一種全燕麥固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)益生菌活菌粉劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，公開了一種利用多種益生菌直投劑混菌固態(tài)發(fā)酵全燕麥獲得三聯(lián)益生菌活菌粉劑及其制備方法，所述三聯(lián)益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9，植物乳桿菌P-8和干酪乳桿菌Zhang，以燕麥全粉為發(fā)酵基質(zhì)制備而得,具有優(yōu)異的抗胃腸道消化液耐受能力；改善人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的能力；調(diào)節(jié)血脂代謝；提高腸道抗致病菌感染能力；有效預(yù)防緩解腹瀉、便秘、腹痛、腹脹等腸易激綜合癥。
【專利說明】一種全燕麥固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)益生菌活菌粉劑及制備方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，是一種利用多種益生菌直投劑混菌固態(tài)發(fā)酵全燕麥獲得二聯(lián)益生菌活菌粉劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]益生菌是一類通過改善腸道微生物從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響的微生物。它可通過參與腸道微生物平衡來抑制病原菌生長，避免了長期使用抗生素產(chǎn)生的耐藥性和二重感染，因此，益生菌產(chǎn)品近年來備受人們的關(guān)注。[0003]目前，雖然市場(chǎng)上的益生菌產(chǎn)品極其豐富，但是開發(fā)的產(chǎn)品以發(fā)酵乳制品為主，其中含有高的脂肪和膽固醇，還可能引發(fā)乳糖不耐癥。所以，非乳益生菌產(chǎn)品成為發(fā)展的趨勢(shì)。而居于谷物之首的燕麥，具有很高的營養(yǎng)和保健價(jià)值，其含有大量的膳食纖維，而膳食纖維的主要成分之一 β_葡聚糖在燕麥麩皮中含量高，其具有降低血液中膽固醇的含量以及餐后血糖水平的作用。同時(shí)，腸道微生物發(fā)酵β -葡聚糖(作為一種益生元)后會(huì)形成短鏈脂肪酸，從而保護(hù)結(jié)腸膜。并且燕麥還具有含量相對(duì)較高的蛋白質(zhì)，必需氨基酸組成合理，賴氨酸含量高于小麥粉和稻米，有利于飲食中其他氨基酸的吸收，色氨酸含量比較豐富。所以，以燕麥為基質(zhì)的發(fā)酵食品越來越受到人們的關(guān)注。
[0004]然而，開發(fā)的燕麥發(fā)酵產(chǎn)品中普遍使用各種糖類以及添加劑，其高脂高糖并不適宜長期食用，尤其針對(duì)具有高血脂、高血糖的消費(fèi)人群。以全燕麥(包含燕麥麩皮)為唯一基質(zhì)的益生菌產(chǎn)品具有很好的發(fā)展前景，而通過三株益生菌直投劑進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥全粉(包含燕麥麩皮)生產(chǎn)三聯(lián)益生菌活菌粉劑產(chǎn)品的報(bào)道國內(nèi)外還未見，且在混菌固態(tài)發(fā)酵中，菌株間的互利共棲協(xié)同作用，能提高產(chǎn)率和菌體濃度；多菌株的產(chǎn)酶、產(chǎn)酸和產(chǎn)營養(yǎng)物質(zhì)能力、對(duì)基質(zhì)的分解能力等要顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵?；炀虘B(tài)發(fā)酵還具有獲得純種發(fā)酵無法獲得的產(chǎn)物，生長速度快，對(duì)底物利用率高，可多級(jí)轉(zhuǎn)化，發(fā)酵后的微生物群體穩(wěn)定，省工節(jié)能，簡(jiǎn)化工藝及發(fā)酵設(shè)備和易控制等諸多優(yōu)點(diǎn)，且不易染菌。
[0005]植物乳桿菌P-8 (L.P lantarum P-8)是2005年分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發(fā)酵酸牛乳樣品中的I株具有優(yōu)良益生特性的植物乳桿菌。具有優(yōu)異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠在人體腸道中定植及繁殖，改善人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的能力；調(diào)節(jié)血脂代謝，對(duì)高血脂癥肝臟具有保護(hù)修復(fù)作用，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力；對(duì)機(jī)體免疫具有調(diào)節(jié)作用。
[0006]乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)是于2005年從健康蒙古族兒童腸道中分離篩選出的I株性能卓越的益生菌。具有優(yōu)異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠有效拮抗腸道致病菌，提高腸道抗致病菌感染能力；有效預(yù)防緩解腹瀉、便秘、腹痛、腹脹等腸易激綜合癥。
[0007]干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)是于2001年從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗草原上自然發(fā)酵酸馬奶樣品中分離篩選出的I株性能卓越的益生菌。具有優(yōu)異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠在人體腸道中定植及繁殖，改善人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的能力；能夠有效拮抗腸道致病菌，提高腸道抗致病菌感染能力；調(diào)節(jié)血脂代謝，對(duì)高血脂癥肝臟具有保護(hù)修復(fù)作用，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力；對(duì)機(jī)體免疫具有調(diào)節(jié)作用；有效預(yù)防腫瘤生長和II型糖尿病的發(fā)生。
