誘導(dǎo)骨生成和hedgehog信號傳導(dǎo)且抑制脂肪形成的新的氧固醇類似物:氧固醇化合物149的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及,例如,具有以下結(jié)構(gòu)(式I)的合成的化合物,氧固醇化合物149,或包含氧固醇化合物149和藥學(xué)上可接受的載體的生物活性組合物或藥物組合物。還公開了使用該化合物或生物活性組合物或藥物組合物治療多種疾病(包括例如骨病、肥胖癥、心血管障礙和神經(jīng)障礙)的方法。氧固醇化合物149可局部或全身遞送。
【專利說明】誘導(dǎo)骨生成和HEDGEHOG信號傳導(dǎo)且抑制脂肪形成的新的 氧固醇類似物:氧固醇化合物149
[0001] 本申請要求2012年5月7日提交的美國臨時申請61/643, 776的優(yōu)先權(quán),其以其 整體在此引入作為參考。
[0002] 本發(fā)明在政府支持(GrantNo.AR059794)下做出,且得到NationalInstitutes ofHealth的嘉獎。政府具有本發(fā)明的一些權(quán)益。
【背景技術(shù)】
[0003] 生物制品通常在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于促進骨生長,包括骨折愈合和脊柱病癥的手術(shù)處理 (1 - 4)。脊柱融合手術(shù)通常通過整形外科醫(yī)生和神經(jīng)外科醫(yī)生等進行以解決影響腰椎和頸 椎的退行性椎間盤疾病和關(guān)節(jié)炎。從歷史觀點上說,自體骨移植物,通常從患者的髂嵴采 取,已用于增加椎體節(jié)段(vertebrallevel)之間的融合。然而,相關(guān)供體位點發(fā)病率、增 加的手術(shù)時間和與收集自體骨移植物(5-7)相關(guān)的增加的血液損失提供了尋找安全和有 效替代品的動機。
[0004] 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)通常用于促進人的脊柱融合。其用途在2002 年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于單水平前路椎體間融合(8)dhBMP-2的使用從 此顯著增加,其用途的適應(yīng)癥已擴展到包括后路腰椎脊柱融合以及頸椎融合。盡管rhBMP-2 具有功效,但最近的報告質(zhì)疑其在用于脊柱融合外科手術(shù)時的安全性。報告的并發(fā)癥包括 皮下積液、軟組織腫脹、椎體骨質(zhì)溶解、異位骨形成、逆行射精和致癌(9 - 12)。而且,在其用 于頸椎時觀察到氣道水腫,促使FDA頒布了一項公共衛(wèi)生的通知,警告其在頸椎手術(shù)中的 使用。迄今沒有找到合適的替代品在誘導(dǎo)融合方面具有類似的功效而沒有rhBMP-2的不利 作用(12)。
[0005] 氧固醇(oxysterol)形成存在于循環(huán)系統(tǒng)以及人和動物組織中的一大家族的膽 固醇的氧化衍生物。已發(fā)現(xiàn)氧固醇存在于動脈粥樣硬化損傷中且在多種生理過程,如細胞 分化、炎癥、凋亡和類固醇產(chǎn)生中起作用。本
【發(fā)明者】中的一些之前報告了具體的天然存在的 氧固醇具有穩(wěn)健的成骨性質(zhì)(13)。最有效的成骨天然存在的氧固醇,20 (S)-羥基膽固醇 ("20S")(14),當(dāng)施加于能分化為成骨細胞和脂肪細胞的多能間質(zhì)細胞時是成骨性的和抗 脂肪形成的。之前已進行20S的結(jié)構(gòu)修飾以合成20S更有效的類似物,包括氧固醇化合物 34和氧固醇化合物49,已顯示它們能通過活化hedgehog(Hh)信號傳遞(15)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì) 細胞(MSC)的成骨分化和抑制骨髓基質(zhì)細胞(MSC)的成脂分化。此外,氧固醇化合物34和 氧固醇化合物49在后外側(cè)脊柱融合的大鼠模型中體內(nèi)刺激脊柱融合(15)?,F(xiàn)有技術(shù)的氧 固醇分子具有廣泛地和不可預(yù)測地改變的性質(zhì)。仍然需要相比rhBMP-2和現(xiàn)有技術(shù)的氧固 醇新的改善的氧固醇,以提供增加的效能和增強的功效,且方便合成和具有較低制備成本。 新的氧固醇可為醫(yī)師治療例如長骨骨折、脊柱疾病和骨質(zhì)疏松提供更可行的臨床選擇。
