一種電聚絲素水凝膠膜的制備方法、裝置及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種電聚絲素水凝膠膜的制備方法、裝置及其應(yīng)用。將絲素蛋白通過(guò)電泳動(dòng)作用在納米孔徑屏障膜上快速自組裝成電聚絲素水凝膠膜；制備裝置由一個(gè)盛裝電聚緩沖液的、中間被屏障膜分隔成內(nèi)、外二室的容器組成，內(nèi)室接負(fù)極、外室接正極，注入內(nèi)室的絲素蛋白在含SDS的電聚緩沖液中帶負(fù)電荷，在較高直流電場(chǎng)作用下朝正極方向泳動(dòng)，在屏障膜上快速自組裝形成電聚絲素水凝膠膜。這種濕態(tài)凝膠膜半透明、光滑、柔軟并富有彈性，持水能力約其自身重量十倍，L929細(xì)胞能在其表面粘附生長(zhǎng)，包埋的藥物能持續(xù)釋放，植入動(dòng)物體內(nèi)可緩慢降解，無(wú)明顯免疫或炎癥反應(yīng)。凝膠膜在人工皮膚、外科手術(shù)植入體或填充料或細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)等領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種電聚絲素水凝膠膜的制備方法、裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種在水或緩沖液中將帶正或負(fù)電荷的生物高分子在一個(gè)直流電場(chǎng)作用下快速自組裝成電聚絲素水凝膠膜(ESFHM)的方法與加工裝置。本發(fā)明也與醫(yī)用組織工程材料的制備方法與組成有關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0002]利用天然的絲素蛋白的生物相容性特點(diǎn)加工成醫(yī)用組織工程材料是當(dāng)前研發(fā)熱點(diǎn)之一。絲纖維是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)高分子聚合物，包括蜘蛛絲、家蠶絲、蓖麻蠶絲、柞蠶絲等
坐寸ο
[0003]目前常用的絲纖維通常是指某些鱗翅目昆蟲家蠶生產(chǎn)的一種蛋白纖維。這種蛋白纖維主要由絲素蛋白纖維和被覆在其周圍的膠狀絲膠蛋白組成。當(dāng)被覆在纖維外面的絲膠蛋白人為去除后，蠶絲絲素蛋白纖維因具有輕飄、舒適、吸放濕性強(qiáng)、柔軟、彈性和染色艷麗等特性，自古以來(lái)是紡織材料，常被譽(yù)為紡織纖維的皇后。近年，因其生物相容性、可緩慢降解性與優(yōu)異的機(jī)械特性，常用于生物醫(yī)用材料尤其是醫(yī)用組織工程材料的研究與開(kāi)發(fā)。這些醫(yī)用材料的研究 與開(kāi)發(fā)往往基于脫膠的絲素纖維經(jīng)過(guò)高鹽溶液溶解后制成的再生液態(tài)絲素而實(shí)現(xiàn)的。這種液態(tài)絲素易受環(huán)境條件的影響制成各種形態(tài)的絲素生物材料如絲素膜、凝膠、再生纖維、粉末或納米顆粒以及3D支架等。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的物理或化學(xué)處理，這種再生絲素蛋白的結(jié)構(gòu)也容易從無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變成α-螺旋(Silk I)或β-折疊(Silk II)結(jié)構(gòu)，這些加工特性就為絲素蛋白開(kāi)發(fā)成為性能優(yōu)異的生物醫(yī)用組織工程材料創(chuàng)造了得天獨(dú)厚的有利條件。
[0004]蠶絲絲素是一種獨(dú)特的絲素蛋白，通過(guò)溶解、脫鹽純化制成液態(tài)絲素后，它可以從其天然形態(tài)重新改變出其它各種形狀或形態(tài)。利用再生液態(tài)絲素通過(guò)多種物理或化學(xué)方法如水分揮發(fā)等制成絲素蛋白膜已有許多報(bào)道和專利申請(qǐng)，將這種液態(tài)絲素凍結(jié)后進(jìn)行冷凍干燥制成多孔結(jié)構(gòu)的絲素膜(CN1260363)。近十年來(lái)，對(duì)絲蛋白特別是絲素蛋白的開(kāi)發(fā)利用已大大超出其原有傳統(tǒng)的紡織纖維和醫(yī)用縫合線的經(jīng)典用途。