[0008]其中，植物乳桿菌P-8 (L.P lantarum P-8)與干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)均為兼性厭氧菌，而乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)為嚴(yán)格厭氧菌。利用其直投劑混菌發(fā)酵接種工藝為接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)與干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)一定時(shí)間后，再接種乳雙歧桿菌V9(B.1actis V9),混菌發(fā)酵固態(tài)燕麥全粉。其機(jī)理在于，發(fā)酵前期植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)與干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)的生長、增殖及新陳代謝能夠?yàn)槿殡p歧桿菌V9 (B.1actis V9)的增殖提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及必要的厭氧環(huán)境，更利于乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)生長的啟動(dòng)。再者，植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)與干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)對(duì)膳食纖維的利用相對(duì)較少,保證乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)對(duì)膳食纖維的利用，進(jìn)而產(chǎn)生多樣化的生物活性物質(zhì)，其機(jī)理類似于膳食纖維作為益生元進(jìn)入人體后的作用機(jī)理。
[0009]具體涉及利用植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)、干酪乳桿菌Zhang (L.caseiZhang)、乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，混菌固態(tài)發(fā)酵全燕麥制成三聯(lián)活菌粉劑及其制備方法。三株菌中干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)和乳雙歧桿菌V9 (B.1actisV9)，于2011年11月18日，而植物乳桿菌P-8(L.plantarum P-8)于2012年6月28日，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心(國家專利局指定專利微生物保藏中心)保藏，干酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9和植物乳桿菌P_8的保藏號(hào)分別為CGMCCN0.5469,CGMCC N0.5470和CGMCC N0.6312。保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0010]名稱為 一種干酪乳桿菌及其在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?200710118485.4。發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌及其在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用。所述干酪乳桿菌(Lcasei Zhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；改菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌株保藏中心，保藏號(hào):CGMCC N0.1697。本發(fā)明的干酪乳桿菌(L.caseiZhang)能實(shí)現(xiàn)在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用，特別是作為發(fā)酵劑在乳制品、保健食品、微生物飼料以及動(dòng)物保健制品中的應(yīng)用；本發(fā)明的干酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，是一種優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基的方法，能得到較高的菌體密度和菌體存活率；本發(fā)明的干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)是液體MRS發(fā)酵活菌數(shù)的二十倍以上。
[0011]名稱為一株植物乳桿菌及其高密度培養(yǎng)和凍干菌株制備的方法，申請(qǐng)?zhí)?201210115452.5。本專利設(shè)計(jì)一株植物乳桿菌及其高密度培養(yǎng)和凍干菌粉制備的方法。技術(shù)方案是:其特征在于:所述植物乳桿菌(L.plantarum P8)是分離自內(nèi)蒙古巴彥悼爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見腸道致病菌等特性；該菌菌株已于2011年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCCN0.5468。
[0012]名稱為有效緩解酒精性肝損傷的復(fù)合益生菌發(fā)酵豆乳飲料及制備方法，申請(qǐng)?zhí)?201210005581.9。本發(fā)明涉及有效緩解酒精性肝損傷的復(fù)合益生菌發(fā)酵豆乳飲料，其特征是配料組成為:大豆乳或大豆粉還原乳300kg、葡萄糖10~15kg、鹿糖100~120kg、穩(wěn)定劑2~4kg、酸液0.1~0.3kg、食用香精或香料0.1~0.3kg、干酪乳桿菌(L.casei Zhang)發(fā)酵劑0.012~0.03kg、雙歧桿菌(B.1actis V9)發(fā)酵劑0.015~0.03kg。所述發(fā)酵劑菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCCN0.5469和CGMCC N0.5470。本發(fā)明還公開了其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種益生菌直投劑混菌固態(tài)混菌發(fā)酵全燕麥而生產(chǎn)三聯(lián)M生囷活囷粉劑及其制備方法。
[0014]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的技術(shù)方案如下:
[0015]一種益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或干酪乳桿菌Zhang中至少一種，所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發(fā)酵基質(zhì)，所述益生菌活菌粉劑采用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或干酪乳桿菌Zhang中至少一種經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備而得。[0016]三聯(lián)益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和干酪乳桿菌Zhang ;所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發(fā)酵基質(zhì)，所述益生菌活菌粉劑采用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和干酪乳桿菌Zhang經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備而得。
[0017]所述三聯(lián)活菌粉劑產(chǎn)品中植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P_8)活菌數(shù)不少于1.73X 109CFU/g，干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)的活菌數(shù)不少于 4.65 X 109CFU/g，乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)不少于1.73X 108CFU/g。
[0018]一種三聯(lián)益生菌活菌粉劑，可由下述方法制得:
[0019]以燕麥全粉和水制得固態(tài)培養(yǎng)基，植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang直投劑分別按2%-10% (v/w)和2%-12% (v/w)的接種量接種固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH自然，控制溫度為
34-38°C;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)O~16h后將乳雙歧桿菌V9直投劑再按2%_12% (v/w)的接種量接種固態(tài)培養(yǎng)基，再混菌固態(tài)發(fā)酵18_40h，溫度不變，共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間為24-42h ;發(fā)酵結(jié)束獲得的燕麥固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥16-28h，最后粉碎、過篩，得到三聯(lián)活菌粉劑。
[0020]固態(tài)培養(yǎng)基以燕麥全粉(非燕麥精粉，包含燕麥麩皮)為唯一的發(fā)酵基質(zhì)，含水量為40%_70%，不含各種糖類以及添加劑。
[0021]有益效果:
[0022]凍干后的三聯(lián)活菌粉劑產(chǎn)品中同時(shí)含有高活性的三種益生菌，其中植物乳桿菌 P-8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)不少于 1.73X 109CFU/g,干酪乳桿菌 Zhang (L.caseiZhang)的活菌數(shù)不少于4.65X 109CFU/g，乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)不少于1.73X 108CFU/g ;發(fā)明產(chǎn)品中干酪乳桿菌Zhang和植物乳桿菌P-8主要作用于人體的小腸，乳雙歧桿菌V9主要作用于人體的大腸，從而更好的調(diào)理腸道健康。
[0023]而且，燕麥中含有較為豐富的益生元一膳食纖維及葡聚糖等。相比于單菌發(fā)酵而言，混菌發(fā)酵中膳食纖維的損失偏低；而作為重要益生元的葡聚糖，發(fā)酵前后均為3.lg/100g DW，可有效促進(jìn)益生菌在人體內(nèi)的增殖。
[0024]而且，初步人體試驗(yàn)證實(shí):利用三株益生菌混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥制得的三聯(lián)活菌粉劑治療腹瀉的效果比對(duì)照組顯著。112名(0-15歲者:38名，15-35歲者:23名，35歲以上者:51名)志愿者食用三聯(lián)活菌粉劑2周的平均治愈率為94.6% ;尤其是對(duì)于15-35歲的志愿者，腹瀉的治愈率達(dá)100%。同時(shí)，比已報(bào)道的干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)和雙歧桿菌(B.1actis V9)發(fā)酵豆乳飲(專利申請(qǐng)?zhí)?201210006200.9)的治療效果顯著。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1:含水量對(duì)益生菌混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥活菌數(shù)的影響
[0026]圖2:直投劑接種量對(duì)益生菌混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥活菌數(shù)的影響
[0027]圖3:總培養(yǎng)時(shí)間對(duì)益生菌混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥總活菌數(shù)的影響
具體實(shí)施方案
[0028]以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行更具體的描述，但本發(fā)明并不限于具體實(shí)施例。
[0029]1 植物乳桿菌 P-8 (L.plantarum P-8)、干釀乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)與乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥，加水量、接種量以及培養(yǎng)時(shí)間的確定
[0030](1)加水量的確定
[0031]篩選實(shí)例I
[0032]燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉55 ;水45 ;115°C滅菌20min。
[0033]接種與培養(yǎng)條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0034]測(cè)得的總活菌數(shù)為3.56X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.82X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 1.74X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 3.71 X 107CFU/g。
[0035]篩選實(shí)例2
[0036]燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉50 ;水50 ;115°C滅菌20min。
