一種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方法，通過在CRM197A中加入萬能表位肽P2，并采用基因重組大腸桿菌來生產(chǎn)含有萬能表位肽的白喉毒素變異體CRM197的A鏈的蛋白載體P2CRM197A；然后將4種不同血清群(包括A、C、W135和Y)莢膜多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體上形成4價流行性腦膜炎球菌多糖-P2CRM197A結(jié)合物；采用這種方法獲得的4價流行性腦膜炎球菌多糖-P2CRM197A結(jié)合物與不含有萬能表位肽的對應(yīng)蛋白載體CRM197A獲得的4價流行性腦膜炎球菌多糖-CRM197A結(jié)合物相比較，其免疫原性比對照提高了3-5倍。
【專利說明】一種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性 的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)多糖以共價鍵連接至蛋白載體上時，能將半抗原的多糖轉(zhuǎn)變成全抗原，使得多 糖的免疫原性得到增強(qiáng)。以此方法合成的多糖蛋白結(jié)合疫苗已被廣泛地應(yīng)用于小兒，成功 地預(yù)防了包括肺炎球菌，流行性腦膜炎球菌以及流行性嗜血桿菌b型等細(xì)菌的感染。
[0003] 用于合成多糖蛋白結(jié)合物的蛋白載體有多種，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、白喉 毒素變異體CRM197,以及基因重組技術(shù)生產(chǎn)的流行性嗜血桿菌表面蛋白D等；但是，由于不 同蛋白的免疫特性，以不同蛋白載體合成的多糖蛋白結(jié)合物的免疫原性有差異，動物體免 疫后，對于由不同蛋白載體與同一種多糖合成形成的多糖蛋白結(jié)合物，所顯現(xiàn)的多糖免疫 原性也不同。由此可見，采用不同技術(shù)生產(chǎn)的蛋白載體，合成出來的多糖蛋白結(jié)合物的免疫 原性有差異。
[0004] 進(jìn)入動物機(jī)體內(nèi)后，抗原經(jīng)抗原處理細(xì)胞（AntigenProcessCell，APC)處理后 產(chǎn)生表位肽（Epitope) [1]，在和主要組織相容性復(fù)合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子結(jié)合后，進(jìn)而呈現(xiàn)在APC細(xì)胞表面，能夠被T淋巴細(xì)胞識別，這是免疫學(xué) 通過實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得出的結(jié)論?，F(xiàn)在知道，一個已知表位肽的免疫原性取決于三個因素：
[0005] 第一、適當(dāng)表位肽的產(chǎn)生；
[0006] 第二，和表位肽結(jié)合的主要組織相容性復(fù)合物分子的呈現(xiàn)；
[0007] 第三，識別表位肽與主要組織相容性復(fù)合物形成的結(jié)合物的Τ細(xì)胞的呈現(xiàn)。
[0008] 其中，任何一個環(huán)節(jié)的缺少都將導(dǎo)致免疫應(yīng)答缺失。
[0009] 用小鼠進(jìn)行的試驗(yàn)表明，缺乏適當(dāng)?shù)谋砦浑呐c主要組織相容性復(fù)合物形成的結(jié)合 物分子是最常導(dǎo)致動物體免疫響應(yīng)缺失的原因。主要組織相容性復(fù)合物具有高度的多形態(tài) 性，已知的表位肽僅通過一個或者幾個等位基因（Alleles)就可結(jié)合至主要組織相容性復(fù) 合物，而不是全部表位肽片段。另外，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于抗原處理不適當(dāng)，或者T細(xì)胞耐 受性空缺,也會導(dǎo)致免疫響應(yīng)的缺失。
[0010] 有實(shí)驗(yàn)表明，破傷風(fēng)毒素的表位肽QYIKANSKFIGITEL (稱為P2)，可和大量不同的 主要組織相容性復(fù)合物ClassII結(jié)合，顯示其能夠被T細(xì)胞識別，具有萬能免疫原性的特 性，被稱之萬能表位肽。
[〇〇11] 萬能免疫原性表位肽具有和多個人類主要組織相容性抗原復(fù)合物ClassII分子 的同型和異型體結(jié)合。這種萬能表位肽和人類主要組織相容性抗原復(fù)合物ClassII分子隨 機(jī)的結(jié)合可用于開發(fā)合成疫苗，因?yàn)槠淠軌蚣せ钊巳褐械拇蟛糠謧€體的獲得性免疫系統(tǒng)的 應(yīng)答。
[0012] 研究表明，P2表位肽由破傷風(fēng)毒素的830 - 844氨基酸序列組成 (QYIKANSKFIGITEL)。在含有該表位肽的蛋白進(jìn)入機(jī)體后，蛋白將被攝入至APC細(xì)胞內(nèi)，被 消化降解。但是，這些表位肽將保存完整，在和主要組織相容性復(fù)合物結(jié)合后，被呈現(xiàn)在APC 細(xì)胞表面，并被T細(xì)胞識別，這表明萬能表位肽以相同的方式和多種DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工后抗原的雜性受體，其功能是在胸腺中的免疫耐受誘導(dǎo)和周邊免 疫響應(yīng)外來抗原的過程中，來呈現(xiàn)其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必須在呈現(xiàn)大量的表 位肽（容許更好的抗原識別，但更多的消耗T細(xì)胞儲備），和少許表位肽（大量的T細(xì)胞儲 備，但是少許有效地呈現(xiàn)外來抗原）中達(dá)到平衡。也就是說，如果抗原中含有在APC細(xì)胞處 理后能夠保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC結(jié)合后，就能夠刺激一定量的 T細(xì)胞，來建立免疫記憶效應(yīng)，而這一過程不會消耗過量的T細(xì)胞，以避免消耗大量的T細(xì) 胞，造成免疫耐受。含有這種表位肽的抗原具有更強(qiáng)的免疫原性，這也就解釋了為什么破傷 風(fēng)類毒素具有很強(qiáng)的免疫原性的原因。
[0014] 現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的大部分T細(xì)胞的刺激表位肽對于不同MHCClassII單體（haplotype)作 用有限，不同動物保存和呈現(xiàn)不同的抗原多肽區(qū)域（印Hopes)來刺激其T細(xì)胞。這種T細(xì) 胞刺激活性的基因限制阻礙了以合成方法來開發(fā)疫苗，而這種方法對于基因上不同的人群 的應(yīng)用，應(yīng)該是非常有效的方法。那些被發(fā)現(xiàn)具有刺激多重小鼠個體和/或與大多數(shù)人體 MHCClassII分子相關(guān)聯(lián)的T細(xì)胞刺激表位肽，提供了一個設(shè)計萬能活化T細(xì)胞的有效途徑。 在普通的蛋白抗原中加入萬能表位肽（也稱為萬能T細(xì)胞抗原簇）P2,能夠被大多數(shù)動物的 MHCClassII分子識別。這種T細(xì)胞抗原簇能夠用于直接誘導(dǎo)T細(xì)胞，或提供幫助B細(xì)胞生 產(chǎn)針對于弱免疫原的抗體，增強(qiáng)機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答的效應(yīng)。