例如，水凝膠(W02005/012606 ；PCT/US08/65076)、超薄膜(W02007/016524)、厚膜，保形涂層(W02005/000483 ； W02005/123114)、微球(PCT/US2007/020789)、3D 多孔基質(zhì)(TO2004/062697)、固形物(TO2003/056297)，微流裝置(PCT/US07/83646; PCT/US07/83634),電-光裝置(PCT/US07/83639)、從納米級(jí)(W02004/0000915)到幾厘米(U.S.Pat.N0.6902932)的再生纖維用于生物醫(yī)用材料和再生醫(yī)藥(W02006/042287 ;US20070212730 ； PCT/US08/55072)，甚至是納米級(jí)顆粒或藥物緩釋的固定化酶/藥物納米顆粒(W0 2005/085327 ;W02007/112679)。尤其是在低壓電場(chǎng)作用下絲素蛋白在正極附近轉(zhuǎn)變成絲素電凝膠，這種電凝膠主要可以用于醫(yī)用生物膠水等領(lǐng)域(US20110171239A1或W02010036992A2)。
[0005]絲素溶液加工成為一定形態(tài)和質(zhì)地的絲素生物材料要求特定的探索和個(gè)性研發(fā)技術(shù)。例如，電紡是一個(gè)產(chǎn)生納米級(jí)纖維的過(guò)程，這種纖維常加工成墊子和管狀結(jié)構(gòu)的物品。在這個(gè)電紡加工工藝中，常用10 KV~20 KV范圍的高壓電用來(lái)驅(qū)動(dòng)針頭中絲素溶液的快速噴射，從而加速凝固成亞微米直徑的固體纖維。這種工藝可以平穩(wěn)堆積成類似于無(wú)紡布結(jié)構(gòu)的層狀材料(Li et al., Biomaterials.27: 3115-24，2006)。而在電凝膠加工工藝中，浸在高濃度的(常用濃度9%)再生絲素溶液中的正負(fù)電極，在低壓電場(chǎng)(直流電或交流電)如24.8 V電場(chǎng)作用下，絲素分子在正極周圍產(chǎn)生電凝膠，這種絲素電凝膠可以用作醫(yī)用生物膠粘劑(Yucel et al., J Struct.Biol.170 (2010) 406 - 412)，當(dāng)電場(chǎng)極性相反時(shí)，正極周圍產(chǎn)生絲素凝膠又轉(zhuǎn)變稱為液態(tài)的絲素溶液。所以，電凝膠加工過(guò)程中，絲素溶液與絲素凝膠的轉(zhuǎn)變是可以可逆的。也有報(bào)道通過(guò)電泳沉積技術(shù)來(lái)制備水凝膠膜(Zhanget al., Journal of Materials Chemistry.2011, 21, 7705)。將絲素溶液和殼聚糖溶液混合成電泳液，使用鈦合金板作為電極，在4V, 5v/cnT2的條件下恒壓30 S，就可獲得絲素-殼聚糖凝膠狀涂層材料，這些凝膠涂層材料可以用于細(xì)胞培養(yǎng)，也可以作為一種有效的藥物載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具有柔軟、彈性特性的納米多孔性或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的絲素水凝膠膜的制備方法、裝置及其應(yīng)用。 [0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是提供一種絲素水凝膠膜的制備方法，將盛有水溶性絲素蛋白溶液的內(nèi)室容器置于盛有電聚緩沖液的外室容器中，內(nèi)室容器的底部為屏障膜；將內(nèi)室接負(fù)極，外室接正極，在直流電場(chǎng)作用下，于屏障膜上得到一種絲素水凝膠膜；所述屏障膜為截留I~100 kDa以上分子量的納孔膜；所述水溶性絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度為
0.5~10% ;所述電聚緩沖液為含質(zhì)量濃度0.05~5% SDS的鹽-甘氨酸系統(tǒng)，甘氨酸的濃度為1.0 mM~1000 mM，鹽的濃度為1.0 mM~1000 mM ;用HCl調(diào)節(jié)電聚緩沖液的pH值為