[0037]接種與培養(yǎng)條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0038]測(cè)得的總活菌數(shù)為5.59X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.57X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 3.21 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 8.39X 107CFU/g。
[0039]篩選實(shí)例3
[0040]燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉45 ;水55 ;115°C滅菌20min。
[0041]接種與培養(yǎng)條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0042]測(cè)得的總活菌數(shù)為3.69X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.60X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 2.08 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 8.33X 107CFU/g。
[0043]篩選實(shí)例4
[0044]燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉40 ;水60 ;115°C滅菌20min。
[0045]接種與培養(yǎng)條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0046]測(cè)得的總活菌數(shù)為3.18X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.12X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 1.05 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 7.28X 107CFU/g。
[0047]結(jié)果:最佳的加水量為50% (見附圖1)。
[0048](2)接種量的確定
[0049]篩選實(shí)例5
[0050]在含水量已優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h。
[0051]接種量與培養(yǎng)條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為2%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37 ± I °C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0052]測(cè)得的總活菌數(shù)為3.59X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.70X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 1.88 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 7.14X 107CFU/g。
[0053]篩選實(shí)例6
[0054]在含水量已優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h。
[0055]接種量與培養(yǎng)條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37 ± I °C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0056]測(cè)得的總活菌數(shù)為5.59X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.57X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 3.21 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 8.39X 107CFU/g。
[0057]篩選實(shí)例7
[0058]在含水量已優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h。
[0059]接種量與培養(yǎng)條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為8%(v/w)，pH自然，培養(yǎng)溫度37 ± I °C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0060]測(cè)得的總活菌數(shù)為6.47X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.40X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 5.07 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 1.46X 108CFU/g。
[0061]篩選實(shí)例8
[0062]在含水量已優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發(fā)酵16h。
[0063]接種量與培養(yǎng)條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為10% (v/w), pH自然，培養(yǎng)溫度37 ± I °C，共計(jì)培養(yǎng)24h，對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0064]測(cè)得的總活菌數(shù)為5.15X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.14X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 4.00 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 1.34X 108CFU/g。
[0065]結(jié)果:最適的接種量為8% (見附圖2)。
[0066]( 3 )培養(yǎng)時(shí)間的確定
[0067]篩選實(shí)例9
