加入樣品孔中，電泳。
[0208] 4.電轉膜：浸泡膜，取膠，鋪好膠、膜與濾紙，放入電轉槽，加入電轉液，冰水混合 物中轉膜。
[0209] 5.封閉及雜交：取出膜，用封閉液緩慢搖洗，加相應的一抗室溫孵育，封閉液搖洗 后加入二抗室溫輕搖lh，膜用封閉液浸洗。
[0210] 6.發(fā)光、顯影、定影：暗室中將A和B等體積混合后加在膜上反應，去除殘液后用 保鮮膜包好，放X-光片夾中，曝光顯影、定影。
[0211] 7.凝膠圖像分析：以P-actin作為內對照，利用凝膠成像分析系統測定各蛋白條 帶的灰度值。蛋白的相對表達量取目標蛋白與P-actin的灰度值的比值作為相對表達量。
[0212] 3. 3 結果
[0213] 3. 3. 1大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型的血肌酐變化情況
[0214] 對照組與假手術組血肌酐無明顯變化；而與對照組以及假手術組比較，腎臟缺血 再灌注后大鼠血肌酐（SCr)水平顯著升高，具有統計學差異（P<0. 05)，并且在24h達峰值 (P< 〇. 05)，再灌注后5d腎功能開始恢復，血肌酐明顯下降，說明建模成功。
[0215] 表2大鼠腎臟缺血再灌注模型血肌酐水平比較（n=8,g±沒）
[0216]
[0217]a:P< 0. 05,與對照組及假手術組比較；
[0218]b:P< 0. 05,與I/R24h組比較；
[0219]c:P< 0? 05,與I/R48h組比較
[0220] 3. 3. 2大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型的腎臟病理學改變
[0221] HE染色鏡下觀察：對照組及假手術組的腎組織結構正常，腎小管上皮細胞排列清 晰，無脫落。I/R組再灌注后24h可見腎小管上皮細胞明顯腫脹，脫落、崩解，基底膜裸露、斷 裂，腎間質可見炎細胞浸潤；48h后開始出現新生腎小管細胞；5d時，腎小管新生細胞增多 明顯，僅有少部分腎小管基底膜仍裸露。對腎小管損傷情況進行半定量評分顯示：與對照組 與假手術組大鼠腎小管損傷評分（0分）相比，I/R24h組腎小管損傷評分最高為，其余各 組評分均較假手術組明顯升高，且各組間差異明顯，具有統計學意義（P< 0. 05)，見表3。
[0222] 表3大鼠腎臟缺血再灌注模型腎小管損傷評分比較（n= 8,S±s )
[0223]
[0224]a：P<0. 05,與對照組及假手術組比較;
[0225]b:P< 0. 05,與I/R24h組比較；
[0226]c:P< 0. 05,與I/R48h組比較
[0227] 3. 3. 3腎臟組織免疫組化檢測TRPC6、RIPl、PARP-l、sirtuin-2的表達定位以及表 達強度
[0228] 免疫組化染色觀察腎臟組織TRPC6表達：鏡下觀察可見對照組、假手術組TRPC6主 要在腎小管上皮細胞表達，腎小球也有表達；再灌注后24、48h腎小管上皮細胞TRPC6的表 達明顯增多；第5天TRPC6的表達開始減少，但仍較對照組及假手術組高。PARP-1、RIP1、 sirtuin-2的蛋白表達與TRPC6有類似的變化趨勢。
[0229] 3. 3.Westernblot檢測腎臟組織TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2 蛋白表達
[0230] 采用Westernblot檢測大鼠腎組織TRPC6表達，結果見圖9:與對照組以及假手 術組比較，再灌注后24、48h腎臟組織TRPC6蛋白表達均明顯升高，24h時為峰值，5d時表達 有所下降，但仍較對照高。RIP1、PARP-1、sirtuin-2的蛋白表達TRPC6的表達有類似的趨 勢，其差別有統計學意義（P<〇. 05)。
[0231] 3. 3. 50AG、SKF96365、necrostatin-1干預后缺血再灌注大鼠腎臟損傷情況