4.0~10.0 ;所述直流電場(chǎng)為10~200 mA的恒流電場(chǎng)，或50~200 VDC的恒壓電場(chǎng)；直流電場(chǎng)的作用時(shí)間為10~100 min。
[0008]本發(fā)明所述的納孔膜為親水性天然高分子材料的納孔膜，所述的親水性天然高分子親水性材料為瓊脂糖、葡聚糖膜中的一種。所述的納孔膜還可以為親水性合成高分子材料的納孔膜，所述的親水性合成高分子材料為聚丙烯酰胺凝膠。所述的納孔膜也可以為無(wú)機(jī)材料的納孔膜，所述的無(wú)機(jī)材料為陶瓷。所述的納孔膜為親水性高分子材料的透析膜，所述的透析膜為再生纖維素透析膜、纖維素酯透析膜。 [0009]本發(fā)明所述的鹽為無(wú)機(jī)鹽磷酸鹽或碳酸鹽。也可以為有機(jī)鹽檸檬酸鹽或醋酸鹽。
[0010]本發(fā)明技術(shù)方案在水溶性絲素蛋白溶液中還可以包括生物活性物質(zhì)酶、多肽藥物，或小分子藥物。
[0011]一種制備上述絲素水凝膠膜的裝置，其結(jié)構(gòu)為:內(nèi)外容器固定于外室容器中，內(nèi)室容器底部為屏障膜，所述屏障膜為截留I~100 kDa以上分子量的納孔膜；內(nèi)室接通直流電源的負(fù)極，外室接通直流電源的正極。
[0012]本發(fā)明技術(shù)方案還包括將所述的絲素水凝膠膜用作醫(yī)用組織工程材料人工皮膚、外科手術(shù)植入式填充料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
[0013]本發(fā)明在電聚合的加工過(guò)程中，弓丨入一個(gè)直流恒流或恒壓的電場(chǎng)，在含有或不含有SDS的Tris-甘氨酸緩沖液中，絲素分子在不能穿過(guò)的納孔屏障膜上快速自組裝成為ESFHM。在這種充滿電聚緩沖液(pH6.50)的容器中，被一種納孔屏障膜(僅限制生物高分子如絲素通過(guò)的薄膜)分隔成內(nèi)、外二室，外室插入鉬絲或鉬板陽(yáng)極，內(nèi)室插入鉬絲或鉬板陰極并額外加入絲素蛋白溶液。在恒壓13 VDC/cm2或恒流6 mA/cm2情況下,絲素分子在SDS包裹下帶大量的負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下均勻地向正極方向移動(dòng)，因不能穿過(guò)納孔屏障膜，故在此納米膜上快速自組裝形成ESFHM。
[0014]本發(fā)明的絲素蛋白電聚膜的加工工藝較簡(jiǎn)單，絲素蛋白分子在電聚緩沖液中與陰離子去污劑SDS結(jié)合后帶大量的負(fù)電荷，在較高的直流電場(chǎng)作用下像其它帶電的小分子或離子一樣，向正極方向運(yùn)動(dòng)。帶電的小分子或離子因體積小能穿透安裝在內(nèi)、外室中間的納米孔徑屏障膜，而巨大的絲素蛋白分子無(wú)法穿透納孔屏障膜，從而在納孔屏障膜上快速自組裝堆積形成具有多孔結(jié)構(gòu)的絲素水凝膠膜。
[0015]屏障膜是小分子或離子能通過(guò)而生物大分子無(wú)法穿透的納米孔徑的有機(jī)膜或無(wú)機(jī)膜，納孔有機(jī)膜主要是指聚丙烯酰胺凝膠膜、透析膜或其它高分子聚合膜等；納孔無(wú)機(jī)膜主要是指陶瓷膜等。聚丙烯酰胺凝膠膜的孔徑大小由凝膠含量而定；透析膜的孔徑大小可以選用市售截留不同分子量范圍的透析膜而定。這種限制絲素分子通過(guò)的高分子聚合膜或無(wú)機(jī)膜起到了生物高分子電聚合的關(guān)鍵作用。
[0016]在Tris-甘氨酸電聚緩沖液(最佳方案為ρΗ6.5)加入質(zhì)量濃度0.05~5% (最佳方案為0.2% )的SDS對(duì)液態(tài)絲素電聚成絲素膜同樣起到關(guān)鍵的作用，但過(guò)多、過(guò)少或甚至沒(méi)有SDS，雖然也能形成水凝膠膜，但影響ESFHM的特性如彈性、平整程度或透明程度等。
[0017]電聚形成的絲素水凝膠膜比其它方法形成的絲素膜或絲素3D材料更具有優(yōu)越性，如靠水份揮發(fā)形成的絲素膜。后者形成的絲素膜需經(jīng)過(guò)其他物化處理后才能成為不溶于水的膜，水溶液中此膜彈性、伸縮性、吸水性有限；濕態(tài)電聚絲素水凝膠膜(ESFHM)非常柔軟、富有彈性，吸水能力是其自身重量10倍左右，在體外能被蛋白酶降解，在生物體內(nèi)能緩慢分解、無(wú)明顯免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)；同時(shí)在體外細(xì)胞也易在其表面粘附、增殖與生長(zhǎng)。