[0015] 致病性細(xì)菌通常能夠表達(dá)高分子量，包裹在細(xì)菌表面的是莢膜多糖，簡稱多糖。對 于成人來說，莢膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制備疫苗；但是，對于小兒，即2 歲以下的嬰幼兒，莢膜多糖被認(rèn)為是非依賴于T細(xì)胞抗原。實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)用作為抗原時，莢 膜多糖可誘導(dǎo)野株或者T細(xì)胞缺失小鼠生產(chǎn)多糖特異性IgM抗體的響應(yīng)；但是，并不誘導(dǎo) IgM抗體向IgG抗體的轉(zhuǎn)化。人體實(shí)驗(yàn)也顯示，作為疫苗，多糖可以誘導(dǎo)成人生產(chǎn)保護(hù)性抗 體，但無法誘導(dǎo)嬰幼兒的免疫應(yīng)答；也就是說，在小兒重復(fù)免疫莢膜多糖抗原后，無第二次 抗體增強(qiáng)響應(yīng)，也無法誘導(dǎo)持續(xù)的T細(xì)胞記憶。
[0016] 現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多糖蛋白結(jié)合疫苗和純多糖疫苗比較的優(yōu)勢在于，前者能 夠誘導(dǎo)免疫響應(yīng)。當(dāng)非依賴T細(xì)胞的莢膜多糖共價鍵地連接至載體蛋白而形成的多糖蛋白 結(jié)合物，在免疫了哺乳動物后，可誘導(dǎo)T細(xì)胞來幫助B細(xì)胞產(chǎn)生針對于結(jié)合物中的多糖部分 的IgG抗體。因此，多糖蛋白結(jié)合物誘導(dǎo)多糖特異性抗體IgM轉(zhuǎn)化為IgG，記憶B細(xì)胞的分 化，以及長期存在的T細(xì)胞記憶。
[0017] 流行性腦膜炎是細(xì)菌性腦脊液炎中唯一能夠造成流行的疾病，可引起相當(dāng)高的 病死率和致殘率。流腦從病原體的發(fā)現(xiàn)至今已超過100年，呈世界范圍發(fā)布，全世界每年 流腦病例可達(dá)30萬到35萬，是世界范圍的一個嚴(yán)重公共健康問題。流腦由腦膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis,Men)引起。據(jù)流行性腦膜炎球菌莢膜多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，已確定 13個血清群，其中A、B、C、W135、和Y群引起約95%的病例。
[0018] A、C、W135、和Y群的莢膜多糖是良好的免疫原，但多糖疫苗對高發(fā)人群一2歲以下 兒童幾乎不起作用，這多是由于莢膜多糖是非T細(xì)胞依賴性抗原。解決此問題的有效方法 是制備結(jié)合疫苗，即將多糖和蛋白載體進(jìn)行結(jié)合，使非T細(xì)胞依賴性抗原轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴 性抗原。這種方法可以改變莢膜多糖的抗原性質(zhì)，誘導(dǎo)出免疫記憶。
[0019] 目前臨床上使用的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗是由賽諾菲生產(chǎn)，該 產(chǎn)品是將4種流行性腦膜炎球菌群，包括A、C、W135和Y分別以共價鍵連接至破傷風(fēng)類毒素 蛋白載體上，然后將這4種單價結(jié)合物混合配制而成。4價流行性腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗 的臨床應(yīng)用取得了成效，但是，有些群的免疫原性仍然較弱，需要開發(fā)出免疫原性更強(qiáng)的產(chǎn) 品來更新。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方法， 結(jié)合物中的4種流行性腦膜炎球菌多糖與蛋白載體之間是通過共價鍵連接，蛋白載體是通 過基因重組構(gòu)建的大腸桿菌工程菌生產(chǎn)的含有萬能表位肽QYIKANSKFIGITEL (簡稱P2)的 白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱P2CRM197A)，4價流行性腦膜炎球菌-P2CRM197A結(jié) 合物與不帶萬能表位肽P2的蛋白載體合成的4價流行性腦膜炎球菌多糖-CRM197A結(jié)合物 比較，該結(jié)合物的流腦多糖抗體滴度提高了 3 - 5倍。
[0021] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0022] -種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方法，包括如下步 驟：
[0023] 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 QYIKANSKFIGITEL (簡稱P2)，通過基因重組工程菌來生產(chǎn)含有P2的CRM197A蛋白載體（簡 稱 P2CRM197A);
[0024] 步驟二：將4種不同群的流行性腦膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通過共價 鍵分別與P2CRM197A蛋白載體連接形成4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P2CRM197A結(jié)合 物；
[0025] 步驟三：將步驟二獲得的4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P2CRM197A結(jié)合物進(jìn) 行混合得到免疫原性增強(qiáng)的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物。
[0026] 進(jìn)一步，在所述P2CRM197A中含有X個P2，l彡X彡3。
[0027] 進(jìn)一步，在所述P2CRM197A蛋白載體中，P2連結(jié)在CRM197A蛋白的N -末端或C -末端，或者同時連接在N -末端和C -末端。
[0028] 進(jìn)一步，所述P2與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基酸序列進(jìn)行連接。
[0029] 進(jìn)一步，所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構(gòu)建的大腸桿菌。
[〇〇3〇] 進(jìn)一步，所述流行性腦膜炎球菌多糖是通過分別培養(yǎng)4個不同群的流行性腦膜炎 球菌獲得的莢膜多糖。 【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面舉例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方法，但不局限于以下實(shí)例。
[0032] 本發(fā)明用基因重組的方法，在大腸桿菌工程菌表達(dá)系統(tǒng)中，對CRM197A蛋白載體 和帶有萬能表位肽P2的CRM197A蛋白載體進(jìn)行表達(dá)并純化；然后，將4群流行性腦膜炎球 菌莢膜多糖（簡稱Men)共價鍵地連接至P2CRM197A蛋白載體，制備出Men - P2CRM197A結(jié) 合物；將四種單價多糖蛋白結(jié)合物混合配制成疫苗后，免疫小白鼠，采血獲得免疫血清；用 ELISA方法檢測小白鼠血清中的多糖特異性抗體滴度，以評估多糖蛋白結(jié)合物的免疫原性。
[0033] 步驟一：蛋白載體和流行性腦膜炎球菌莢膜多糖的制備
[〇〇34] 為說明本發(fā)明的有效性，制備了兩種載體蛋白，即含有P2的蛋白載體P2CRM197A 和不含P2的蛋白載體CRM197A。其中，CRM197A蛋白載體是用于合成對照用4價流行性腦 膜炎球菌多糖-CRM197A結(jié)合物樣品。