[0232] 建立缺血再灌注大鼠模型，使用相應藥物干預后檢測，分組為：（1)I/R24h組； (2)Nec-124h組；（3)0AG24h組；（4)SKF9636524h組。（各組 5 個重復）結果顯示：necrostatin-1干預后，necrostatin-1組血肌酐明顯下降（P〈0. 05) ;0AG干預后的大鼠血 肌酐也明顯下降，與缺血再灌注相比有統計學意義；而使用SKF96365干預的大鼠，血肌酐 與缺血再灌注組相比明顯升高（P〈〇. 05)，表4。HE染色行急性腎小管壞死半定量評分結果 也有相似的的結論（表5)。
[0233] 表4OAG、SKF96365、necrostatin-1干預大鼠腎I/R模型血肌酐水平比較（n= 10,A土S)
[0234]
[0235]a:P< 0. 05,與I/R24h組比較；b:P< 0. 05,與nec_124h組比較；c:P< 0. 05,與 0AG24h組比較
[0236] 表5 0AG、SKF96365、necrostatin_l干預大鼠腎I/R模型腎小管壞死評分比較（n =10, 1±芩）
[0237]

[0238]a:P<0. 05,與I/R24h組比較；b:P<0. 05,與nec_124h組比較；c:P<0. 05,與 0AG24h組比較
[0239] 3. 3. 60AG、SKF96365、KN-93干預后缺血再灌注大鼠組織PARP-URIP1表達變化情 況
[0240] 使用0AG干預后，缺血再灌注大鼠組織PARP-1表達升高；相反，使用SKF96365、 KN-93干預后，缺血再灌注大鼠組織PARP-1表達下降。以上結果提示在缺血再灌注損傷過 程中，TRPC6通道的激活，上調了PARP-1的表達。同時，我們發(fā)現，腎臟組織CaMKII的表達 與PARP-1的表達有密切的相關性。從文獻中知道，PARP-1的活性依賴于CaMKII的調控。 所以我們推測，在缺血再灌注損傷時PARP-1的表達上調的信號是通過TRPC6-Ca2+-CaMKII 傳遞的。
[0241] 使用0AG干預后，缺血再灌注大鼠組織RIP1表達下降；相反，使用SKF96365、 KN-93干預后，缺血再灌注大鼠組織RIP1表達升高。以上結果（見圖10)提示0AG激活 TRPC6對缺血再灌注大鼠的保護作用是通過調控了RIP1的表達，抑制了細胞程序性壞死來 達到。
[0242] 我們得出結論：TRPC6的保護作用應該是通過減少細胞壞死而不是減少細胞凋亡 來實現的。為證實這一點，我們檢測了分別用0AG和SKF96365干預后腎臟組織表達RIP1 的影響，發(fā)現0AG干預可以減少RIP1的表達，而SKF96365干預則上調了RIP1的表達，這就 進一步說明了TRPC6的保護作用是通過調控necroptosis來達到的。
[0243] 在動物模型中，激活TRPC6可以上調PARP-1表達，阻斷TRPC6,下調PARP-1的表 達；同時，CaMKII的抑制劑KN-93也可以抑制PARP-1的表達，這和體外實驗的結果一致，進 一步證實了TRPC6 -Ca離子一CaMKII-PARP-1這一條信號傳導通路的存在。一方面， PARP-1激活可以修復細胞的DNA損傷，另一方面，PARP-1又是necroptosis關鍵調節(jié)酶 sirtuin-2的競爭性抑制物。由于二者的功能均依賴于輔因子NAD+的水平，在再灌注后， 氧供恢復，NAD+的水平回升，但此時PARP-1和sirtuin-2的水平都是升高的。PARP-1要發(fā) 揮DNA修復作用需要NAD+參與，必要會直接影響sirtuin-2的活性，導致necroptosis通 路激活受到影響，減少細胞壞死。同時，在NAD+參與下，適度的激活的PARP-1可以發(fā)揮其 DNA修復作用促進細胞存活。這樣的作用就能抑制了更大量細胞的DNA損傷對PARP-1的過 度激活的惡性循環(huán)，減少了AIF激活并避免parthanatos的發(fā)生；同時necroptosis受到抑 制，其伴隨的強烈炎癥反應帶來的瀑布效應也得到抑制。綜上所述，我們在缺血再灌注損傷 大鼠模型中進一步驗證了TRPC6改善腎臟缺血再灌注損傷作用的機制是通過調節(jié)PARP-1/ NAD+，抑制necroptosis，修復細胞DNA損傷獲得的。這一結果將為腎臟缺血再灌注損傷的 防治提供了新的思路和靶點。
