Trpc6在制備診療腎缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及TRPC6在制備診療腎缺血再灌注損傷藥物中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 缺血再灌注損傷（I/R)是指組織器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流供應(yīng)以后，組織器 官的損傷程度反而加重的現(xiàn)象。I/R普遍存在于臨床各科的工作實(shí)踐當(dāng)中，盡管曾經(jīng)有多種 I/R的損傷學(xué)說(shuō)被提出，例如：氧異常、鈣異常、PH異常等等。但是，I/R完整的發(fā)病機(jī)制迄今 為止尚未能得到完全的闡明。腎臟由于其獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，是極易受缺血缺氧 刺激的影響的祀器官，從而常常因?yàn)镮/R而發(fā)生急性腎損傷（Acutekidneyinjury，AKI)。 AKI的典型病理改變是急性腎小管壞死，所以目前認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞的損傷在腎臟I/R 的過(guò)程中居于關(guān)鍵地位。由于I/R發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未能夠完全闡明，導(dǎo)致目前臨床上尚 無(wú)有效的防治I/R的手段。所以，探討腎臟I/R的機(jī)制已成為臨床相關(guān)領(lǐng)域中的重大課題， 而努力尋找到一種能夠有效防治腎臟I/R的有效措施，將會(huì)產(chǎn)生重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 傳統(tǒng)型瞬時(shí)性受體電位通道6(transientreceptorpotentialcationchannel， TRPC6)是屬于傳統(tǒng)型瞬時(shí)性受體電位通道（TRPC)家族的成員之一，是位于細(xì)胞膜上的非 選擇性的陽(yáng)離子通道。TRPC6在人腎小管上皮細(xì)胞上表達(dá)，我們?cè)谇捌诘念A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) TRPC6在腎臟I/R模型中表達(dá)也是增加的，并能夠上調(diào)和sirtuin-2具有相同底物NAD+ 的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(?〇17(40?-1'；113086)。〇15〇116抑86-1，？41^-1)的水平。凋亡 (apoptosis)是一種細(xì)胞自我調(diào)控的主動(dòng)病理生理過(guò)程；而壞死（necrosis)則被認(rèn)為是相 對(duì)不可逆的細(xì)胞死亡過(guò)程，難以通過(guò)藥理學(xué)途徑的干預(yù)得到阻止或者說(shuō)逆轉(zhuǎn)。然而，目前的 研究發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞壞死的大背景中，至少有相當(dāng)部分的細(xì)胞壞死可以像凋亡那樣，由特定的 刺激信號(hào)啟動(dòng)，并且按照一定的信號(hào)傳導(dǎo)通路和執(zhí)行程序發(fā)生，具有精密的調(diào)控機(jī)制，并被 命名為"necroptosis"（程序性壞死，又被譯做壞死性凋亡）。所以，根據(jù)目前的研究進(jìn)展和 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本研究中，我們從離子通道蛋白與腎臟I/R損傷的關(guān)系入手，擬探索TRPC6 在腎臟I/R中調(diào)控necroptosis的作用及其機(jī)制，以便為腎臟I/R的防治提供新的思路和 新的治療靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供TRPC6基因和/或TRPC6蛋白在制備診療腎缺血再灌注損 傷藥物中的應(yīng)用。
[0005] 進(jìn)一步，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通過(guò)抑制程序性壞死（necroptosis) 和/或修復(fù)細(xì)胞DNA損傷診療腎缺血再灌注損傷。優(yōu)選的，TRPC6基因和/或TRPC6蛋白 高表達(dá)從而抑制程序性壞死（necroptosis)和/或修復(fù)細(xì)胞DNA損傷診療腎缺血再灌注損 傷。
[0006] 程序性壞死（necroptosis)是指在細(xì)胞壞死的大背景中，至少有相當(dāng)部分的細(xì)胞 壞死可以像凋亡那樣，由特定的刺激信號(hào)啟動(dòng)，并且按照一定的信號(hào)傳導(dǎo)通路和執(zhí)行程序 發(fā)生，具有精密的調(diào)控機(jī)制，并被命名為"necroptosis"（程序性壞死）。
[0007] 進(jìn)一步，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通過(guò)調(diào)控PARP-1基因和/或PARP-1 蛋白的表達(dá)診療腎缺血再灌注損傷。
