專利名稱：一種抗缺血與再灌注損傷藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以β-1，3-葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物及其在心血管保護領(lǐng)域的用途。
對于血液循環(huán)系統(tǒng)來說，缺血(缺氧)及其再灌注都可造成缺血區(qū)組織和器官的損傷甚至壞死。缺血通常是導(dǎo)致組織缺氧的直接原因。對于心肌、大腦等耗氧量大、對氧需求敏感的組織器官來說，缺血持續(xù)時間的長短通常是決定其是否可以挽救和治療的決定性因素。以急性心肌梗塞(AMI)為例，心肌損傷最初主要為缺血性損傷，隨著缺血時間的延長，再灌注后通常會表現(xiàn)出更嚴重的心肌損傷。一般認為，心肌缺血15分鐘以內(nèi)的再灌注損傷通常是較輕的，一般無不可逆性壞死現(xiàn)象；缺血30分鐘以上的再灌注損傷通常趨于嚴重，心肌組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性損傷；缺血4-6小時以上的再灌注心肌已基本無法挽救。由于AMI患者從發(fā)病開始到被送往醫(yī)院診治耗時通常已超過30分鐘，再加上藥物溶栓尚需一段時間，造成嚴重的再灌注損傷通常難以避免。因此臨床治療AMI的最重要步驟就是及早進行再灌注療法，其次還需要增加必要的抗再灌注損傷措施。因為在缺乏有效保護措施的情況下，再灌注后通常又會造成更嚴重的心肌損傷，是造成AMI患者死亡率高、預(yù)后差的重要原因。
所謂“再灌注損傷”，即“缺血-再灌注損傷”(Ischemia-Reperfusion Injury)，是指遭受一段時間缺血(循環(huán)障礙)的組織(或器官)在恢復(fù)血液灌注(循環(huán))后往往發(fā)生更嚴重的、甚至不可逆的細胞損傷和壞死。該現(xiàn)象七十年代末期才被發(fā)現(xiàn)。以AMI溶栓治療為例，再灌注損傷可以導(dǎo)致如下四種后果1、再灌注性心肌死亡，屬于不可逆損傷；2、血管再灌注損傷，主要指再灌注期的無再流現(xiàn)象，與微血管內(nèi)皮的腫脹、白細胞堵塞等有關(guān)；3、心肌頓抑(stunned myocardium)，指存活心肌的機械功能低下，屬于可逆性損傷；4、再灌注心率失常，這種損傷的范圍和程度與浸潤白細胞的數(shù)量和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，屬于可逆性損傷，但有潛在致命性。
隨著心血管外科的蓬勃發(fā)展，近年來體外循環(huán)技術(shù)目新月異，心臟手術(shù)成功率逐年上升，許多復(fù)雜的先天性心臟病、急診、高齡、重危患者的心臟血管手術(shù)也已日趨成熟，微創(chuàng)外科已經(jīng)應(yīng)用于心臟手術(shù)，但是絕大多數(shù)心血管手術(shù)仍然需要心臟停搏，使得術(shù)中心肌缺血與再灌注損傷難以避免。應(yīng)當說明的是，雖然缺血前預(yù)適應(yīng)技術(shù)在一定程度上可以減輕再灌注損傷，但由于許多情況下缺血已經(jīng)發(fā)生，如AMI、腦卒中等急性事件，缺血前預(yù)適應(yīng)技術(shù)難以應(yīng)用，使患者面臨嚴重后遺癥甚至生命的危險，況且缺血預(yù)適應(yīng)技術(shù)抗再灌注損傷的效果也很有限，而且還存在倫理道德方面的潛在問題。因此研發(fā)抗缺血與再灌注損傷藥物是非常必要的。由于所謂″缺血″可以是更廣義性概念，如血液低灌流(如休克等)狀態(tài)也能產(chǎn)生該現(xiàn)象，因此再灌注損傷可以涉及心、腦、肝、腎、肺、消化道等許多組織和器官，因此其影響具有廣泛性，后果也是非常嚴重的，可以導(dǎo)致相關(guān)組織和器官的損傷、壞死以及功能衰竭，有較高的死亡率和后遺癥，目前尚無良好的防治方法。