[0035] 一、CRM197A蛋白載體和P2CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設(shè)計
[0036] 1、CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設(shè)計
[0037] 白喉毒素是由帶有白喉毒素基因的β噬菌體在白喉?xiàng)U菌內(nèi)表達(dá)，在細(xì)菌胞漿中 存在形式為多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62, 000道爾頓。其氨基酸序列如下：
[0038] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSS LSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAG ANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVD IGFAAYNFVES11NLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVED S11RTGFQGESGHDIKITAENTPLPI AGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISS DSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0039] 當(dāng)分泌至細(xì)菌體外前，多肽N -末端的25個引導(dǎo)氨基酸序列被切除掉，變成了由 535個氨基酸組成、分子量為58kD的單鏈多肽而分泌至細(xì)菌體外，其氨基酸序列如下 ：
[0040] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEH GPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKT TAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNR PAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNG RKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFF EIKS
[0041] 分泌至細(xì)菌體外的白喉毒素被酶切為A鏈和B鏈，其間由一個二硫鍵連接而形成 一個蛋白分子，這兩個多肽鏈具有不同的功能。A鏈為白喉毒素蛋白分子的N-末端片段， 分子量為21kD，由193個氨基酸組成，是白喉毒素的毒性功能部分。它是通過在真核生物 細(xì)胞漿內(nèi)，將二磷酸三腺苷核糖（ADP - Ribosyl)的異檸檬酸脫氫酶（NAD+)部分轉(zhuǎn)移至延 伸因子2(ElongationFactor - 2, EF - 2)上，從而抑制細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞 生長，造成細(xì)胞傷亡。B鏈為白喉毒素蛋白分子的C -末端片段，分子量大約為37kD，由342 個氨基酸組成。B鏈的功能是識別敏感細(xì)胞表面的特異性受體，將白喉毒素吸附在敏感細(xì)胞 上，幫助A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
[0042] 白喉毒素的A鏈具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：
[0043] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0044] 研究發(fā)現(xiàn)[3]，由于β噬菌體上的毒素基因 tox的突變，對于噬菌體的復(fù)制沒 有影響；但是，合成出來的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突變體 (CrossReactingMaterial，CRM)，但是白喉毒素突變體的血清學(xué)免疫原性仍然和毒素相關(guān) 聯(lián)。比如，白喉毒素突變體CRM197,無白喉毒素的毒性，從氨基酸序列分析來看是由于A鏈 中的第52位氨基酸，由甘氨酸（Gly)突變成谷氨酸（Glu)，其氨基酸序列如下：
[0045] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0046] 試驗(yàn)研究表明，與其它現(xiàn)在市場上用于肺炎球菌結(jié)合疫苗合成的蛋白載體比較， 白喉毒素變異體CRM197蛋白A鏈多肽具備以下一些優(yōu)勢，如其免疫原性和白喉毒素及白喉 內(nèi)毒素相關(guān)聯(lián)，分子量小，水溶性高，易于生產(chǎn)和進(jìn)行大分子合成反應(yīng)。長期的白喉類毒素 疫苗的臨床使用，已經(jīng)證明其安全性和有效性。
[0047] 2、含有P2萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設(shè)計
[0048] 將萬能表位肽P2連接至CRM197A蛋白載體上，構(gòu)建出一種新的用于合成多糖蛋白 質(zhì)結(jié)合物的蛋白載體。所用的萬能表位肽P2可連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或C -末端；也可將兩個不同的萬能表位肽分別連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或C -末端； 另一種方式是將兩個萬能表位肽自身連接，然后再連接至CRM197A蛋白載體N -末端或者 C -末端；還有一種方式是將一個萬能表位肽連接至C -末端或者N -末端，兩個自身連接的 萬能表位肽連接至另一端。
[0049] 2 - 1、含有萬能表位肽P2的P2CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設(shè)計
[0050] 2 - 1 - 1、P2 - N -末端CRM197A蛋白載體（稱為P2 - CRM197A)氨基酸序列的設(shè)計
[0051] 通過將P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白載體的N -末端，形 成一個新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0052] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD W
[0053] KEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPL
[0054] MEQVGT
[0055] EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGN RVRR
[0056] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端間插入了 GSGSG片段來進(jìn)行連 接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為P2 - CRM197A蛋白載體。
[0057] 2 - 1 - 2、CRM197AC -末端-P2蛋白載體（稱為CRM197A - P2)氨基酸序列的設(shè)計