[0018]電聚形成的絲素水凝膠膜比靠水份揮發(fā)形成的絲素膜更具有優(yōu)越性，特別是這種水凝膠膜的納米多孔性或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。電聚過(guò)程中，因帶電小分子的電泳動(dòng)，使電聚形成的絲素水凝膠膜成為納米多孔性。
[0019]ESFHM制備時(shí)，兩端應(yīng)用的恒壓或恒流直流電場(chǎng)特別重要，它的大小直接影響ESFHM的柔軟、彈性等特性。
[0020]在ESFHM中若要加入活性物質(zhì)如藥物等，可以將這些活性物質(zhì)加入到再生液態(tài)絲素中。通過(guò)電場(chǎng)的作用，這些活性物質(zhì)就可以嵌入到ESFHM中。這些具有活性物質(zhì)的ESFHM在作為醫(yī)用組織工程材料如人工皮膚、3D支架時(shí)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的一種絲素水凝膠膜的制備裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素水凝膠膜用甲醇浸潰處理前(ESFHM)后(ESFHM-M)的紅外吸收光譜；
圖3本發(fā)明實(shí)施例 提供的絲素水凝膠膜用甲醇浸潰處理前(曲線ESFHM)后(曲線ESFHM-M)的X-衍射分析圖譜；
圖4本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素水凝膠膜用甲醇浸潰處理前(ESFHM)后(ESFHM-M)的熱分析圖譜；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素水凝膠膜的掃描電鏡圖片；a圖為在無(wú)SDS的緩沖液中制備的絲素水凝膠膜，b圖為在含SDS緩沖液中制備的絲素水凝膠膜；
圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素水凝膠膜(ESFHM)在體外的酶解進(jìn)程曲線圖；
圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素水凝膠膜(ESFHM)中利福平的釋放曲線圖；
圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素水凝膠膜在小鼠血清中TNF-α含量的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述。
[0023]實(shí)施例1
1、再生絲素溶液制備
本發(fā)明主要使用以下三種蠶絲脫膠方法:
(I)尿素緩沖液脫膠方法:將蠶繭去衣，剖開(kāi)去蛹稱取質(zhì)量后加入30倍量體積SM尿素-Tris-H2SO4-0.5M巰基乙醇(ρΗ7.00)的尿素脫膠液，于80°C水浴鍋中以150 rpm振蕩2h。取出后用去離子水沖洗干凈，于80°C干燥2 h,即得完全脫膠的絲素蛋白纖維。 [0024](2)碳酸鈉脫膠方法:將蠶繭去衣，剖開(kāi)去蛹稱取質(zhì)量后加入25倍量體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的碳酸鈉溶液，煮沸30 min，用去離子水沖洗干凈后，以同樣比例、同樣濃度的碳酸鈉溶液中再脫膠30 min,以確保去除絲素纖維外粘附的絲膠蛋白。最后用去離子水沖洗干凈，于80°C干燥2 h,即得完全脫膠的絲素蛋白纖維。
[0025](3)強(qiáng)堿性電解水脫膠法:將蠶繭去衣，剖開(kāi)去蛹稱取質(zhì)量后加入25倍量體積的pHll.5強(qiáng)堿性電解水(簡(jiǎn)稱:電解水)煮沸30 min,同樣換液重復(fù)煮沸I次，以確保去除絲素纖維外粘附的絲膠蛋白。于80 °C干燥2 h,即得完全脫膠的絲素蛋白纖維。
[0026]絲素纖維溶解的方法有以下二種:
(I)溴化鋰溶液溶解:將脫膠的絲素蛋白纖維溶于9.3M的溴化鋰溶液中，浴比20:I (V/W)，于25 °C恒溫?fù)u床中以90 rpm振蕩至全部溶解。