對于急性缺血性疾病的治療來說，再灌注損傷是臨床經(jīng)常遇到的醫(yī)療難題。目前抗再灌注損傷的防治藥物尚處于空白狀態(tài)，有些藥物(如鈣離子拮抗劑維拉帕米)雖有一定抗再灌注損傷作用，但療效有限?？谷毖該p傷藥物目前雖然已有不少，但療效也有待提高。因此，開發(fā)抗再灌注損傷用途的心血管保護藥物無疑具有重要的臨床應(yīng)用價值，如果該藥物還兼有抗缺血性損傷作用，無疑具有更大的醫(yī)藥開發(fā)價值。因為既能抗缺血性損傷又能抗再灌注損傷的藥物，無疑對心血管系統(tǒng)具有更全面的保護作用。
β-1，3-葡聚糖(β-1，3-glucan)是一類重要的免疫活性分子，其天然提取物的分子量通常為幾萬至幾百萬道爾頓(Dalton)，已往的研究和應(yīng)用主要集中于一些大分子β-1，3-葡聚糖，較有代表性的如香菇多糖(Lentinan)，平均分子量為約400-800KD(Kilo Dalton)，有較強的抗腫瘤、抗病毒和增強免疫機能等作用，此類分子的藥用研究大多集中于此方面；而有關(guān)β-1，3-葡聚糖較小分子的研究和應(yīng)用則很少，用于其它醫(yī)藥用途的研究就更少?？傊景l(fā)明所述β-1，3-葡聚糖在抗缺血與再灌注損傷的醫(yī)藥用途方面尚無研究報道。
本發(fā)明旨在推出一種以β-1，3-葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物并將其用于相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。
藥理研究表明，β-1，3-葡聚糖不但具有顯著的抗缺血性損傷作用，還具有顯著的抗再灌注損傷作用。以分子量分布為10-100KD的β-1，3-葡聚糖為例，20-150mg/kg靜脈給藥能顯著增強小鼠的常壓耐缺氧能力，其中大劑量效果非常顯著；45mg/kg靜脈給藥能顯著降低冠脈結(jié)扎犬心肌缺血引起的心電圖ST段抬高程度，對犬急性心肌梗死再灌注后出現(xiàn)的心率失常有非常顯著的預(yù)防作用，可顯著降低犬急性心肌梗死再灌注后的死亡率，對防止缺血區(qū)再灌注心肌壞死也有較好作用。不僅如此，該β-1，3-葡聚糖還是一種優(yōu)良的炎性(滲出)抑制劑，能顯著抑制急性炎癥反應(yīng)，對于降低心、腦血管急性損傷后導(dǎo)致的炎性損傷和腫脹反應(yīng)也具有重要意義。該作用注射與口服給藥均有效。
本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖具有良好的安全性，尤其是其中優(yōu)選的中小分子量組分。以分子量分布為10-100KD的β-1，3-葡聚糖組分為例，小鼠靜脈給藥或腹腔給藥的LD50均不低于1500mg/Kg，口服給藥測不出LD50，組織相容性良好，無刺激、過敏等不良反應(yīng)，也無致畸、致突變等毒性。
本發(fā)明推出的抗缺血與再灌注損傷藥物具有如下主要特征1.以β-1，3-葡聚糖為有效成分；2.β-1，3-葡聚糖不但具有顯著的抗缺血性損傷作用，還具有顯著的抗再灌注損傷作用；3.β-1，3-葡聚糖的分子量選擇范圍為0.5-3000KD(KiloDalton)，較好的選擇范圍為1-500KD，更優(yōu)的選擇范圍為2-100KD。
本發(fā)明所述以β-1，3-葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物，其臨床用途包括用于急性心肌梗塞、腦卒中、休克、冠心病及其介入治療、心血管手術(shù)、腸缺血、組織與器官移植等疾病的急救和治療，這些疾病均以血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)生或?qū)⒁l(fā)生缺血和(或)再灌注損傷為特征。其中所述的用法包括給該病患者使用一段時期有效量的β-1，3-葡聚糖直到不再需要使用為止。