[0058] 通過將P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形 成另一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0059] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSS SVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0060] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入了 GSGSG片段來進(jìn)行連 接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為CRM197A - P2蛋白載體。
[0061] 2 - 1 - 3、P2 - N -末端 CRM197AC -末端-P2 蛋白載體（稱為 P2 - CRM197A - P2) 氨基酸序列的設(shè)計
[0062] 通過將兩個P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分別加入至CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0063] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD WKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR FGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITEL
[0064] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端之間插入了 GSGSG片 段來進(jìn)行連接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為P2 - CRM197A - P2蛋白載體。
[0065] 2 - 1 - 4、P2P2 - N -末端 CRM197A 蛋白載體（稱為 P2 - P2 - CRM197A)氨基酸序列 的設(shè)計
[0066] 通過將兩個P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身連接，然后再加入至CRM197A蛋 白載體的N -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0067] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD SIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMA QACAGNRVRR
[0068] 在兩個自身連接的P2氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的N -末端間插 入了 GSGSG片段來進(jìn)行連接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為P2 - P2 - CRM197A蛋白載體。
[0069] 2 - 1 - 5、CRM197AC -末端-P2P2 蛋白載體（稱為 CRM197A - P2 - P2)氨基酸序列 的設(shè)計
[0070] 通過將兩個P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身連接，然后再加入至CRM197A蛋 白載體的C -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0071] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKA NSKFIGITEL
[0072] 在兩個自身連接P2氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入 了 GSGSG片段來進(jìn)行連接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為CRM197A - P2 - P2蛋白載體。
[0073] 2 -1 -6、P2P2 -N -末端 CRM197AC -末端-P2 蛋白載體（稱為 P2 -P2 -CRM197A -P2) 氨基酸序列的設(shè)計
[0074] 通過將兩個P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身連接，然后再加入至CRM197A蛋 白載體的N -末端；另外，將一個P2加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成另一種新的 蛋白，其氨基酸序列如下：
[0075] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD SIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMA QACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0076] 在兩個自身連接P2氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入 了 GSGSG片段來進(jìn)行連接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為P2P2CRM197AP2蛋白載體。
[0077] 2 -1 -7、P2 -N -末端 CRM197AC -末端-P2P2 蛋白載體（稱為 P2 -CRM197A -P2 -P2) 氨基酸序列的設(shè)計
[0078] 通過將一個P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL連接至CRM197A蛋白載體的N -末 端；另外，將兩個P2進(jìn)行自身連接，然后再加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成另一 種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0079] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD WKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR FGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0080] 在兩個自身連接P2氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入 了 GSGSG片段來進(jìn)行連接，以此方法構(gòu)建的蛋白稱為P2 - CRM197A - P2 - P2蛋白載體。
[0081] 二、CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0082] 1、CRM197A蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0083] 從GenBank獲取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，確定CRM197蛋白的A 鏈片段，CRM197的氨基酸1 - 193為CRM197的A鏈片段。以此為依據(jù)，對該片段的氨基酸 的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，以便在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)。采用自制的表達(dá)質(zhì)粒，用Ndel 酶識別質(zhì)粒位點(diǎn)CATATG，BamHI酶識別位點(diǎn)GGATCC。經(jīng)過CRM197A的基因序列進(jìn)行分析， 在序列內(nèi)，無 Ndel及BamHI酶切位點(diǎn)。CRM197A蛋白基因合成序列如下：