[0006] 上述成骨的氧固醇特別適用于直接、局部給藥于感興趣的靶細胞、組織或器官。目 前,沒有商業(yè)上的合成代謝藥物用于全身遞送和骨病例如骨質(zhì)疏松的干預(yù),骨質(zhì)疏松為在 老年男性和女性以及絕經(jīng)后婦女中骨損失的疾病。目前僅有的誘導(dǎo)骨形成的全身遞送藥物 為ForteoT< (特立帕肽[rDNA起源]注射),其是昂貴的,具有不利作用且FDA要求使用不 超過24個月。對在例如骨質(zhì)疏松患者中全身給藥后更安全和更有效誘導(dǎo)全身骨形成的成 骨劑,如成骨的氧固醇存在需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007] 圖1顯示成骨的氧固醇的分子結(jié)構(gòu)。示出了20(S)_羥基膽固醇(20S)、氧固醇化 合物34、氧固醇化合物49和氧固醇化合物133的分子結(jié)構(gòu)。氧固醇化合物34與20S的不 同之處在于在C6上具有額外的0H基團且C5和C6之間的雙鍵被消除。氧固醇化合物49 具有與氧固醇化合物34類似的結(jié)構(gòu)且在C25和C27之間包括雙鍵。氧固醇化合物133與 氧固醇化合物34和49的不同在于缺少C27和側(cè)鏈長度增加一個碳。
[0008] 圖2顯示堿性磷酸酶活性通過氧固醇的劑量依賴性活化。融合的(圖2A) C3HT101/2細胞或(圖2B)M2-10B4細胞用對照載體或0. 125-10yM氧固醇化合物133處 理。為直接與氧固醇化合物133比較,C3H細胞也用氧固醇化合物34和氧固醇化合物49 (圖 2A)處理。4天后,堿性磷酸酶(ALP)活性在全細胞提取物中測量。代表性三個單獨的實驗 的數(shù)據(jù)報告為一式三份測定值的平均值土SD且歸一化為蛋白質(zhì)濃度。(對于用0. 25yM或 更高劑量的所有氧固醇處理的細胞vs.對照載體處理的細胞,p〈0. 0001)。
[0009] 圖3顯示氧固醇化合物133誘導(dǎo)成骨性分化。(圖3A)融合的C3HT101/2細胞用 對照載體或2. 5yM氧固醇化合物133在成骨介質(zhì)中處理。成骨基因Runx2、ALP、BSP、0SX 和0CN的表達在處理48小時(48h)、4、7和14天后通過定量實時PCR測量。代表性實驗的 結(jié)果報告為一式三份測定值的平均值土SD。(在所有時間點對于ALP、BSP和0SX和在4、7 和14天對于Runx2和0CN,對于對照vs.氧固醇化合物133,p〈0. 005)。(圖3B)C3H10Tl/2 細胞用對照載體或2. 5yM氧固醇化合物133處理3周。為檢測細胞外礦化,進行vonKossa 染色,且礦化基質(zhì)在光學(xué)顯微鏡(10X)下顯示深黑染色。(圖3C)在與(B)中描述的那些平 行的培養(yǎng)物中,礦化使用45Ca摻入測試定量(對于對照vs.所有濃度的氧固醇化合物133, p〈0.005)。(圖3D)原代人MSC在成骨介質(zhì)中用對照載體或5yM氧固醇化合物133處理 4周。成骨基因0SX、BSP和0CN的表達通過定量實時PCR測量。代表性實驗的結(jié)果報告為 一式三份測定值的平均值土SD(在對照vs.氧固醇化合物133處理的細胞中對于所有基因 p〈0. 05)。(圖3E)原代人MSC在成骨介質(zhì)中用對照載體或0. 5、1和5yM氧固醇化合物133 處理5周。為檢測細胞外礦化,進行vonKossa染色且礦化基質(zhì)在光學(xué)顯微鏡(10X)下顯 示深黑染色。