[0027](2)氯化鈣三元溶劑溶解:將脫膠的絲素蛋白纖維溶于(CaCl2-EOH-H2O=1:2:8)的三元溶劑中，浴比20:1(V/W)于70 °C恒溫?fù)u床中以90 rpm振蕩至全部溶解。獲得的纖維溶液用透析袋(3.5K MWC0)經(jīng)過(guò)凈水或去離子水透析48h。透析液用濾紙過(guò)濾或離心(8，OOOrpm)分離20min，取上清液獲得絲素濃度為4%水溶液(W/V)，置于4 °C存放備用。
[0028]從蠶繭脫膠到絲素纖維溶解與純化總體分為以下三類:
(1)尿素脫膠和溴化鋰溶液溶解(簡(jiǎn)稱:尿素-溴化鋰);
(2)強(qiáng)堿性電解水脫膠和三元溶劑溶解(簡(jiǎn)稱:堿性水-三元溶劑)；
(3)碳酸鈉溶液脫膠與三元溶劑溶解(簡(jiǎn)稱:碳酸鈉-三元溶劑)。
[0029]2、電聚絲素水凝膠膜制備
參見(jiàn)附圖1，它是本實(shí)施例絲素水凝膠膜的制備裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，分別用兩個(gè)容器組成內(nèi)室和外室，內(nèi)室容器通過(guò)內(nèi)室底座固定于外室容器中，內(nèi)室容器的底部為納孔屏障膜，由屏障膜支撐將其固定于內(nèi)室容器底部，納孔屏障膜為截留I~100 kDa以上分子量的納孔膜；內(nèi)室通過(guò)電極接通直流電源的負(fù)極，外室通過(guò)電極接接通直流電源的正極；將一定體積的Tris-甘氨酸緩沖液(0.2% SDS，pH6.5)加入電聚裝置的外室，而一定體積的再生絲素溶液與一定體積的Tris-甘氨酸緩沖液(0.2% SDS，pH6.5)混合后，加入到電聚裝置的內(nèi)室，然后打開(kāi)電聚裝置的直流可控電源(本實(shí)施例選用Tanon EPS100，上海天能科技有限公司制造)，調(diào)節(jié)直流電壓80v開(kāi)始電聚，50 min后切斷電源，取出納孔屏障膜上形成的電聚絲素水凝膠膜，這種柔軟的半透明水凝膠膜沖洗后浸于純水中置于4 °C備用。以甲醇浸潰處理作為對(duì)照(簡(jiǎn)稱:ESFHM-M)，將ESFHM浸于80%的甲醇溶液中處理20min，取出后用去離子水沖洗，最后浸于純水中置于4 °C備用。
[0030]在本發(fā)明技術(shù)方案中，納孔屏障膜可以是為親水性天然高分子材料的納孔膜，如瓊脂糖、葡聚糖膜等；納孔屏障膜也可為親水性合成高分子材料，如聚丙烯酰胺凝膠等；還可以是無(wú)機(jī)材料如陶瓷，及親水性高分子材料的透析膜，如再生纖維素透析膜、纖維素酯透析膜等。
[0031]在本發(fā)明技術(shù)方案中，鹽為無(wú)機(jī)鹽磷酸鹽或碳酸鹽，也可以為有機(jī)鹽檸檬酸鹽或醋酸鹽。電聚緩沖液為含質(zhì)量濃度0.05~5% SDS的鹽-甘氨酸系統(tǒng)，甘氨酸的濃度為1.0mM~1000 mM，鹽的 濃度為1.0 mM~1000 mM ;用HCl調(diào)節(jié)電聚緩沖液的pH值為4.0~10.0。在水溶性絲素蛋白溶液中還可加入生物活性物質(zhì)酶、多肽藥物，或小分子藥物。
[0032]在本發(fā)明技術(shù)方案中，直流電場(chǎng)為10~200 mA的恒流電場(chǎng)，或50~200 VDC的恒壓電場(chǎng)；直流電場(chǎng)的作用時(shí)間為10~100 min。
[0033]3、電聚絲素水凝膠膜的結(jié)構(gòu)測(cè)定
采用YG021單紗強(qiáng)力機(jī)(本實(shí)施例選用常州第二紡織儀器廠有限公司)分析ESFHM的機(jī)械性能，結(jié)果參見(jiàn)表1，測(cè)試速度10 mm/min ;采用KES-FB3型Compression Tester分析ESFHM的壓縮性能，結(jié)果參見(jiàn)表2 ;采用Varian傅里葉紅外光譜分析儀(本實(shí)施例選用Nicolet 6700 ；Thermo Fisher, USA)對(duì)ESFHM進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果參見(jiàn)附圖2，掃描次數(shù)32次，分辨率I cnT1; ESFHM的X-衍射分析結(jié)果參見(jiàn)附圖3;采用Pyris-1 D碳酸鈉、TGA、TMA-7型熱分析儀(美國(guó)PE公司)進(jìn)行ESFHM熱分析，N2保護(hù)條件下，升溫速率200C /min，溫度為50~350 °C，測(cè)定樣品的D碳酸鈉曲線參見(jiàn)附圖4 ;將ESFHM用去離子水反復(fù)沖洗去除表面殘留的鹽離子，洗凈后通過(guò)戊二醛-鋨酸固定液進(jìn)行雙固定，經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖液沖洗后進(jìn)行剪切固定，噴金后在掃描電鏡(本實(shí)施例選用S-4700，日本日立公司)上，在15 kV電壓下觀察ESFHM超微結(jié)構(gòu)參見(jiàn)附圖5 ；a圖為在無(wú)SDS的緩沖液中制備的絲素水凝膠膜，b圖為在含SDS緩沖液中制備的絲素水凝膠膜。