一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，將羅非魚皮魚鱗清洗瀝干，置于0.4～0.6mol/L鹽酸中浸泡20～60min脫鈣，0.1～0.6mol/L氫氧化鈉浸泡30～60min脫脂；然后再將固液比為8～12：100的魚皮魚鱗和水添加到發(fā)酵罐中，121℃滅菌30min；向發(fā)酵罐中接入菌種，35℃發(fā)酵24～48h；發(fā)酵結(jié)束后過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集濾液I；濾液I再經(jīng)超濾膜超濾獲得含有蛋白肽的濾液II和含有纖溶酶的截留液。本發(fā)明直接以發(fā)酵方法同時制取具降壓活性的蛋白肽和能溶解血栓的纖溶酶兩種產(chǎn)物，原料利用率高，顯著降低了生產(chǎn)成本，且環(huán)保不污染環(huán)境，具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖溶酶(Plasmin)是指能專一降解纖維蛋白凝膠的蛋白水解酶，是纖溶系統(tǒng)中的一個重要組份。纖溶酶主要通過降解纖維蛋白和纖維蛋白原，水解多種凝血因子，使纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，水解補體等途徑降解纖維蛋白使其降解為小分子可溶片段，易于分解和從血循環(huán)系統(tǒng)中清除。纖溶酶作用于纖維蛋白原及纖維蛋白，促使組織纖溶酶原激活物由內(nèi)皮細胞釋放，并增強其活性，具抗血栓功能；并可降低血小板聚集及血液粘度，降低心肌耗氧量，改善微循環(huán)。
[0003]蛋白肽是介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，它小至由兩個氨基酸組成，大至由數(shù)百個氨基酸通過肽鍵連接而成，具有十分重要的生物學(xué)意義?，F(xiàn)代生物代謝研究發(fā)現(xiàn):人類攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)過消化道的多種酶水解后，不像以前認(rèn)為的那樣僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽的形式直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比相同組成的氨基酸快。其中，某些低肽不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，且同時具有重要的生理功倉泛。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中多利用生物酶解的方法制備，包括氯化鈉去除雜蛋白，氫氧化鈉脫脂，添加多種蛋白酶進行酶解進而得到膠原蛋白。利用酶解法生產(chǎn)膠原蛋白需要添加昂貴的蛋白酶，生產(chǎn)成本較高。目前，尚沒有一種以羅非魚皮魚鱗為原料采用微生物發(fā)酵的方法同時生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用羅非魚的魚皮魚鱗為原料同時生產(chǎn)具有重要生物活性的蛋白肽及纖溶酶的方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，包括以下步驟:
[0007](I)原料處理:將羅非魚皮魚鱗清洗浙干，置于0.4~0.6mol/L的鹽酸溶液中浸泡20~60min脫鈣，然后水洗至中性浙干；將經(jīng)脫鈣處理后的魚皮魚鱗置于0.1~0.6mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡30~60min脫脂，然后水洗至中性，攪碎烘干備用；
[0008](2)滅菌:將步驟I中處理好的魚皮魚鱗和水按固液比8-12:100的比例添加到發(fā)酵罐中，121°C滅菌30min ；
[0009](3)接種發(fā)酵:向發(fā)酵罐中接入經(jīng)液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌于35°C條件下發(fā)酵24~48h ;接入的菌種量為2~6% ；
[0010](4)發(fā)酵結(jié)束，過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集濾液I ;所述濾液I再經(jīng)超濾膜超濾獲得含有蛋白肽的濾液II和含有纖溶酶的截留液；[0011](5)所述含有蛋白肽的濾液II經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥得所述蛋白肽；所述含有纖溶酶的截留液經(jīng)冷凍干燥得所述纖溶酶。
[0012]本發(fā)明的目的還在于提供所述利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法獲得的蛋白肽在食品、保健品或化妝品中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的目的還在于提供所述利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法獲得的蛋白肽及纖溶酶在溶解血栓和預(yù)防血栓形成的保健品或藥物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于，利用羅非魚生產(chǎn)加工過程中的廢料魚皮和/或魚鱗作為生產(chǎn)原料，采用微生物發(fā)酵的方法同時制得具有降壓活性的蛋白肽和溶解血栓活性的纖溶酶兩種產(chǎn)物，且不需要加入昂貴的蛋白酶和添加劑，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是尿激酶在瓊脂糖-纖維蛋白平板上的溶菌圈,其中，I~5所對應(yīng)的酶活力分別是 20、40、60、80、160IU/ml ；
[0016]圖2是尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0017]圖3是本發(fā)明實施例所制備蛋白肽的高效液相色譜圖；