[0008]TRPC6引起的PARP-1表達(dá)適量上調(diào)，一方面起到的了DNA修復(fù)和細(xì)胞生存的調(diào)控 功能，另一方面，PARP-1又是necroptosis關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶sirtuin-2的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物，二者的 功能均依賴(lài)于輔因子NAD+的水平，在再灌注后，氧供恢復(fù)，NAD+的水平回升，但此時(shí)PARP-1 和sirtuin-2的水平都是升高的。PARP-1要發(fā)揮DNA修復(fù)作用需要NAD+參與，會(huì)直接影響 sirtuin-2的活性，導(dǎo)致necroptosis通路激活受到影響，減少細(xì)胞壞死。
[0009] 進(jìn)一步，TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通過(guò)作用信號(hào)通路TRPC6-Ca離子 -CaMKII-PARP-1診療腎缺血再灌注損傷。
[0010] 在腎缺血再灌注損傷模型中，TRPC6激動(dòng)劑可以上調(diào)PARP-1表達(dá)，TRPC6拮抗劑可 以下調(diào)PARP-1的表達(dá)；同時(shí)，CaMKII的抑制劑KN-93也可以抑制PARP-1的表達(dá)證實(shí)了信 號(hào)通路TRPC6-Ca離子一CaMKII-PARP-1存在于腎缺血再灌注損傷模型中。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供調(diào)節(jié)劑在制備診療腎缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，其特 征在于，所述調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)控下列任意一種或幾種組分的表達(dá)：TRPC6、CaMKII、PARP-1、程 序性壞死調(diào)節(jié)酶；和/或調(diào)控程序性壞死調(diào)節(jié)酶的活性。優(yōu)選的，所述的調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)信號(hào)通 路TRPC6-Ca離子一CaMKII-PARP-1的表達(dá)。
[0012] 進(jìn)一步，所述調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)控下列任意一種或幾種組分的高表達(dá)：TRPC6、CaMKII、 PARP-1 ;和/或調(diào)控程序性壞死調(diào)節(jié)酶低表達(dá)或活性降低。進(jìn)一步，所述調(diào)節(jié)劑包括TRPC6 激動(dòng)劑，優(yōu)選〇AG;TRPC6拮抗劑，優(yōu)選SKF96365或TRPC6的干擾RNA，更優(yōu)選的，所述TRPC6 的干擾RNA的靶基因?yàn)镾EQIDNO. 1和/或SEQIDN0. 4和/或SEQIDN0. 7,進(jìn)一步優(yōu) 選的，所述TRPC6的干擾RNA序列選自下列序列中任意一個(gè)或幾個(gè)：SEQIDNO. 2、SEQID NO. 3、SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9;Ca離子調(diào)節(jié)劑；CaMKII激動(dòng) 劑；CaMKII抑制劑，優(yōu)選KN93 ;PARP-1激動(dòng)劑；PARP-1抑制劑。
[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種診療腎缺血再灌注損傷藥物制劑，所述藥物制劑包括 調(diào)節(jié)下列任意一種或幾種組分表達(dá)的調(diào)節(jié)劑：了1?^6、0 &離子、0&1?11、？41^-1;和/或下列 任意一種或幾種組分：TRPC6、Ca離子、CaMKII、PARP-1 ;和/或調(diào)控程序性壞死的調(diào)節(jié)劑。
[0014] 進(jìn)一步，所述調(diào)控程序性壞死的調(diào)節(jié)劑為necrostatin-l;所述調(diào)節(jié)劑包括TRPC6 激動(dòng)劑，優(yōu)選〇AG;TRPC6拮抗劑，優(yōu)選SKF96365或TRPC6的干擾RNA;Ca離子調(diào)節(jié)劑； CaMKII激動(dòng)劑；CaMKII抑制劑，優(yōu)選KN93 ;PARP-1激動(dòng)劑；PARP-1抑制劑。
[0015] 進(jìn)一步，所述調(diào)控程序性壞死的調(diào)節(jié)劑能夠影響了RIP1-RIP3復(fù)合物的結(jié)合及信 號(hào)傳遞。TRPC6激動(dòng)劑可以下調(diào)RIP1表達(dá)，TRPC6拮抗劑可以上調(diào)RIP1的表達(dá)，是由于 PARP-1競(jìng)爭(zhēng)性抑制了sirtuin-2與NAD+的結(jié)合，導(dǎo)致sirtuin-2的酶活性不足，影響了 RIP1-RIP3復(fù)合物的信號(hào)傳遞，從而抑制了necroptosis的發(fā)生。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1westernblot檢測(cè)TRPC6在HK-2細(xì)胞上的表達(dá)