[0084] CATATG
[0085] GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0086] CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0087] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0088] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0089] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0090] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0091] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0092] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0093] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0094] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA
[0095] GGATCC
[0096] 將空白質(zhì)粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR產(chǎn)物中，分別加入Ndel酶和BamHI 酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進(jìn)行連接，完成后純化表達(dá)質(zhì)粒， 并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進(jìn)行鑒定。用BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至細(xì)胞 內(nèi)，篩選克隆。獲得陽性表達(dá)工程菌后，建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存于_20°C 以下冰箱中。
[0097] 2、含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0098] 2 - 1、P2 - CRM197A蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0099] 采用自制的空白表達(dá)質(zhì)粒，用Ndel酶識別質(zhì)粒位點(diǎn)CATATG，BamHI酶識別位點(diǎn) GGATCC。經(jīng)過P2CRM197A蛋白載體基因序列進(jìn)行分析，在序列內(nèi)，無 Ndel及BamHI酶切位 點(diǎn)。P2 - CRM197A基因合成全序列如下：
[0100] CATATG
[0101] CAATACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTGGGCTCGGGCTCTGGC
[0102] GTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0103] ATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0104] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0105] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0106] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0107] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0108] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0109] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0110] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0111] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA
[0112] GGATCC
[0113] 將空白質(zhì)粒和合成的P2CRM197A蛋白基因的PCR產(chǎn)物中，分別加入NdeI酶和 BamHI酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進(jìn)行連接，完成后純化表達(dá) 質(zhì)粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進(jìn)行鑒定。用BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 至細(xì)胞內(nèi)，篩選克隆，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進(jìn)行鑒定。獲得陽性表達(dá)工程菌后，建 立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存于-20°C以下冰箱中。
[0114] 2 - 2、P2 - CRM197A - P2蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0115] 采用自制的表達(dá)質(zhì)粒，用Ndel酶識別質(zhì)粒位點(diǎn)CATATG，BamHI酶識別位點(diǎn)GGATCC。 經(jīng)過P2 - CRM197A - P2蛋白基因序列進(jìn)行分析，在序列內(nèi)，無 Ndel及BamHI酶切位點(diǎn)。 P2CRM197AP2基因合成全序列如下：
[0116] CATATG
[0117] CAATACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTGGGCTCGGGCTCTGGC
[0118] GTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0119] ATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0120] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0121] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0122] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0123] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0124] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0125] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0126] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0127] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAAGGCTCGGGCTCTGGCCAA
[0128] TACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTG
[0129] GGATCC
[0130] 將空白質(zhì)粒和合成的P2 - CRM197A - P2基因的PCR產(chǎn)物中，分別加入Ndel酶和 BamHI酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進(jìn)行連接，完成后純化表達(dá) 質(zhì)粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進(jìn)行鑒定。用BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 至細(xì)胞內(nèi)，篩選克隆，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進(jìn)行鑒定。獲得陽性表達(dá)工程菌后，建 立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存于-20°C以下冰箱中。
[0131] 2 - 3、CRM197A - P2、P2 - P2 - CRM197A、CRM197A - P2 - P2、P2 - P2 - CRM197A - P2、 以及P2 - CRM197A - P2 - P2蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0132] 方法和上節(jié)"2 - 1、P2CRM197A蛋白載體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建"相同。
[0133] 三、含有萬能表位肽P2CRM197A蛋白載體和CRM197A蛋白載體的制備
[0134] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載體的特性 相似；因此，這些蛋白載體的純化方法相似，以下以含有P2萬能表位肽的CRM197A蛋白載體 為例說明方法。
[0135] 1、表達(dá)含有萬能表位肽P2CRM197A蛋白載體工程菌的制備
[0136] 用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法將各個表達(dá)蛋白載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行 表達(dá)檢定。篩選出蛋白表達(dá)量高，并且通過用抗血清檢定合格的克隆，建立主種子庫和工作 種子庫。
[0137] 2、含有萬能表位肽P2CRM197A蛋白載體表達(dá)工程菌的發(fā)酵
[0138] 從大腸桿菌工程菌工作種子庫低溫冰箱中，取出一支含有萬能表位肽P2CRM197A 蛋白載體的工作種子管，在室溫下解凍；將種子管中的菌液無菌轉(zhuǎn)移至50毫升的培養(yǎng)基 中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養(yǎng)至0D_ = 1. 0左右；將菌液無菌接種至1升的培 養(yǎng)基中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養(yǎng)至0D_ = 1. 0左右；接種種子液至50升發(fā) 酵罐中的20升培養(yǎng)基中，在37°C下，240rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)0D6(?至7 -8時，加入IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白在細(xì)菌中合成；發(fā)酵至14小時后，停止發(fā)酵，離心，收集菌體待用。
[0139] 3、含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體的純化
[0140] 由于構(gòu)建含有不同萬能表位肽的蛋白載體都是以CRM197A為主體，實(shí)驗(yàn)表明，盡 管加入了萬能表位肽，但對蛋白純化的參數(shù)影響不大，只需要在純化CRM197A蛋白載體的 工藝參數(shù)上進(jìn)行一些修飾，就可建立起其他含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載體的純化方 法。
[0141] 稱重50g濕菌體于2升離心杯中，加入300mllxPBSpH7. 0的緩沖液混懸菌體，在磁 力攪拌器上攪拌混勻30min ;在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清，收集菌體；重復(fù)該步驟 兩次；加入300mllxPBSpH7. 0至菌體離心管，在均質(zhì)機(jī)上進(jìn)行破碎；在4°C下，lOOOOrpm，離 心20min，收集沉淀，棄上清液；加入300mll XPBSpH7. 0緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌30min ; 在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清液，收集包涵體；加入900ml變性緩沖液至洗漆后的 包涵體，在25°C下，lOOOOrpm離心30min，收集上清液，棄沉淀；將離心上清液轉(zhuǎn)移至6 -8KD 透析袋中，封閉透析袋；置透析袋于10升復(fù)性緩沖液1中，室溫下，在磁力攪拌器上攪拌透 析過夜；次日將透析袋轉(zhuǎn)入10升復(fù)性緩沖液2中，室溫攪拌透析8 - 10小時；將透析袋轉(zhuǎn) 入10升復(fù)性緩沖液3中，室溫攪拌透析過夜；次日將透析袋轉(zhuǎn)入10升復(fù)性緩沖液4中，室 溫攪拌透析8 -10小時；將透析袋轉(zhuǎn)入10升復(fù)性緩沖液5中，室溫攪拌透析過夜；次日將透 析袋轉(zhuǎn)入2升儲備緩沖液中，室溫攪拌透析8 - 10小時；更換儲備緩沖液二次，室溫透析過 夜；取lml透析液，室溫12000rpm離心10min,收集上清，測蛋白質(zhì)濃度；將蛋白溶液上樣至 預(yù)先平衡的DEAE膠柱，用等梯度洗脫，并收集目的蛋白峰；然后上樣至Phenyl疏水柱進(jìn)一 步純化，收集洗脫峰；最后上樣SP膠柱，收集洗脫峰；將收集獲得的純化目的蛋白轉(zhuǎn)至透析 袋中，在0. 15M的氯化鈉中透析，完成后轉(zhuǎn)移至4°C下儲存待用。
[0142] 四、流行性腦膜炎球菌莢膜多糖的制備
[0143] 1、種子庫的建立
[0144] 由贈送獲得的流行性腦膜炎球菌A、C、Y、和W135群菌株作為原始種子株建立主種 子庫和工作種子。由于這4群腦膜炎球菌的培養(yǎng)特性相同，在這里同一敘述方法。