[0068]在含水量已優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，三株乳酸菌直投劑的接種量均為8% (v/w),pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，再分別混菌發(fā)酵4、10、16、22、28、34h，分別對(duì)新鮮曲料中的益生菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。 [0069]結(jié)果:最佳培養(yǎng)時(shí)間為乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑接種后再混菌發(fā)酵28h，即最佳總發(fā)酵時(shí)間為36h(見附圖3)。此時(shí)測(cè)得的總活菌數(shù)為8.83X 109CFU/g。其中植物乳桿菌 P-8(L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 2.32X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang(L.caseiZhang)活菌數(shù)為 6.25 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 2.61 X IO8CFU/g°
[0070](4)真空冷凍干燥保護(hù)劑的選擇
[0071]篩選實(shí)例10
[0072]在上述最佳優(yōu)化結(jié)果的條件下(即篩選實(shí)例9)，向混菌固態(tài)發(fā)酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚異麥芽糖保護(hù)劑，攪拌均勻，預(yù)凍l_5h后，-70~_50°C進(jìn)行真空冷凍干燥，真空度為l_8pa，真空冷凍干燥16-28h，再進(jìn)行粉碎。
[0073]測(cè)得的總活菌數(shù)為1.77X 109CFU/g。植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 6.93X 108CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 9.86 X 108CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 8.72 X 107CFU/g。
[0074]篩選實(shí)例11
[0075]在上述最佳優(yōu)化結(jié)果的條件下(即篩選實(shí)例9)，向混菌固態(tài)發(fā)酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚果糖保護(hù)劑，攪拌均勻，預(yù)凍l_5h后，-70~-50°C進(jìn)行真空冷凍干燥，真空度為l_8pa，真空冷凍干燥16-28h，再進(jìn)行粉碎。
[0076]測(cè)得的總活菌數(shù)為1.90X 109CFU/g。植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 8.14X 108CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 9.86 X 108CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 1.02 X 108CFU/g。
[0077]篩選實(shí)例12
[0078]在上述最佳優(yōu)化結(jié)果的條件下(即篩選實(shí)例9)，向混菌固態(tài)發(fā)酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護(hù)劑，攪拌均勻，預(yù)凍l-5h后，-70~-50°c進(jìn)行真空冷凍干燥，真空度為l_8pa，真空冷凍干燥16-28h，再進(jìn)行粉碎。
[0079]測(cè)得的總活菌數(shù)為6.55X 109CFU/g。植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數(shù)為 1.73X 109CFU/g、干酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 4.65 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數(shù)為 1.73X 108CFU/g。
[0080]結(jié)果:保護(hù)劑為10%低聚半乳糖時(shí)的活菌數(shù)最高。
[0081]2 植物乳桿菌 P_8 (L.plantarum P-8)、干釀乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)與乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥
[0082]篩選實(shí)例13
[0083](1)植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥
[0084]通過優(yōu)化確定植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉50 ；7jC 50 ;115°C滅菌20min。
[0085]最佳接種與培養(yǎng)條件:乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)直投劑單菌的接種量為8%(v/w), pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，培養(yǎng)24h。
[0086]向植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P_8)單菌固態(tài)發(fā)酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護(hù)劑，攪拌均勻，真空冷凍干燥再進(jìn)行粉碎，測(cè)植物乳桿菌P-8(L.plantarum P-8)的活菌數(shù)。
[0087]結(jié)果:單菌固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P_8)的活菌數(shù)為1.58X 109CFU/g，添加保護(hù)劑冷凍干燥后植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)的活菌數(shù)為
1.04X 109CFU/g。
[0088]篩選實(shí)例14
[0089](2)干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥
[0090]通過優(yōu)化確定干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉50 ；7jC 50 ;115°C滅菌20min。