[0018]圖4是本發(fā)明實施例所制備蛋白肽的ACE抑制活性對比圖(對應(yīng)圖3中的7個峰)。【具體實施方式】
[0019]為了使本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
`[0020]本發(fā)明實施例提供一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，包括以下步驟:
[0021](I)原料處理:將羅非魚皮魚鱗清洗浙干，置于0.4~0.6mol/L的鹽酸溶液中浸泡20~60min脫鈣，然后水洗至中性浙干；將經(jīng)脫鈣處理后的魚皮魚鱗置于0.1~0.6mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡30~60min脫脂，然后水洗至中性，攪碎烘干備用；
[0022](2)滅菌:將步驟I中處理好的魚皮魚鱗和水按固液比8-12:100的比例添加到發(fā)酵罐中，121°C滅菌30min ；
[0023](3)接種發(fā)酵:向發(fā)酵罐中接入經(jīng)液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌于35°C條件下發(fā)酵24~48h ;接入的菌種量為2~6% ；
[0024](4)發(fā)酵結(jié)束，過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集濾液I ;所述濾液I再經(jīng)超濾膜超濾制得含有蛋白肽的濾液II和含有纖溶酶的截留液；
[0025](5)所述含有蛋白肽的濾液II經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥得所述蛋白肽；所述含有纖溶酶的截留液經(jīng)冷凍干燥得所述纖溶酶。
[0026]具體地，所述羅非魚皮魚鱗包括羅非魚的魚皮和魚鱗中的一種或者兩種任意比例的混合物。步驟I中對羅非魚皮魚鱗進行原料處理時魚皮魚鱗與鹽酸溶液的固液質(zhì)量比為1:4~8 ;經(jīng)脫鈣處理后的魚皮魚鱗氫氧化鈉溶液與的固液質(zhì)量比為1:4~8。發(fā)酵過濾出去菌體和雜質(zhì)后收集得到的濾液I需經(jīng)截留分子量為5000道爾頓的超濾膜再次過濾。超濾所得濾液II經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥制得蛋白肽粉，超濾所得截留液經(jīng)冷凍干燥制得活性纖溶酶粉。
[0027]以下結(jié)合具體參數(shù)進一步說明。
[0028]實施例1
[0029]稱取羅非魚皮5kg清洗浙干,加0.2mol/L氫氧化鈉40L,浸泡30min脫脂,水洗至中性，攪碎烘干備用。按固液質(zhì)量比8:100加魚皮和水到發(fā)酵罐中，121°C，30分鐘滅菌。接種量2%接種枯草芽孢桿菌，發(fā)酵溫度為35°C，發(fā)酵24小時。發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液板框過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集過濾液。過濾液用5000dalton超濾膜超濾，過濾液為蛋白肽，截留液為纖溶酶。過濾液經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥得蛋白肽粉。纖溶酶經(jīng)冷凍干燥得活性酶粉。
[0030]實施例2
[0031]稱取羅非魚皮和魚鱗的混合物5kg清洗浙干，加入濃度為0.4mol/L的鹽酸溶液60L,浸泡30min脫韓，水洗至中性后浙干；再加入0.4mol/L氫氧化鈉60升,浸泡40分鐘脫月旨，水洗至中性，攪碎烘干備用。按固液質(zhì)量比12:100的比例加入魚皮魚鱗混合物和水到發(fā)酵罐中，121°C，滅菌30分鐘。按4%的接種量接種枯草芽孢桿菌，發(fā)酵溫度為35°C，發(fā)酵36小時。發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液板框過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集過濾液。過濾液用5000dalton超濾膜超濾，過濾液為蛋白肽，截留液為纖溶酶。過濾液經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥得蛋白肽粉。纖溶酶經(jīng)冷凍干燥得活性酶粉。
[0032]實施例3
[0033]稱取羅非魚皮和魚鱗的混合物5kg清洗浙干，加入濃度為0.6mol/L的鹽酸溶液60L,浸泡30min脫韓，水洗至中性后浙干；加0.6mol/L氫氧化鈉80L,脫脂60分鐘,水洗至中性，攪碎烘干備用。按固液比10:100比例加魚皮和水到發(fā)酵罐中，121°C，30分鐘滅菌。接種量6%接種枯草芽孢桿菌，發(fā)酵溫度為35°C，發(fā)酵48小時。發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液板框過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集過濾液。過濾液用5000dalton超濾膜超濾，過濾液為蛋白肽，截留液為纖溶酶。過濾液經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥得蛋白肽粉。纖溶酶經(jīng)冷凍干燥得活性酶粉。
[0034]實驗例I纖溶酶溶栓活性測試
[0035]纖溶酶的溶栓活性用國家標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定，分別取20、40、60、80、160IU/mL的樣品溶液滴加到纖維蛋白平板上，如圖1所示，測量透明圈的面積，以尿激酶活力單位的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，透明圈面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以尿激酶活力單位表示纖溶酶的溶栓活性，測得纖溶酶活力的計算公式為:
[0036]溶纖酶活力(IU/mL)=0.843M-84.54 ；
[0037]式中M-溶圈面積(mm2)。
[0038]實驗測得本發(fā)明實施例1~3中所制得纖溶酶活平均值為215U/mg，可有效溶解血栓，在溶解血栓和預(yù)防血栓形成的保健品或藥物中具有廣泛的應(yīng)用價值。
[0039]實驗例2蛋白 肽的降壓活性測試
[0040]用紫外分光光度計血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE)抑制活性方法測定:
[0041]S1:取100 μ l HHL (Hip-His_Leu)溶液和40 μ l培養(yǎng)物上清于2ml EP管中混合，于37°C保溫3min，加入10μ l ACE溶液，于37度保溫反應(yīng)30min，加入250 μ llmol/L HCl溶液終止反應(yīng)。再加入1.5ml醋酸乙酯，15s振蕩混勻，5000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，用移液槍吸取Iml醋酸乙酯層，100°C下干燥lh，加入3ml去離子水，在228nm處測定其OD值A(chǔ)。其中，標(biāo)準(zhǔn)液為4ml緩沖液。
[0042]S2:將步驟SI中的40 μ I培養(yǎng)物換成40 μ I去離子水，其他不變，測得OD值B。
[0043]S3:將步驟I中的10 μ I ACE溶液換成10 μ I去離子水，其他不變，測得OD值C。
[0044]S4:計算 ACE 抑制率(％) = (B-A) / (B-C) *100%
[0045]本發(fā)明所制得活性蛋白肽經(jīng)高效液相色譜層析分離得7個峰，如圖3所示，依次編號為I~7，所測得7個峰的ACE抑制率為18.40~68.40%，其中第5個峰的ACE抑制率最高，可達68.40%，具有高效的降壓活性，可用于制備降壓活性的保健品及藥物。
[0046]本發(fā)明方法可同時制得具有重要生物活性的蛋白肽和纖溶酶，所述蛋白肽分子質(zhì)量小，利于身體以低肽的形式直接吸收，且吸收速度比相同組成的氨基酸快，能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，可用于制備具有特定功能的食品、保健品或化妝品。所制得活性蛋白肽成份豐富，含有如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE)，可用于制備具有降壓活性的保健品或藥物；所制得活性蛋白肽還可作為原料進一步分離提純制得其他活性肽，如促進礦物質(zhì)吸收肽、防治肝性腦病肽、易消化吸收肽、抗菌肽、嗎啡片肽、類嗎啡拮抗肽、抑制膽固醇作用肽、機體防御功能肽。
[0047]進一步地，本發(fā)明利用羅非魚生產(chǎn)加工過程中的廢料魚皮和/或魚鱗作為生產(chǎn)原料，采用微生物發(fā)酵的方法同時制得具有降壓活性的蛋白肽和溶解血栓活性的纖溶酶兩種產(chǎn)物，且不不需要加入昂貴的蛋白酶和添加劑，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉。
[0048]以上所述僅為本 發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原料處理:將羅非魚皮魚鱗清洗浙干，置于0.4~0.6mol/L的鹽酸溶液中浸泡20~60min脫鈣，然后水洗至中性浙干；將經(jīng)脫鈣處理后的魚皮魚鱗置于0.1~0.6mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡30~60min脫脂，然后水洗至中性，攪碎烘干備用； (2)滅菌:將步驟I中處理好的魚皮魚鱗和水按固液比8~12:100的比例添加到發(fā)酵罐中，121°C滅菌30min ； (3)接種發(fā)酵:向發(fā)酵罐中接入經(jīng)液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌于35°C條件下發(fā)酵24~48h ;接入的菌種量為2~6% ； (4)發(fā)酵結(jié)束，過濾去除菌體和雜質(zhì)，收集濾液I;所述濾液I再經(jīng)超濾膜超濾獲得含有蛋白肽的濾液II和含有纖溶酶的截留液； (5)所述含有蛋白肽的濾液II經(jīng)真空濃縮，噴霧干燥得所述蛋白肽；所述含有纖溶酶的截留液經(jīng)冷凍干燥得所述纖溶酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，其特征在于，所述羅非魚皮魚鱗包括羅非魚的魚皮和/或魚鱗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，其特征在于，所述魚皮魚鱗與所述鹽酸溶液的固液質(zhì)量比為1:4~8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，其特征在于，所述經(jīng)脫鈣處理后的魚皮魚鱗與`所述氫氧化鈉溶液的固液質(zhì)量比為1:4~8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法，其特征在于，所述超濾膜的截留分子量為5000道爾頓。
6.一種如權(quán)利要求1~5任一項所述的利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法獲得的蛋白肽在食品、保健品或化妝品中的應(yīng)用。
7.—種如權(quán)利要求1~5任一項所述的利用羅非魚皮魚鱗發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽及纖溶酶的方法獲得的纖溶酶在溶解血栓和預(yù)防血栓形成的保健品或藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/01GK103820518SQ201410092219
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】韓慶國, 魏文豐 申請人:深圳大學(xué)