關(guān)于以β-1，3-葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物的臨床應(yīng)用，一般原則是發(fā)病后盡早使用，只有這樣才能起到更好的抗缺血和再灌注損傷作用。以急性心肌梗塞的臨床急救來說，盡早給患者滴注本發(fā)明所述藥物，不但可以抗缺血性損傷，為溶栓等再灌注療法創(chuàng)造出更多的心肌耐受時間，還可為隨后可能發(fā)生的再灌注損傷發(fā)揮更好的防治作用。對于腦卒中患者來說，盡早給藥對于增強大腦的耐缺氧能力也具有重要意義?？傊瑹o論對于抗缺血性損傷來說，還是對于抗再灌注損傷來說，都應(yīng)當盡早使用該藥物，至少應(yīng)當與再灌注治療措施同時進行，若能在再灌注前先行則更好。若在再灌注以后進行則通常已經(jīng)晚了，難以取得良好效果。對于手術(shù)、器官移植等過程可以控制的缺血與再灌注來說，也應(yīng)盡可能預(yù)防性用藥。另外，本發(fā)明所述抗缺血與再灌注損傷藥物也可用于取代臨床缺血預(yù)適應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及的β-1，3-葡聚糖的來源非常豐富。β-1，3-葡聚糖在自然界的存在和分布相當廣泛，通常是作為植物和微生物的細胞壁結(jié)構(gòu)成分大量存在，其中最主要的來源通常還是真菌的子實體、菌絲體或其培養(yǎng)液。β-1，3-葡聚糖是一個大家族，不同來源和制備工藝得到的分子在枝鏈的連接(鍵型)、枝鏈的豐度、以及分子量等方面可能有所差別。根據(jù)枝鏈連接方式的不同，β-1，3-葡聚糖主要有如下類型(1)不含枝鏈的線性β-1，3-葡聚糖，如凝膠多糖(Curdlan)，加熱冷卻后可形成凝膠，提取自產(chǎn)堿桿菌屬(Alealigenes)和土壤桿菌屬(Agrobacterium)微生物；(2)富含β-1，6-葡萄糖枝鏈的β-1，3-葡聚糖，如在香菇(Lentinus edodes)的子實體或菌絲體中提取的香菇多糖(Lentinan)，在裂裥菌(Schizophyllan Commune)的培養(yǎng)液中提取的裂裥菌多糖(Schizophyllan)，在茯苓(Pachyma CocosFr.)中提取的茯苓多糖(Pachyman)，在豬苓(Grifolafrondosa)中提取的豬苓多糖(Grifolan)，在昆布(Laminariajaponica)中提取的昆布多糖(Laminaran)，以及在Sclerotiniasclerotiorum(IFO 9395)中提取的SSG[Chem.Pharm.Bull，1986b，341362]等均屬此類；(3)富含β-1，4-葡萄糖枝鏈的β-1，3-葡聚糖，如從地衣(Lichen)和異地衣(Isolichen)中提取的地衣多糖(Lichenan)和異地衣多糖(Isolichenan)等。這些多糖的制備和分析方法是已知的，可參見有關(guān)的技術(shù)文獻。
本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖，其特征在于分子的主鏈結(jié)構(gòu)由β-1，3-葡萄糖苷鍵連接構(gòu)成。因此，本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖的特征在于允許在β-1，3-葡聚糖主鏈上含有較少量的包括β-1，6-或β-1，4-葡萄糖結(jié)構(gòu)在內(nèi)的枝鏈存在。即本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖，是指以β-1，3-葡萄糖苷鍵為分子主鏈結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖的概括性統(tǒng)稱，β-1，3-葡聚糖是分子的特征性結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖作為分子的主鏈結(jié)構(gòu)，是分子活性和性質(zhì)的主要決定因素，枝鏈狀況或修飾基團對分子主鏈活性的影響一般是有限的。本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖的特征在于包括經(jīng)過化學修飾的β-1，3-葡聚糖衍生物及其生理上能夠接受的鹽類。