[0091]最佳接種與培養(yǎng)條件:干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)直投劑單菌的接種量為10% (v/w), pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，培養(yǎng)28h。
[0092]向干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)單菌固態(tài)發(fā)酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護(hù)劑，攪拌均勻，真空冷凍干燥再進(jìn)行粉碎，測(cè)干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)的活菌數(shù)。
[0093]結(jié)果:單菌固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)的活菌數(shù)為
6.26 X 109CFU/g,添加保護(hù)劑冷凍干燥后干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)的活菌數(shù)為
4.31X109CFU/g。
[0094]篩選實(shí)例15
[0095](3)乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥
[0096]通過優(yōu)化確定乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌固態(tài)發(fā)酵燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):燕麥全粉40 ;水60 ;115°C滅菌20min。
[0097]最佳接種與培養(yǎng)條件:乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑單菌的接種量為10%(v/w), pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，培養(yǎng)36h。
[0098]向乳雙歧桿菌V9(B.1actis V9)單菌固態(tài)發(fā)酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護(hù)劑，攪拌均勻，真空冷凍干燥再進(jìn)行粉碎，測(cè)乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)。
[0099]結(jié)果:單菌固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)為1.22X 108CFU/g，添加保護(hù)劑冷凍干燥后乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)為
7.81X107CFU/g。
[0100]總之，利用三株益生菌直投劑單菌或混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥全粉的對(duì)比如表1所示。
[0101]3混菌、單菌發(fā)酵前后總膳食纖維、可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維以及β_葡聚糖含量的測(cè)定
[0102]篩選實(shí)例16
[0103]利用AACC32-07和A0AC995.16法對(duì)單菌或混菌發(fā)酵前后總膳食纖維、可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維含量及β_葡聚糖含量進(jìn)行測(cè)定結(jié)果見表2。其中，作為重要益生元的β_葡聚糖含量在發(fā)酵前后相差不大。
[0104]4人體試驗(yàn):三聯(lián)活菌粉劑對(duì)志愿者腹瀉的治療情況
[0105]篩選實(shí)例17
[0106]選擇22 4名(0-15歲者:76名，15-35歲者:46名，35歲以上者:102名)腹瀉志愿者，實(shí)驗(yàn)組連續(xù)食用經(jīng)三株益生菌混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥制得的三聯(lián)活菌粉劑15天；對(duì)照組連續(xù)食用三株益生菌等比例配比的復(fù)合菌粉(直投劑)15天，調(diào)查每周平均排便次數(shù)，調(diào)查結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)組職員制食用三聯(lián)活菌粉劑10或15天，平均每周排便次數(shù)達(dá)到正常指標(biāo)4-9次，且糞便狀態(tài)呈現(xiàn)健康人群糞便狀態(tài)，證實(shí)本產(chǎn)品能有效的治療腹瀉，且比對(duì)照組(只食用三株益生菌復(fù)合菌粉)的治療效果顯著。
[0107]本實(shí)驗(yàn)以燕麥全粉為原料,和水按一定的配比制成固態(tài)培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)直投劑、干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)直投劑一定時(shí)間后再接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑進(jìn)行混進(jìn)固態(tài)發(fā)酵，獲得的燕麥固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥16-28h，最后粉碎、過篩，得到三聯(lián)活菌粉劑。通過混菌發(fā)酵制備的燕麥復(fù)合益生菌粉劑產(chǎn)品中三株益生菌的活菌數(shù)優(yōu)于單菌發(fā)酵的活菌數(shù)，尤其是乳雙歧桿菌V9(B.1actis V9)，且膳食纖維的損失相對(duì)較低，亦提供多樣化的生物活性物質(zhì)。
[0108]混菌發(fā)酵制備的燕麥復(fù)合益生菌粉劑中干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)活菌數(shù)為 4.65X 109CFU/g，植物乳桿菌 P-8 (L.plantarum P-8)的活菌數(shù)為 1.73 X 109CFU/g，乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)為1.73 X 108CFU/g，而干酪乳桿菌Zhang和植物乳桿菌P-8主要作用于人體的小腸，乳雙歧桿菌V9主要作用于人體的大腸，從而更好的調(diào)理腸道健康。再者，燕麥中含有較為豐富的益生元——膳食纖維及β_葡聚糖等，相比于單菌發(fā)酵而言，混菌發(fā)酵中膳食纖維的損失偏低；而作為重要益生元的葡聚糖，發(fā)酵前后均為
3.lg/100g DW，可有效促進(jìn)益生菌在人體內(nèi)的增殖。