[0145] 取出原始種子的種子管，加入0. 5ml的流腦培養(yǎng)基將菌種混勻，取0. 25ml菌液接 種至l〇ml流腦培養(yǎng)液中。接種后的培養(yǎng)液管置于36°C ±1°C的培養(yǎng)搖床上，搖速120rpm， 培養(yǎng)12 - 20小時。待0D_至1. 0時，用接種環(huán)將菌液接種至流腦瓊脂培養(yǎng)基平皿上，置于 36°C ±1°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 - 20小時。用接種環(huán)將接種的流腦瓊脂培養(yǎng)平皿上的1至 數(shù)個菌落接種于l〇ml的流腦培養(yǎng)液中，置于36°C ±1°C，在培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)12小時，搖速 150 -200rpm。培養(yǎng)液中細(xì)菌0D_長到1. 0,取出5ml菌液接種到200ml的新鮮流腦培養(yǎng)液 中，置于36°C ±1°C的培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)12小時左右，搖速150 -200rpm。0D6QQ至1.0時，將 細(xì)菌培養(yǎng)液以lml分裝于200個小試管中，離心（4000rpm，lOmin)，去除上清培養(yǎng)液，然后 加入0. 5ml的新鮮的流腦培養(yǎng)液和0. 5ml的無菌脫脂牛奶，混勻，在乙醇干冰上快速冷凍。 真空凍干，編號，作為主種子批保存于4°C冰箱內(nèi)。取出主種子批建立，按照主種子建立方 法，將細(xì)菌培養(yǎng)液接種到另一個200ml的新鮮流腦培養(yǎng)液中，置于36°C ±1°C的培養(yǎng)搖床上 培養(yǎng)12小時，內(nèi)培養(yǎng)12小時左右，搖速150 - 200rpm。待0D6QQ至1. 0時，將細(xì)菌培養(yǎng)液以 lml分裝于200個小試管中，離心（4000rpm，lOmin)，去除上清培養(yǎng)液，然后加入0. 6ml的新 鮮流腦培養(yǎng)液和〇. 4ml的40%甘油溶液，混勻。速凍于干冰上，作為工作種子保存于-70°C 低溫冰箱中。
[0146] 2、細(xì)菌發(fā)酵
[0147] 將流行性腦膜炎球菌工作種子接種到平皿培養(yǎng)基上，在36. 5°C培養(yǎng)箱過夜。取一 個流腦菌斑，接種到5毫升的新鮮流腦培養(yǎng)液中，在36. 5°C和300rpm細(xì)菌培養(yǎng)搖床培養(yǎng)。 當(dāng)接種的培養(yǎng)液達(dá)到了指數(shù)生長中期，0D為0. 6 -1. 0,將菌液轉(zhuǎn)接到250毫升培養(yǎng)瓶中，其 中有45毫升的新鮮流腦培養(yǎng)液，在36. 5°C和300rpm細(xì)菌培養(yǎng)搖床培養(yǎng)。當(dāng)接種的培養(yǎng)液 達(dá)到了指數(shù)生長中期，OD為0. 6 -1. 0,將菌液轉(zhuǎn)接到4升培養(yǎng)瓶中，其中有1升的新鮮流腦 培養(yǎng)液，在36. 5°C和300rpm細(xì)菌培養(yǎng)搖床培養(yǎng)。當(dāng)菌液達(dá)到了指數(shù)生長中期（約10 - 12 小時），OD為0.6 - 1.0,將菌液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，其中有20升的新鮮流腦培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)菌 達(dá)到指數(shù)生長中期時，加入新鮮流腦培養(yǎng)液和補(bǔ)充培養(yǎng)液，培養(yǎng)了 20小時停止發(fā)酵。
[0148] 3、多糖純化
[0149] 將流腦菌液離心沉淀的菌體，懸浮在2升的蒸餾水中，用磁力攪拌器混勻。加入 200ml的12% Deoxycholatesodium溶液入細(xì)菌懸浮液中，攪拌混勻30分鐘，然后轉(zhuǎn)入到 10°C ±3°C冷柜中攪拌8-24小時，保證菌體完全裂解、多糖釋放出來。用50%的醋酸調(diào) 節(jié)細(xì)菌裂解液的pH值到6.4-6.8,溫度為20°C ±5°C，停止攪拌，靜置12-24小時。以 10, OOOrpm離心1小時，收集上清液，丟棄沉淀物。用0. 05M的磷酸鹽pH7. 0透析多糖上清 液。加入等體積的〇. 2% HB溶液，用磁力攪拌器混勻30分鐘，然后，轉(zhuǎn)入到4°C冷柜中靜置 過夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉淀，丟棄上清液，加入100ml的0. 5M氯化鈉溶液溶 解沉淀；加入680ml無水乙醇，混勻，然后，轉(zhuǎn)入到4°C冷柜中靜置過夜。以10, OOOrpm離心 30min，收集上清液，丟棄沉淀，加入5. 2升無水乙醇，混勻，然后，轉(zhuǎn)入到4°C冷柜中靜置過 夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉淀，丟棄上清液，加入500ml的蒸饋水溶解沉淀，透析。 凍干。
[0150] 步驟二：四種流行性腦膜炎球菌多糖P2CRM197A結(jié)合物的制備
[0151] 本發(fā)明采用ADH法來合成流行性腦膜炎球菌多糖P2CRM197A結(jié)合物，該方法分兩 個步驟，即多糖的衍化和結(jié)合物合成。
[0152] 一、流行性腦膜炎球菌A群多糖-P2 -CRM197A結(jié)合物（稱為MenA -P2 -CRM197A) 的合成
[0153] 1、流行性腦膜炎球菌A群多糖衍化
[0154] 將20mg的MenA多糖用4ml純水溶解后，加入溴化氰進(jìn)行活化。向反應(yīng)液中加入 10ml的ADH溶液，最終濃度為0. 4M，在2?8°C混合反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液在0. 2mol/L氯化 鈉溶液中透析。將反應(yīng)液上樣G-50柱，收集外水體積峰。將結(jié)合物溶液至于透析袋中，用 純水透析，冷凍真空干燥，得到固體的衍化多糖。多糖衍生物應(yīng)保存在-20°C或以下。
[0155] 2、流行性腦膜炎球菌A群多糖-P2 - CRM197A結(jié)合物的合成
[0156] 稱取5mg衍化MenA多糖至反應(yīng)瓶中，加入0. 5ml的0. 15MNaCl至反應(yīng)瓶中，攪拌溶 解多糖，先在室溫下，然后轉(zhuǎn)至4°C下過夜，以保證多糖溶解完全，溶液中多糖濃度為20mg/ ml。用0. 45 μ m膜無菌過濾多糖溶液至反應(yīng)瓶，用0. lMNaOH或者0. 1MHC1調(diào)節(jié)pH值至5. 5。 加入相當(dāng)于5mg的P2CRM197A溶液至反應(yīng)瓶中，攪拌混勻。加入2. 9mg的EDC至培養(yǎng)瓶中。 在室溫下攪拌反應(yīng)4小時。轉(zhuǎn)移反應(yīng)混合液至透析袋（MWC06 - 8000)，用0. 15MNaCl溶液， 4°C下透析，換液三次。上樣SepharoseCL -4B純化，收集外水體積峰。根據(jù)分析結(jié)果，合并 結(jié)合物峰值管。無菌過濾，儲存在4°C下待用。
[0157] 3、其它單價流行性腦膜炎球菌多糖-P2 - CRM197A結(jié)合物的合成
[0158] 參照上節(jié)"流行性腦膜炎球菌A群多糖-P2 - CRM197A結(jié)合物的合成"方法 來合成其它三種結(jié)合物，包括流行性腦膜炎球菌C群多糖-P2 -CRM197A結(jié)合物（稱 為MenC-P2 -CRM197A)、流行性腦膜炎球菌W135群多糖-P2 -CRM197A結(jié)合物（稱為 MenW135 - P2 - CRM197A)、以及流行性腦膜炎球菌Y群多糖-P2 - CRM197A結(jié)合物（稱為 MenY - P2 - CRM197A)〇
[0159] 二、其它含有萬能表位肽P2的CRM197A蛋白載體的4種流行性腦膜炎球菌多糖 CRM197A結(jié)合物的合成