分子量大小是決定β-1，3-葡聚糖結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的重要因素[Chem.Pharm.Bull.1990，38(2)477]。一般而言，β-1，3-葡聚糖的分子量越大水溶性越差、粘度越大，免疫刺激作用也越強，但人體的耐受性也越低，副作用也越多，如大分子β-1，3-葡聚糖靜脈給藥容易導(dǎo)致微血管栓塞等。相比之下，較小分子量的β-1，3-葡聚糖水溶性較好，人體的耐受性也更好，性質(zhì)更溫和，副作用也更少，更適合用于靜脈給藥和用于抗缺血與再灌注損傷。因此，可溶性的、較小分子量的β-1，3-葡聚糖通常是本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖的較好選擇。
本發(fā)明雖然并不想限局對所述β-1，3-葡聚糖抗缺血與再灌注損傷藥理作用機理的探討。但本發(fā)明人認為有必要指出，β-1，3-葡聚糖的抗缺血與再灌注損傷作用可能與其對巨噬細胞(MΦ)和中性粒細胞(Neutrophil)等的如下調(diào)節(jié)作用有關(guān)。因為有研究表明，包括巨噬細胞、中性粒細胞等在內(nèi)的單核吞噬細胞含有β-1，3-葡聚糖受體(CR3，CD11b/CD18)。一方面，MΦ廣泛分布于包括血管內(nèi)皮細胞在內(nèi)的幾乎所有組織中，對心血管組織的細胞保護、修復(fù)和再生具有重要的調(diào)節(jié)和指導(dǎo)作用。本發(fā)明所述β-1，3-匍聚糖，尤其是更優(yōu)選擇的組分，對MΦ具有良好的非炎性活化作用，靜脈給藥后可通過與MΦ的識別反應(yīng)作用于血管內(nèi)皮細胞等組織，增強心血管系統(tǒng)的自我保護、抗損傷和修復(fù)、再生機能。另一方面，β-1，3-葡聚糖與中性粒細胞表面CR3的結(jié)合，還可能阻斷或抑制中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞表達的細胞間粘附因子-1(ICAM-1，CD54)的結(jié)合，抑制中性粒細胞的粘附和滲出，從而降低炎性反應(yīng)和炎性損傷，對降低缺血與再灌注損傷可能有重要作用。
已知MΦ最小可識別聚合度(DP)為3～7的β-1，3-葡聚糖(DP＝3～7)。即β-1，3-葡聚糖對MΦ等免疫細胞的調(diào)節(jié)作用對分子量的最小要求可降至約0.5～1.1KD[J.Immunol1989，142959；Dev.Comp.Immunol，1994，18(5)397]。因此，本發(fā)明涉及的β-1，3-葡聚糖對分子量范圍的限定最小約為0.5KD。
本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖的分子量選擇范圍為0.5-3000KD(Kilo Dalton)，較好的選擇范圍為1-500KD，更優(yōu)的選擇范圍為2-100KD。
天然提取的β-1，3-葡聚糖的分子量通常都在幾十萬到幾百萬道爾頓之間，如要使用分子量較小的β-1，3-葡聚糖組分，可對大分子進行適度降解，以達到所需的分子量和性質(zhì)要求。降解β-1，3-葡聚糖的已知方法很多，常用的有酸(如HCl，HCOOH)、堿(如NaOH)、酶(如β-葡萄糖苷水解酶)水解，以及熱降解(如大于150℃的高溫)和機械破碎(如超聲波)等，通過控制反應(yīng)物的濃度、溫度和時間等條件可獲得適宜大小的反應(yīng)混合物。由于分子量越大的多糖在乙醇溶液中的溶解度越小，因此通過控制乙醇的濃度即可將所需大小的多糖組分從該反應(yīng)混合物中分級分離出來，再配合適當?shù)某瑸V、層析或吸附等方法進一步純化，即可獲取高純度所需大小的β-1，3-葡聚糖組分，經(jīng)濃縮和干燥可制成固體原料藥待用。β-1，3-葡聚糖的常規(guī)制備、質(zhì)控及分析等方法屬于已知常規(guī)技術(shù)，可參見有關(guān)的技術(shù)文獻。
