lh、24h后檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。
[0033]大鼠中動(dòng)脈栓塞模型（middlecerebralarteryocclusion，MCA0)的制備：手術(shù) 采用改進(jìn)Longa線栓法復(fù)制大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型。大鼠10%水合氯醛腹 腔注射（lg/kg)麻醉后，將其仰臥固定。分離右頸總動(dòng)脈（CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA)及頸外動(dòng) 脈（ECA)并掛線備用，結(jié)扎ECA與CCA，用動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端后，迅速于ECA與ICA分 叉處作一切口，從切口處插入一端加熱成光滑球形魚線（直徑為〇. 25mm，距球端2cm處作 標(biāo)記）。線插入ICA后，于入口處稍稍結(jié)扎魚線與入口處ICA段，然后松開夾閉ICA的動(dòng)脈 夾，繼續(xù)插入魚線至稍有阻力后略回撤，至線插入深度為（18. 5±0. 5)mm左右，實(shí)現(xiàn)大腦中 動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。再次結(jié)扎入口處，魚線外留約lcm，縫合皮膚。2h后輕輕提拉所留線 頭至有阻力，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌，則造模完成。假手術(shù)組只結(jié)扎ECA與ICA。在全部造模 過程中保持動(dòng)物肛溫在37 °C左右。
[0034] 2. 2大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分
[0035] 整個(gè)評(píng)分采用單盲法，即評(píng)分者不知道實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況。采用longa的5分評(píng) 分標(biāo)準(zhǔn)。0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾 倒；4分為不能自行行走，意識(shí)喪失。剔除0分、4分和術(shù)后死亡動(dòng)物，達(dá)到1、2、3分的動(dòng)物 均為造模成功?；謴?fù)供血lh及24h后分別測(cè)定大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。
[0036] 2. 3腦組織勻漿的制備
[0037] 大鼠股動(dòng)脈取血后，立即將其脫頸椎處死，于冰浴上取出大腦組織，在預(yù)冷的生理 鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重。按重量體積比加生理鹽水制成10 %的組織勻漿， 2500r/min，離心15min，取上清液備用。
[0038] 2. 4腦組織各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定
[0039] 腦組織中N0含量、N0S活力的測(cè)定按試劑盒說明進(jìn)行操作，蛋白質(zhì)含量采用考馬 斯亮藍(lán)法測(cè)定。
[0040] 2. 5腦梗死率的測(cè)定
[0041] 大鼠斷頭處死后取腦，腦去除嗅球、小腦和低位腦干，取左側(cè)大腦半球，沿冠狀面 切成5片，置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行TTC染色，染色過程中嚴(yán)格避光，37°C水浴箱 中孵育30min，然后移置含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定，白色部分為梗死組織，紅色部分 為正常組織。計(jì)算公式：腦梗死率（％ )=梗死組織重量/全腦重量X100%。
[0042] 2. 6神經(jīng)元形態(tài)的觀察
[0043] 大鼠斷頭處死后迅速取出大腦，去小腦及延腦。標(biāo)本固定于10%中性福爾馬林緩 沖液內(nèi)1周，取材之后再次固定12h，組織以乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機(jī) 切片，進(jìn)行蘇木素一伊紅（Haematoxylin-eosinStaining,HE)染色。
[0044] 具體步驟如下：
[0045] ①錯(cuò)切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，切片厚度5iim;
[0046] ②片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗：二甲苯（I)5min-二甲苯 (II) 5min一無水乙醇2min-95%的乙醇lmin-80%乙醇lmin-75%乙醇lmin-蒸館水 洗 2min;
[0047] ③木素染色浸泡15min，自來水沖洗兩遍；
[0048] ④酸乙醇分化30s;來水浸泡lOmin;
[0049] ⑤0? 5%伊紅染液浸泡2min，自來水沖洗；
[0050] ⑥規(guī)脫水，透明，封片：95%乙醇（I)lmin-95%乙醇（11)1111；[11 一無水乙醇（I) lmin一無水乙醉（Il)lmin-二甲苯（I)lmin-二甲苯（II)lmin-中性樹脂封閉。