所提供的多孔絲素水凝膠膜可用作醫(yī)用組織工程材料人工皮膚、外科手術(shù)植入式填充料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)等。
[0034]4、電聚絲素水凝膠膜的體外酶降解
為了測(cè)定電聚絲素水凝膠膜在體外的酶解特性，水凝膠膜樣品浸入分子量為13萬(wàn)的中性蛋白酶(酶活性濃度為4 U/ml)溶液中，浴比1:50，于371:恒溫?fù)u床中輕微振蕩降解(90 rpm)。在1，2，3，4天時(shí)取出水凝膠膜稱重，并將含有降解產(chǎn)物的酶溶液用新配制的酶溶液換掉，結(jié)果參見(jiàn)附圖6。
[0035]5、藥物緩釋實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明選取利福平這種藥物作為包埋對(duì)象。電聚后將含有藥物的電聚膜表面使用去離子水沖洗，定量后置于5mL的EP管中，加入pH7.4的磷酸鹽緩沖液。在固定的時(shí)間段吸取上清液并使用 Spectra Max M5 型酶標(biāo)儀(Tuv Rheinland of North American.1nc.)在475 nm處測(cè)定上清液的吸光度值，繪制藥物釋放曲線，結(jié)果參見(jiàn)附圖7。[0036]6、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
在含小牛血清10 %的DMEM-H30243.0lB (Thermo HyClone)培養(yǎng)基中添加1.8%Penstrep (invitrogen)和 1.1% L-Glutamine (invitrogen)配制成細(xì)胞培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)L-929小鼠成纖維細(xì)胞。電聚絲素水凝膠膜使用75%酒精浸泡24h消毒，PBS沖洗后加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)之前加入事先配置好的培養(yǎng)基500 μ L作為實(shí)驗(yàn)組過(guò)夜處理。對(duì)照組僅加入500 μ L培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度約為1.5X104 cells/mL的細(xì)胞懸浮液加入培養(yǎng)板中，每孔中加入100 UL0每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用3塊48孔板分別培養(yǎng)3，4，5天，結(jié)果參見(jiàn)附圖8。待培養(yǎng)到相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，采用Te2000-U型倒置熒光顯微鏡(Nikon，Japan)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)。并采用MTT法處理試樣，每孔加入5 mg/mL MTT 500 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞諷(DMSO) 500 μ L,震蕩 10 min,用 Spectra Max M5 型酶標(biāo)儀(Tuv Rheinland ofNorth American.1nc.)在570 nm處測(cè)定吸光度值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果參見(jiàn)表3。