β-1，3-葡聚糖衍生物制備的常用方法包括水解、甲基化、羧基化、羧甲基化、胺基化、N-乙?；?、羥乙基化、硫酸化、磷酸化等。由于這些衍生化修飾對分子主鏈結(jié)構(gòu)的影響通常是有限的，但對改善分子的某些性質(zhì)并降低副作用可能是有益的，例如羧甲基化的β-1，3-葡聚糖水溶性增強，補體(旁路)激活作用減弱等。因此，β-1，3-葡聚糖的衍生物也包含在本發(fā)明的精神之中。
本發(fā)明所述以β-1，3-葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物的其它特征還包括
1、β-1，3-葡聚糖的有效劑量范圍通常為每人每天0.5-80mg/kg(體重)，更優(yōu)的選擇為每人每天5-50mg/kg；2、給藥途徑以注射給藥為主，其中包括靜脈滴注、靜脈注射，也可采用肌肉、腹腔注射，以及口服給藥；3、在組成上包括有效劑量的β-1，3-葡聚糖和藥學上可以接受的載體、輔料和(或)藥物；4、藥物的劑型以注射劑型為主，也包括口服劑型；5、有效劑量的β-1，3-葡聚糖還可以與藥學上可以接受的其它藥物組成復(fù)方藥物或藥物組合物。
非靜脈途徑給藥主要用于疾病的維持期治療或長期預(yù)防性治療，此時的應(yīng)用可選用較小劑量?？傊?，具體應(yīng)用時，不同分子量范圍的β-1，3-葡聚糖組分使用的劑量可以有所差別，如較小分子量的組分用藥劑量可以相對較大些，大分子組分劑量可以較小些；另外，根據(jù)病人、病情、以及防治進程等不同情況和需要，劑量也可有所調(diào)整與變化。
本發(fā)明所述β-1，3-葡聚糖的應(yīng)用可以是其含量較高的純品，也可以是含有有效量的β-1，3-葡聚糖的混合物，但其藥物制劑均應(yīng)符合注射劑的質(zhì)量要求。既可以申報西藥(化學藥物)也可以申報中藥(天然藥物)。
制備注射劑的例子，包括將符合注射劑質(zhì)量要求的高純度β-1，3-葡聚糖按有效劑量和所需量的液體基質(zhì)混合制作而成，該基質(zhì)的例子包括水、生理鹽水或其它緩沖液，其中還可添加其它有益成分或輔料，但均應(yīng)符合注射劑的有關(guān)質(zhì)量要求。制備復(fù)方藥物或組合物的例子，包括將有效劑量的β-1，3-葡聚糖和其它藥物成分混合制成某些劑型?？傊苽溥@些劑型的方法在藥劑學中是已知和常規(guī)的，該領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)需要可以理解和實施，在此不必贅述。
以下是本發(fā)明的實施例，該敘述的目的是為了更好地說明本發(fā)明如何實施及其效果。目的僅在于說明，而并不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1β-1，3-葡聚糖原料藥與注射液的制備取市售香菇子實體或其菇梗(干)，經(jīng)粗粉碎后再用微粉碎機粉碎并過100目篩篩出菇粉。反應(yīng)罐中加入1份重量的菇粉，再加入19倍重量的自來水，然后攪拌均勻，加熱煮沸15分鐘排除空氣，然后密閉反應(yīng)罐，繼續(xù)加熱升溫至165℃并維持3小時，停止加熱，冷卻至100℃以下后，放氣開罐，攪勻后用濾布過濾，濾液在攪拌下加入等體積95％食用乙醇，繼續(xù)攪拌約半小時后6000rpm×15min離心，取上清液，用超濾法(截留分子量為10KD)濃縮至約原體積的1/10后，補加蒸餾水至原體積，再同上重復(fù)濃縮兩次以充分純化之，濃縮液中加入1％766型粗?；钚蕴?w/w)，攪拌均勻，加熱煮沸約20分鐘，用3號垂熔漏斗過濾，濾液用噴霧干燥法(進風溫度150℃/出風溫度80℃)制成干粉，即為β-1，3-葡聚糖原料藥。定量分析采用常規(guī)“酚-硫酸”法。經(jīng)檢驗，β-1，3-葡聚糖原料藥呈米色至淺褐色粉末，有吸濕性，純度一般不低于95％，結(jié)構(gòu)為富含β-1，6-葡萄糖枝鏈的β-1，3-葡聚糖，分子量分布約10-50KD，水溶性良好，無熱源反應(yīng)，收率約1-2％(w/w)。