[0109]并且，初步人體試驗(yàn)證實(shí)三聯(lián)活菌粉劑能有效的治療腹瀉，112名志愿者食用三聯(lián)活菌粉劑2周的平均治愈率為94.6% ;尤其是對(duì)于15~35歲的志愿者，腹瀉的治愈率達(dá)100%。比對(duì)照組(只食用三株益生菌復(fù)合菌粉)的治療效果顯著；比《營養(yǎng)學(xué)報(bào)》2011年第33卷第I期報(bào)道的雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌的治療效果顯著；也比已報(bào)道的干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)和雙歧桿菌(B.1actis V9)發(fā)酵豆乳飲(專利申請(qǐng)?zhí)?201210006200.9)的治療效果顯著。
[0110]故而，通過干酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)、植物乳桿菌P_8 (L.plantarumP-8)和乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥制備的復(fù)合益生菌粉中含有多種益生菌、益生元及豐富的賴氨酸、色氨酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，且能有效治療腹瀉，有望成為新的功能性、復(fù)合益生菌食品。
[0111]表1益生菌單菌或混菌固態(tài)發(fā)酵燕麥的比較
【權(quán)利要求】
1.一種益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或干酪乳桿菌Zhang中至少一種，所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發(fā)酵基質(zhì)，所述益生菌活菌粉劑采用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或干酪乳桿菌Zhang中至少一種經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備而得。
2.一種三聯(lián)益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和干酪乳桿菌Zhang ;所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發(fā)酵基質(zhì)，所述益生菌活菌粉劑采用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和干酪乳桿菌Zhang經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述三聯(lián)益生菌活菌粉劑，其特征在于，所述三聯(lián)活菌粉劑產(chǎn)品中植物乳桿菌P-8 (L.Plantarum P-8)活菌數(shù)不少于1.73X 109CFU/g,干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)的活菌數(shù)不少于4.65 X 109CFU/g,乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數(shù)不少于 1.73X 108CFU/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述三聯(lián)益生菌活菌粉劑，由下述方法制得: 以燕麥全粉和水制得固態(tài)培養(yǎng)基，植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang直投劑分別按2%-10%(v/w)和2%-12%(v/w)的接種量接種固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH自然，控制溫度為34_38°C;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)O~16h后將乳雙歧桿菌V9直投劑再按2%-12% (v/w)的接種量接種固態(tài)培養(yǎng)基，再混菌固態(tài)發(fā)酵18~40h，溫度不變，共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間為24-42h ;發(fā)酵結(jié)束獲得的燕麥固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥16-28h，最后粉碎、過篩，得到三聯(lián)活菌粉劑。
5.如權(quán)利要求4所述三聯(lián)益生菌活菌粉劑的制備方法，其特征在于，所述固態(tài)培養(yǎng)基以燕麥全粉為唯一的發(fā)酵基質(zhì)，含水量為40%-70%。
6.如權(quán)利要求1-5所述三聯(lián)益生菌活菌粉劑的制備方法，包括如下步驟:以燕麥全粉和水制得固態(tài)培養(yǎng)基，植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang直投劑分別按2%-10%和2%_12%的接種量接種固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，PH自然，控制溫度為34-38°C ;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)O~16h后將乳雙歧桿菌V9直投劑再按2%-12%的接種量接種固態(tài)培養(yǎng)基，再混菌固態(tài)發(fā)酵18~40h，共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間為24-42h ;發(fā)酵結(jié)束獲得的燕麥固態(tài)發(fā)酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥16_28h，最后粉碎、過篩，得到三聯(lián)活菌粉劑。
7.如權(quán)利要求5所述三聯(lián)益生菌活菌粉劑的制備方法，包括如下步驟:在燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.P lantarum P_8)和干酪乳桿菌Zhang (L.caseiZhang)直投劑，混菌發(fā)酵8h后接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，三株乳酸菌直投劑的接種量均為8% (v/w),pH自然，培養(yǎng)溫度37±1°C，混菌發(fā)酵28h。
【文檔編號(hào)】A61K35/74GK103893214SQ201410123174
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】高鵬飛, 張善亭, 姚國強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京和美科盛生物技術(shù)有限公司