[0017] 從左邊起分別為：泳道1是轉(zhuǎn)染組；泳道2是對(duì)照組（NControlSiRNA);泳道3是 轉(zhuǎn)染si-h-TRPC6-001 組；泳道 4 是轉(zhuǎn)染si-h-TRPC6-002 組；泳道 5 是si-h-TRPC6-003 組；
[0018] 圖2westernblot檢測(cè)TRPC6在HK-2細(xì)胞上的表達(dá)
[0019] 圖3各組細(xì)胞壞死率比較
[0020] 正常與NControl組之間無(wú)明顯差異；*與正常、NControl組比較，RNAI各組細(xì)胞 壞死率均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 05)
[0021] 圖4各組細(xì)胞凋亡率比較
[0022] *正常/NControl/RNAI各組均隨時(shí)間增加，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P〈0. 05);正常/NControl/RNAI各組比較凋亡率無(wú)明顯差異
[0023] 圖5復(fù)氧2h與復(fù)氧2h組+necrostatin_l比較，necrostatin-1干預(yù)后細(xì)胞壞死 率下降（*，P〈〇. 05);復(fù)氧6h與復(fù)氧6h組+necrostatin_l比較，necrostatin-1干預(yù)后細(xì) 胞壞死率下降（*，P〈〇. 05)
[0024] 圖6各組細(xì)胞壞死率比較：各組細(xì)胞使用0AG后，壞死率降低；使用SKF96365、 KN93后壞死率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*，P〈0. 05);組間比較：*與正常組比較，NControl 組各分組壞死率變化無(wú)明顯差異（P>〇. 05);與正常組、NControl組比較，RNAI各組細(xì)胞壞 死率均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*，P〈〇. 05)
[0025] 圖 7westernblot檢測(cè)PARP-1、sirtuin-2、RIP1、AIF在HK-2 細(xì)胞上的表達(dá)
[0026] 圖8westernblot檢測(cè)干預(yù)后PARP-1、RIP1在HK-2細(xì)胞上的表達(dá)
[0027] 圖 9westernblot檢測(cè)I/R腎組織TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2 表達(dá)
[0028] 圖 10WB檢測(cè) 0AG、SKF96365、KN-93 干預(yù)I/R腎組織PARP-1、RIP1 表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0030] 實(shí)施例1基于基因芯片的腎臟缺血再灌注損傷分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析研究
[0031] 1.1研究材料
[0032] 1. 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0033] 6周齡，體重在180_230g之間的SD、BN大鼠，均喂養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物喂養(yǎng)室。所有的大鼠均由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0034] 動(dòng)物室保持清潔，室內(nèi)溫度由空調(diào)控制在23 °C到28 °C之間，室內(nèi)濕度控制在40 % 到70%之間，并維持室內(nèi)12h晝夜循環(huán)。動(dòng)物可以自由地?cái)z取食物和飲水，每天觀察動(dòng)物情 況并監(jiān)測(cè)其體重。
[0035] 1. 2研究方法
[0036] 1. 2. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
[0037] 我們?cè)贜CBIGE0數(shù)據(jù)庫(kù)選擇GSE9943,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共有12個(gè)樣本，樣本分組情況如 表1所示。兩種大鼠（BN和SD)，每種大鼠都分成腎臟I/R實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照（Control)組， 每個(gè)組都有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。GSE9943的注釋平臺(tái)為GPL2996ABIRatGenomeSurvey Microarray，該平臺(tái)由26857個(gè)探針組成。
[0038] 表1實(shí)驗(yàn)組的樣本分布情況
[0039]
[0040] 注：表格中數(shù)字代表樣本生物學(xué)重復(fù)數(shù)（biologicalreplicates)
[0041] 1. 2. 2建立大鼠缺血/再灌注損傷模型
[0042] 實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前常規(guī)稱(chēng)重，采用戊巴比妥鈉溶液（3%，50mg/Kg)腹腔注射進(jìn)行手術(shù) 麻醉，根據(jù)大