【主權項】
1. 一種診療腎缺血再灌注損傷藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包括調節(jié)下列任 意一種或幾種組分表達的調節(jié)劑：TRPC6、CaMKII、PARP-I;和/或下列任意一種或幾種組 分：TRPC6、CaMKII、PARP-I;和/或調控程序性壞死的調節(jié)劑。2. 根據權利要求1所述的藥物制劑，其特征在于，所述調控程序性壞死的調節(jié)劑為 necrostatin-1 ;所述調節(jié)劑包括TRPC6激動劑，優(yōu)選OAG;TRPC6拮抗劑，優(yōu)選SKF96365或 TRPC6的干擾RNA;CaMKII激動劑；CaMKII抑制劑，優(yōu)選KN93 ;PARP-1激動劑；PARP-I抑制 劑。3. 根據權利要求1所述的藥物制劑，其特征在于，所述調控程序性壞死的調節(jié)劑能夠 影響了RIP1-RIP3復合物的結合及信號傳遞。 4. TRPC6基因和/或TRPC6蛋白在制備診療腎缺血再灌注損傷藥物中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通過抑 制程序性壞死和/或修復細胞DNA損傷診療腎缺血再灌注損傷。6. 根據權利要求4或5所的應用，其特征在于，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通過 調控PARP-I基因和/或PARP-I蛋白的表達診療腎缺血再灌注損傷。7. 根據權利要求4-6任意一項所述的應用，其特征在于，TRPC6基因和/或TRPC6蛋白 通過作用信號通路TRPC6 - Ca離子一CaMKII - PARP-I診療腎缺血再灌注損傷。8. 調節(jié)劑在制備診療腎缺血再灌注損傷藥物中的應用，其特征在于，所述調節(jié)劑能夠 調控下列任意一種或幾種組分的表達：TRPC6、CaMKII、PARP-1、程序性壞死調節(jié)酶；和/或 調控程序性壞死調節(jié)酶的活性。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述調節(jié)劑能夠調控下列任意一種或幾 種組分的高表達：TRPC6、CaMKII、PARP-I;和/或調控程序性壞死調節(jié)酶低表達或活性降 低。10. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述調節(jié)劑包括TRPC6激動劑，優(yōu)選 OAG;TRPC6拮抗劑，優(yōu)選SKF96365或TRPC6的干擾RNA;CaMKII激動劑；CaMKII抑制劑，優(yōu) 選KN93 ;PARP-1激動劑；PARP-I抑制劑。
【專利摘要】本發(fā)明及TRPC6在制備診療腎缺血再灌注損傷藥物中的應用。發(fā)明人從離子通道蛋白與腎臟I/R損傷的關系入手，探索TRPC6在腎臟I/R中調控程序性壞死的作用及其機制，揭示了信號通路TRPC6→Ca離子→CaMKII→PARP-1在腎缺血再灌注損傷中的作用，為腎臟I/R的防治提供新的思路和新的治療靶點，具有重要的實際應用價值。
【IPC分類】A61K38/10, A61P13/12, A61P9/10
【公開號】CN105169367
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】申兵冰, 吳雄飛, 何躍
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月16日