[0010] 圖4顯示hedgehog途徑在氧固醇化合物133-誘導(dǎo)的成骨性分化中的作用。(圖 4A)C3H10Tl/2融合的細胞在成骨介質(zhì)中用對照載體或氧固醇化合物133在存在或不存在 4yM環(huán)杷明(cyclopamine,Cyc)的情況下處理。4天后的ALP活性,和7天后成骨基因ALP、 BSP和0SX的表達通過定量實時PCR測量(對于ALP活性和所有所示基因的表達,對于對照 vs.氧固醇化合物133,以及對于氧固醇化合物133vs.氧固醇化合物133+Cyc,p〈0. 001)。 (圖4B)C3H10Tl/2細胞用對照質(zhì)粒(pGL3b)或包含8X-Gli熒光素酶報告物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,且 用對照載體或氧固醇化合物133處理,且熒光素酶活性在48小時后測定。代表性實驗的結(jié) 果報告為一式三份測定值的平均值土SD。(對于對照vs. 100nM、250nM的氧固醇化合物133 以及1yM氧固醇化合物133,p〈0. 001)。(圖4C)在不包含競爭劑或包含50yM游離競爭 劑固醇(20S,氧固醇化合物133或氧固醇化合物16)的樣品中比較被20S珠或?qū)φ罩椴东@ 的YFP-Smo的量。被珠捕獲的YFP-Smo通過蛋白質(zhì)印跡(上部)測量且與沒有競爭劑的結(jié) 合反應(yīng)中捕獲的量對比繪圖(下部)。
[0011] 圖5顯示通過BMP2和氧固醇化合物133形成的融合塊的平片放射性照片。顯示 了手術(shù)8周后指示組的兩個代表性動物的Faxitron圖像。箭頭(Arrowheads)表示缺少骨 形成;箭體(arrows)表示骨形成。組1(對照);沒有骨形成的橫突間空間。組II(BMP2); 橋接骨量和在L4 -L5的雙側(cè)融合。組III(氧固醇化合物133, 20mg);橋接骨量和在L4 -L5的雙側(cè)融合。組IV(氧固醇化合物133, 2mg);在顯示通過氧固醇化合物133誘導(dǎo)融合的 動物中的橋接骨量和在L4 -L5的雙側(cè)融合。
[0012] 圖6顯示通過BMP2和氧固醇化合物133形成的融合塊的顯微CT。顯示了指示組 的兩個代表性動物的顯微CT。箭頭表示缺少骨形成;箭體表示骨形成.組1(對照);沒有 骨形成的橫突間空間。組II(BMP2);橋接橫突間空間的骨量和在L4-L5的雙側(cè)融合。組 III(氧固醇化合物133, 20mg);橋接橫突間空間的骨量和在L4 -L5的雙側(cè)融合。組IV(氧 固醇化合物133, 2mg);在顯示通過氧固醇化合物133誘導(dǎo)融合的動物中的橋接橫突間空間 的骨量和在L4-L5的雙側(cè)融合。組V(氧固醇化合物133,0. 2mg);在右側(cè)遠端的箭體指示 從L5橫突的少量的骨形成。
[0013] 圖7顯示氧固醇化合物133對脊柱融合的效果的組織學(xué)分析。(圖7A)顯示了各 組的兩個單獨的代表性動物的冠狀組織學(xué)切片(10X)。組1(對照)在橫突間空間(箭頭) 沒有顯著的骨形成。組II(BMP2)證實在L4-L5(箭體)的橋接骨頭,清楚證明形成融合塊 的小梁骨和皮質(zhì)骨。組111(氧固醇化合物133-20mg)和組IV(氧固醇化合物133,2mg) 試樣證實在橫突間空間(箭體)顯著的骨形成,且小梁骨和皮質(zhì)骨的形成與BMP2誘導(dǎo)的相 當(dāng)。(圖7B)源自組II(BMP2)和組III(氧固醇化合物133, 20mg)的兩個動物的冠狀組織 學(xué)切片證實,在BMP2處理的動物的融合塊中有顯著的脂肪細胞形成,且在源自氧固醇處理 的動物的融合塊中有明顯較少的脂肪細胞(箭體,放大率20X)。
[0014] 圖8顯示在(圖8A)M2-10B4骨髓基質(zhì)細胞,和在(圖8B)C3H10Tl/2胚胎成纖維細 胞中,成骨性分化標(biāo)記、堿性磷酸酶活性被氧固醇化合物133和氧固醇化合物149誘導(dǎo)。融 合的細胞用載體、氧固醇化合物133或氧固醇化合物149處理。4天后,堿性磷酸酶(ALP) 活性在全細胞提取物中測量。代表性的三個單獨實驗的數(shù)據(jù)報告為一式三份測定值的平均 值辛SD,且歸一化為蛋白質(zhì)濃度。