[0160] 參照"流行性腦膜炎球菌A群多糖-P2 - CRM197A結(jié)合物的合成"方法，用其它六 種含有萬能表位肽的蛋白載體，包括CRM197A - P2、P2 - CRM197A - P2、P2 - P2 - CRM197A、 CRM197A - P2 - P2、P2 - P2CRM197A - P2、P2 - CRM197A - P2 - P2、以及對照樣品合成用 蛋白載體 CRM197A，合成了其它結(jié)合物，即 MenA - CRM197A - P2、MenC - CRM197A - P2、 MenW135 -CRM197A -P2、MenY -CRM197A -P2 ;MenA -P2 -CRM197A -P2、MenC -P2 -CRM197A -P2、 MenW135 - P2 - CRM197A - P2、MenY - P2 - CRM197A - P2 ;MenA - P2 - P2 -CRM197A、 MenC - P2 - P2 - CRM197A、MenW135 - P2 - P2 - CRM197A、MenY - P2 - P2 - CRM197A ; MenA - CRM197A - P2 - P2、MenC - CRM197A - P2 - P2、MenW135 - CRM197A - P2 - P2、 MenY - CRM197A - P2 - P2 ;MenA - P2 - P2 - CRM197A - P2、MenC - P2 - P2 - CRM197A - P2、 MenW135 - P2 - P2 - CRM197A - P2、MenY - P2 - P2 - CRM197A - P2 ;MenA - P2 - CRM197A - P2 - P2、 MenC -P2 -CRM197A -P2 -P2、MenW135 -P2 -CRM197A -P2 -P2、MenY -P2 -CRM197A -P2 -P2。
[0161] 步驟三、4價流行性腦膜炎球菌多糖P2CRM197A結(jié)合物配制及免疫原性的評估
[0162] 一、4價流行性腦膜炎球菌多糖-P2 - CRM197A結(jié)合物的配制
[0163] 用 Millipore 的 Labscale 超濾系統(tǒng)將制備的 MenA - P2 - CRM197A、 MenC - P2 - CRM197A、MenW135 - P2 - CRM197A、以及 MenY - P2 - CRM197A 結(jié)合物溶液濃縮至 多糖濃度大約為1000 μ g/ml，然后用0. 85 %的NaCl溶液稀釋并混合至每個群多糖濃度為 100 μ g/ml的4價流行性腦膜炎球菌多糖-P2 -CRM197A結(jié)合物（稱為4Men -P2 -CRM197A)， 用0. 22μπι膜除菌過濾，加入無菌磷酸鋁佐劑，最終濃度為125mg/ml，置于2 -8°C冰箱中儲 存待用。
[0164] 按照以上方法分別配制其它4價流行性腦膜炎球菌多糖P2CRM197A結(jié)合物：
[0165] 4Men - CRM197A - P2、4Men - P2 - CRM197A - P2、4Men - P2 - P2 - CRM197A、 4Men - CRM197A - P2 - P2、4Men - P2 - P2 - CRM197A - P2、以及 4Men - P2 - CRM197A - P2 - P2 結(jié)合物。
[0166] 二、免疫動物
[0167] 取5 - 6周的KM57系小鼠240只，每支小鼠免疫注射制備的7種Men - P2CRM197A 結(jié)合疫苗，注射容量為〇. lml/支小鼠/次。每種結(jié)合疫苗設(shè)定為三組，即免疫注射一針、二 針和三針。
[0168] 采集小鼠血液至離心管，在室溫下靜置2小時，在lOOOOrpm條件下離心10分鐘， 用移液槍小心吸取離心上清血清，儲存于4°C冰箱中，待檢。
[0169] 三、ELISA法檢測小鼠血清中流腦多糖抗體IgG滴度及結(jié)合物免疫原性的評估
[0170] 配制特定血清群流腦莢膜多糖儲備液lmg/ml (1XPBS溶液中），存儲于冰箱。用包 被緩沖液稀釋至4 μ g/ml，加100 μ 1包被溶液到每一個孔中來包被ELISA板，在室溫下孵育 過夜。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1封閉緩沖液，在室溫下孵育2小時，用洗板緩沖液 洗4次，可在4°C下保存一周。
[0171] 將小鼠免疫結(jié)合疫苗及對照樣品獲得的待測血清，以1:10稀釋成工作樣品血清， 稀釋適當(dāng)倍數(shù)，加入到ELISA板第一排孔內(nèi)，總體積200 μ 1，從第一排開始向下進(jìn)行二倍系 列稀釋，在室溫下孵育2小時。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠 抗體（1:2000稀釋），在室溫下孵育4小時。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1磷酸-4 -硝基苯酯二鈉鹽底物溶液，在405nm讀盤。
[0172] 下表為小鼠結(jié)合物免疫血清中多糖IgG抗體滴度結(jié)果表：
[0173]
【權(quán)利要求】
1. 一種增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方法，其特征在于： 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 QYIKANSKFIGITEL (簡稱P2)，通過基因重組工程菌來生產(chǎn)含有P2的CRM197A蛋白載體（簡 稱 P2CRM197A); 步驟二：將4種不同群的流行性腦膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通過共價鍵分 別與P2CRM197A蛋白載體連接形成4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P2CRM197A結(jié)合物； 步驟三：將步驟二獲得的4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P2CRM197A結(jié)合物進(jìn)行混 合得到免疫原性增強(qiáng)的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方 法，其特征在于：在所述P2CRM197A載體蛋白中含有X個P2，l < 3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方 法，其特征在于：在所述P2CRM197A蛋白載體中，P2連結(jié)在CRM197A蛋白的N -末端或C -末端，或者同時連接在N -末端和C -末端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性 的方法，其特征在于：所述P2與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基酸序列進(jìn)行連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方 法，其特征在于：所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構(gòu)建的大腸桿菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物免疫原性的方 法，其特征在于：所述流行性腦膜炎球菌多糖是通過分別培養(yǎng)4個不同群的流行性腦膜炎 球菌，即A、C、W135、和Y群，獲得的莢膜多糖。
【文檔編號】A61P31/04GK104096227SQ201410199312
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月11日
【發(fā)明者】李建平 申請人:江蘇康泰生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司