[0051] 2. 7大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定
[0052] 全血粘度及血漿粘度的測(cè)定：大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，股動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉溶液 (3.8% )抗凝。從加有抗凝劑的6mL全血中取出2mL加入血流變儀，分別測(cè)定低切（10s)， 高（200s)2個(gè)切變率下全血粘度。再取4mL全血以2500r/min離心lOmin，取上層血漿2mL 測(cè)定血漿粘度。
[0053] 血小板聚集功能測(cè)定：采用北京賽科希德SC-2000血小板聚集儀，室溫下將已抗 凝的全血以l〇〇〇r/min離心8min，制備富血小板血漿（PRP)，放置2mLEp管中閉蓋保存， 置恒溫孔中備用，余下抗凝血3000r/min離心30min所得上清為貧血小板血楽（PPP)。取 200iiLPPP放入圓形杯中用以調(diào)零，取200iiLPRP加入盛有鐵心攪拌子的圓形杯中，PPP 調(diào)零后拔出PPP圓形杯，放入PRP圓形杯，在加入終濃度為3. 5iimol/LADP20iiL同時(shí)按下 測(cè)定鍵，獲得l、3min血小板聚集率（PAG)及最大血小板聚集率（MPAG)數(shù)值。
[0054] 2. 8大鼠離體胸動(dòng)脈環(huán)的制備及藥物處理
[0055] 大鼠股動(dòng)脈取血后，開胸，迅速取出胸主動(dòng)脈，浸泡于氧飽和K-H平衡液中，洗凈 殘血，剝除外膜脂肪及結(jié)締組織，處理好的血管剪成4?5mm的血管環(huán)，將血管環(huán)一端連接 張力換能器，另一端固定于浴槽中，用BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄主動(dòng)脈環(huán)張力。將安 裝好的血管環(huán)置于37°C恒溫浴槽中溫浴60min，持續(xù)通入95% 02和5%C02的混合氣體，主 動(dòng)脈環(huán)加靜息負(fù)荷1. 5?2g，每隔20min更換K-H液1次，反復(fù)沖洗，標(biāo)本60min后加入高 K+的K-H液，孵育15min，使血管達(dá)到收縮平衡。加入K-H液溫浴30min，每lOmin換一次 液，使張力恢復(fù)到基線水平。加入3yLl(T6m〇l/L的去甲腎上腺素，15min后待張力穩(wěn)定，換 液，重新加入K-H液，之后加入2yL的10_9mol/L的Ach，lOmin后待張力穩(wěn)定，將K-H液排 出。按照以上方法依次加入l(T8m〇l/L、l(T7mol/L、l(r6mol/L、l(r5mol/L的Ach，依次測(cè)定主 動(dòng)脈環(huán)張力變化。
[0056] 2. 9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0057] 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差G±s)表示，采用單因素方差分析法（one-wayAN0VA) 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P〈〇. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0058] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0059] 3. 1心腦欣膠囊對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷lh和24h神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響
[0060] 再灌注lh時(shí)，缺血再灌注神經(jīng)功能缺損癥狀最明顯，24h后有所恢復(fù)。再灌注lh 后，模型組、心腦欣膠囊組、喜得鎮(zhèn)組及假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分三組間無顯著性 差異。再灌注24h心腦欣膠囊組和喜得鎮(zhèn)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于模型組。見表1。 [0061] 表1心腦欣膠囊對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷lh和24h神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 (x ±5, n二6)
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 心腦欣膠囊在制備治療腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
2. 權(quán)利要求1所述的心腦欣膠囊，其特征在于，由以下重量份數(shù)組分組成：紅景天3? 6份，枸杞5?15份，沙棘3?9份。
【文檔編號(hào)】A61K36/815GK104257877SQ201410276400
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】史公權(quán), 鄒存生, 馬俊倉(cāng), 吳留強(qiáng), 夏彬, 牛蓉, 賀生玲, 李成秀 申請(qǐng)人:三普藥業(yè)有限公司