0.5％β-1，3-葡聚糖/0.9％氯化鈉注射液的制備按處方量要求稱取上述β-1，3-葡聚糖原料藥和藥用氯化鈉，加適量注射用水攪拌溶解，加入1％766型粗粒活性炭(w/w)，攪拌均勻，加熱煮沸約20分鐘，用3號垂熔漏斗趁熱過濾，濾液調(diào)節(jié)PH至7，補加注射用水至設(shè)計全量，經(jīng)3號垂熔漏斗過濾后，罐裝于100ml輸液瓶中，每瓶100ml，加蓋封口，115℃滅菌30分鐘，冷卻后即為所需藥物制劑。該制劑為介于無色-淺棕色間的澄明溶液，含量為每瓶約500mg/100ml。該制劑過程應(yīng)按照注射制劑的規(guī)范要求進行。對于藥物制劑領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說，該制劑過程屬于常規(guī)技術(shù)。
實施例2β-1，3-葡聚糖對小鼠常壓耐缺氧能力的影響昆明種小鼠(購自山東大學動物房)36只，體重18-22g(雌)，隨機分組，每組6只。試驗樣品為β-1，3-葡聚糖生理鹽水注射液(分子量分布為10-100KD)。每鼠尾靜脈給藥0.5ml(IV)，1小時后將小鼠放入內(nèi)置20g鈉石灰(10gNaOH+10gCaCO3)的250ml廣口并磨口的試劑瓶中，立即蓋嚴瓶塞并開始計時，直至小鼠呼吸停止時停止計時。統(tǒng)計并比較各組結(jié)果。(參見表1)結(jié)果顯示β-1，3-葡聚糖對小鼠常壓耐缺氧能力有非常顯著的提高作用(p＜0.01)。其中100mg/Kg以上的大劑量組可使小鼠耐缺氧能力增強60％以上。由于心肌和大腦是對缺氧(缺血)最敏感的組織器官之一，因此本實驗結(jié)果提示該β-1，3-葡聚糖對增強小鼠心、組織的抗缺血(缺氧)能力可能有顯著作用。
表1、β-1，3-葡聚糖對小鼠耐缺氧能力的影響組別 劑量 給藥 耐缺氧時間 耐缺氧增強P值(MG/KG)途徑(MIN) 率(％)對照生理鹽水IV 31.9±4.7 0樣品 20IV 40.6±4.5 27.3 0.008330IV 39.7±8.9 24.5 0.08960IV 36.0±6.8 12.9 0.252100 IV 53.2±11.266.8 0.0016150 IV 51.3±12.160.8 0.0043注耐缺氧增強率(％)＝(試驗組-對照組)/對照組×100％實施例3β-1，3-葡聚糖抗急性心肌缺血與再灌注損傷作用實驗方法健康雜種犬(由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)8只，雄雌各半，隨機分為2組。動物稱重后以3％戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈注射麻醉。氣管插管，接麻醉呼吸機(SC-M5型，上海醫(yī)療儀器廠)，開胸后行機械通氣，呼吸頻率16-18次/分，吸氣與呼氣之比為1∶2，潮氣量350-550ml，并根據(jù)血氣分析結(jié)果調(diào)整通氣指標。以針狀電極插入四肢及胸前皮下，監(jiān)測標準肢導(dǎo)及V1、V3、V5心電圖。沿胸骨左緣第3肋間開胸，并切斷第4肋骨充分暴露心臟。剪開心包并作心包吊床。靜脈注射利多卡因2mg/kg預(yù)防心律失常。分離左冠狀動脈前降支起始部位，于前降支下繞兩段1號絲線打松結(jié)，將一段直徑1mm的鋼絲插入第一松結(jié)內(nèi)，結(jié)扎第一結(jié)，將鋼絲與冠狀動脈一起結(jié)扎，抽出鋼絲。30分鐘后松開第一結(jié)，用動脈夾將血管夾閉(同時靜脈注射給藥)。觀察完全阻斷血流后5分、10分、30分和90分鐘心電圖變化。90分鐘時松開動脈夾，記錄恢復(fù)血流后5分、15分、30分和1小時、2小時的心電圖變化和心率失常情況，從第一次結(jié)扎到實驗結(jié)束共4小時。然后取心臟，稱全心重量，沿主動脈根部左右冠狀動脈開口處加壓注入10％碳素墨汁10ml，顯示心肌非缺血區(qū)(被染黑的心肌)和缺血區(qū)(未被染黑區(qū))，剪取缺血區(qū)稱重。然后將缺血區(qū)切成0.5～1cm厚的心肌片，用生理鹽水洗凈，置37℃ 0.025％氯化硝基四氮唑藍(NBT)液染色。染色過程中不時搖動染色液使之與心肌充分接觸。30分鐘后立即用水沖去多余染料。梗死心肌不著色，非梗死心肌被染成著黑色，剪去著色部分，將未著色的梗死區(qū)稱重。