[0037]7、體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明采用清潔級(jí)體重為35~40g的雄性ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為3組，每組4只小鼠?？瞻讓?duì)照組:小鼠進(jìn)行假手術(shù)，切開(kāi)后再縫合；實(shí)驗(yàn)組:小鼠背部皮下填充經(jīng)75%乙醇24h滅菌的電聚絲素水凝膠膜；陽(yáng)性對(duì)照組:再生絲素溶液凍干后經(jīng)75%乙醇24h滅菌再植入小鼠背部皮膚內(nèi)。手術(shù)2、4、6、8周后觀察小鼠手術(shù)部位的外觀，體內(nèi)水凝膠膜的降解情況。小鼠眼球取血，分離血清，檢測(cè)血清中炎癥因子的表達(dá)，結(jié)果參見(jiàn)附圖8。
[0038]表1.ESFHM的拉伸特性
【權(quán)利要求】
1.一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:將盛有水溶性絲素蛋白溶液的內(nèi)室容器置于盛有電聚緩沖液的外室容器中，內(nèi)室容器的底部為屏障膜；將內(nèi)室接負(fù)極，外室接正極，在直流電場(chǎng)作用下，于屏障膜上得到一種絲素水凝膠膜； 所述屏障膜為截留I~100 kDa以上分子量的納孔膜； 所述水溶性絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度為0.5~10% ； 所述電聚緩沖液為含質(zhì)量濃度0.05飛％ SDS的鹽-甘氨酸系統(tǒng)，甘氨酸的濃度為1.0mM~1000 mM，鹽的濃度為1.0 mM~1000 mM ;用HCl調(diào)節(jié)電聚緩沖液的pH值為4.0~10.0 ； 所述直流電場(chǎng)為10~200 mA的恒流電場(chǎng)，或50~200 VDC的恒壓電場(chǎng)；直流電場(chǎng)的作用時(shí)間為10~100 min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:所述的納孔膜為親水性天然高分子材料的納孔膜，所述的親水性天然高分子親水性材料為瓊脂糖、葡聚糖膜中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:所述的納孔膜為親水性合成高分子材料的納孔膜，所述的親水性合成高分子材料為聚丙烯酰胺凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:所述的納孔膜為無(wú)機(jī)材料的納孔膜，所述的無(wú)機(jī)材料為陶瓷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:所述的納孔膜為親水性高分子材料的透析膜，所述的透析膜為再生纖維素透析膜、纖維素酯透析膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:所述的鹽為無(wú)機(jī)鹽磷酸鹽或碳酸鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:所述的鹽為有機(jī)鹽檸檬酸鹽或醋酸鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素水凝膠膜的制備方法，其特征在于:水溶性絲素蛋白溶液中包括生物活性物質(zhì)酶、多肽藥物，或小分子藥物。
9.一種制備絲素水凝膠膜的裝置，其特征在于:內(nèi)外容器固定于外室容器中，內(nèi)室容器底部為屏障膜，所述屏障膜為截留I~100 kDa以上分子量的納孔膜；內(nèi)室接通直流電源的負(fù)極，外室接通直流電源的正極。
10.一種絲素水凝膠膜的應(yīng)用，其特征在于:將所述的絲素水凝膠膜用作醫(yī)用組織工程材料人工皮膚、外科手術(shù)植入式填充料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK103981561SQ201410221710
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】王海燕, 張雨青 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)