試驗樣品為0.55％β-1，3-葡聚糖的0.9％氯化鈉注射液(分子量分布為10-100KD)。劑量為45mg/kg，給藥次數(shù)為一次。給藥方法為靜脈注射，與臨床擬用藥途徑一致。對照組于冠狀動脈完全結(jié)扎前30分鐘靜脈注射生理鹽水(8ml/kg)；試驗樣品組給藥容積和條件與生理鹽水對照組相同。
觀察指標給藥后主要觀察指標為心率、死亡率、心律失常、胸導(dǎo)心電圖ST段抬高程度及心肌梗死范圍等定量指標，具體如下1、死亡率2、心率次/分3、ST段抬高程度ΔST觀察時間為給藥后5、15、30分鐘，和1、2、3、4小時。
4、心肌梗死程度缺血區(qū)(g)即冠脈結(jié)扎區(qū)(未被墨水染黑的心肌)梗死區(qū)(g)即NBT染色未著色心肌心肌梗死率(％)梗死心肌重/缺血區(qū)心肌重×100％統(tǒng)計分析試驗結(jié)果以x±S表示，采用非配對t檢驗法統(tǒng)計，P＜0.05為具有顯著性統(tǒng)計學差異。
試驗結(jié)果1、對心電圖ST段抬高程度的影響從表2中可見，試驗樣品組麻醉開胸犬心肌梗死后心電圖ST段抬高的程度與生理鹽水組比較顯著降低。
表2、心電圖ST抬高程度(mv)組別結(jié)扎前 結(jié)扎后5min 15min 30min 1h 2h3h4h對照0 0.35 0.4 0.30.30.35 0.3 0.3樣品0±0 0.22± 0.24± 0.20±0.19±0.17± 0.16± 0.16±0.04 0.04 0.04 0.02 0.03 0.02 0.022、對死亡率的影響從表3可知，再灌注后生理鹽水對照組4只犬死亡3只，殘廢(死亡)率達75％，殘廢原因為室顫，發(fā)生于再灌注后15分鐘左右；樣品組死亡率為0，兩組間死亡率比較有非常顯著差異(p＜0.001)。
表3、缺血與再灌注后死亡率組別 動物數(shù) 死亡數(shù)死亡率 P值(只) (只) (％)對照組 4 3 75樣品組 4 0 0＜0.0013、對心率的影響樣品組對麻醉開胸犬心率的影響與對照組相比無明顯差異。
4、對心肌梗死范圍的影響從表4中可以看出，樣品組能降低急梗再灌注犬的心肌梗死范圍，降低心肌腫脹率。
表4、對麻醉犬急性心肌梗死范圍的影響組別動物數(shù) 心臟重量 缺血區(qū)重 梗死心肌重梗死率(只)(g)(g) (g) (％)對照 4 88.6 16.5 1.2 7.3樣品組4 79.5±20.8 13.9±4.4 0.63±0.8 4.5結(jié)論1、β-1，3-葡聚糖(分子量分布10-100KD)注射液45mg/kg靜脈注射可顯著降低犬冠脈結(jié)扎后心肌缺血引起的ST段抬高程度，大部分時間段與生理鹽水組比較t檢驗相差顯著。提示該β-1，3-葡聚糖具有顯著的抗缺血性損傷作用。
2、β-1，3-葡聚糖(分子量分布10-100KD)注射液45mg/kg靜脈注射對犬急性心肌梗死再灌注后出現(xiàn)的心律失常有非常顯著的預(yù)防作用，并可顯著降低再灌注死亡率，對防止缺血與再灌注后心肌壞死也有良好作用。提示該β-1，3-葡聚糖對心肌缺血與再灌注損傷有非常顯著的防治作用。
研究結(jié)果顯示，β-1，3-葡聚糖具有顯著的抗缺血與再灌注損傷作用。作為一種以β-1，3-葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物，在發(fā)生急性缺血性疾病后，如果能盡快給患者注射使用該藥物，可望顯著降低缺血性損傷和再灌注損傷，對于挽救患者的生命、減少并發(fā)癥、以及改善預(yù)后等都有重要意義。
以上盡管我們描述了本發(fā)明的實施方案與效果，顯然并不意味著僅限于此。實際上，本發(fā)明的實施方案可以進行許多改變以充分利用本發(fā)明的用途而不超出本發(fā)明的范圍和精神。因此應(yīng)該理解，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)當由所附權(quán)利要求書來限定，而不是由以實施例方式表示的特定實施方案來限定。
權(quán)利要求
1.一種抗缺血與再灌注損傷藥物，其特征在于(1)、以β-1，3-葡聚糖為有效成分，(2)、不但具有顯著的抗缺血性損傷作用，還具有顯著的抗再灌注損傷作用，(3)、β-1，3-葡聚糖的分子量選擇范圍為0.5-3000KD(Kilo Dalton)，較好的選擇范圍為1-500KD，更優(yōu)的選擇范圍為2-100KD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所述藥物的用途包括用于急性心肌梗塞、腦卒中、休克、冠心病及其介入治療、心血管手術(shù)、腸缺血、組織與器官移植等疾病的急救和治療，這些疾病均以血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)生或?qū)⒁l(fā)生缺血和(或)再灌注損傷為特征。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2，所述β-1，3-葡聚糖的特征在于有效劑量范圍為每人每天0.5-80mg/kg(體重)，更優(yōu)的選擇為每人每天5-50mg/kg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2，所述β-1，3-葡聚糖的特征在于分子的主鏈結(jié)構(gòu)由β-1，3-葡萄糖苷鍵連接構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4，所述β-1，3-葡聚糖的特征在于允許在β-1，3-葡聚糖主鏈上含有較少量的包括β-1，6-或β-1，4-葡萄糖結(jié)構(gòu)在內(nèi)的枝鏈存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4，所述β-1，3-葡聚糖的特征在于包括經(jīng)過化學修飾的β-1，3-葡聚糖衍生物及其生理上能夠接受的鹽類。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2，所述藥物的特征在于給藥途徑以注射給藥為主，其中包括靜脈滴注、靜脈注射，也可采用肌肉、腹腔注射，以及口服給藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或7，所述藥物的特征在于劑型以注射劑型為主，也包括口服劑型。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2，所述藥物的特征在于在組成上包括有效劑量的β-1，3-葡聚糖和藥學上可以接受的載體、輔料和(或)其它藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以β－1,3－葡聚糖為有效成分的抗缺血與再灌注損傷藥物及其在急性心肌梗塞、腦卒中、休克、冠心病及其介入治療、心血管手術(shù)、腸缺血、組織與器官移植等疾病的急救和治療中的用途,這些疾病均以血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)生或?qū)⒁l(fā)生缺血和(或)再灌注損傷為特征。
文檔編號A61K31/74GK1387856SQ0111498
公開日2003年1月1日 申請日期2001年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者王京杭, 蘇定馮 申請人:王京杭