[0015] 圖9顯示氧固醇化合物133和氧固醇化合物149誘導(dǎo)成骨性分化和成骨性分化標(biāo) 記基因的表達。融合的C3HT101/2細胞用載體、氧固醇化合物133或氧固醇化合物149在 成骨介質(zhì)中處理。成骨基因Runx2(圖9E)、ALP(圖9A)、骨唾液蛋白質(zhì)(BSP)(圖9B)、鋅指 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix) (0SX)(圖9C)和骨鈣蛋白(0CN)(圖9D)的表達在處理8天后通 過定量實時PCR測定。代表性實驗的結(jié)果報告為一式三份測定值的平均值土SD。
[0016] 圖10顯示氧固醇化合物133和氧固醇化合物149誘導(dǎo)hedgehog途徑信號傳遞。 融合的C3H10T1/2細胞在存在或不存在4yM環(huán)杷明(Cyc)下,在成骨介質(zhì)中用對照載體、 氧固醇化合物133或氧固醇化合物149處理。72小時后hedgehog途徑靶基因Glil(圖 10A)、Ptchl(圖10B)和HIP(圖10C)的表達通過定量實時PCR測定。代表性實驗的結(jié)果 報告為一式三份測定值的平均值土SD。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0017] 本
【發(fā)明者】在此描述和表征了一種分子(化合物),其為新鑒別的、特別有效的氧固 醇分子(氧固醇化合物133)和四環(huán)素-衍生的靶向骨的部分的混雜物。該混雜分子稱為 氧固醇化合物149。由于其選擇性和特異性遞送至骨的能力,氧固醇化合物149特別適合于 全身遞送至受試者,例如用于靶向骨質(zhì)疏松。
[0018] 本
【發(fā)明者】在此首先鑒定了一種成骨的氧固醇,氧固醇化合物133,其非常適合于多 種臨床用途,且描述了其在體外促進成骨性分化和在大鼠模型體內(nèi)促進脊柱融合的能力。 在合成和測試的大量氧固醇類似物中,氧固醇化合物133出乎意料地特別有效且易于合 成。氧固醇化合物133誘導(dǎo)成骨標(biāo)記Runx2、osterix(OSX)、堿性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白 質(zhì)(BSP)和骨鈣蛋白(OCN)在C3H10T1/2小鼠胚胎成纖維細胞中的顯著表達。氧固醇化合 物133-誘導(dǎo)的8X-Gli熒光素酶報道物的活化,其與Smoothened的直接結(jié)合,和氧固醇化 合物133-誘導(dǎo)的成骨作用被hedgehog(Hh)途徑抑制劑環(huán)杷明的抑制作用,證實了Hh途徑 在介導(dǎo)對氧固醇化合物133的成骨響應(yīng)中的作用。此外,氧固醇化合物133誘導(dǎo)OSX、BSP 和0CN的表達且刺激原代人間質(zhì)干細胞中穩(wěn)健的礦化。在體內(nèi),在僅4周后在用氧固醇化 合物133處理的動物中在融合位點通過X-射線觀察到雙側(cè)脊柱融合,且在8周后通過手動 評估、顯微-CT和組織學(xué)證實,其具有與骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)-2 (BMP2)相等的功效。然而,不 像BMP2,氧固醇化合物133沒有在融合塊中誘導(dǎo)脂肪形成且導(dǎo)致更致密的骨形成,如被更 大的BV/TV比例和更小的小梁分離所證實。因此氧固醇化合物133可用于治療會受益于骨 形成的局部刺激的疾病,包括例如,脊柱融合,骨折修復(fù),骨再生/組織工程應(yīng)用,增加下頒 骨密度以用于種植牙,骨質(zhì)疏松等。
[0019] 本
【發(fā)明者】還證實氧固醇化合物133抑制多潛能MSC細胞的脂肪形成。因此氧固醇 化合物133可用于治療以下疾病,例如,黃瘤形成、脂肪墊的局部累積和肥胖癥。
[0020] 氧固醇化合物133的優(yōu)點包括,例如,當(dāng)與本
【發(fā)明者】研宄的其它成骨的氧固醇相 比時更方便合成和改善的融合時間。
[0021] 而且,本
【發(fā)明者】在此描述了一種修飾形式的氧固醇化合物133,其連接有作為靶向 骨的部分的四環(huán)素-衍生的分子。該混雜分子,稱為氧固醇化合物149,選擇性和特異地遞 送至骨(選擇性傳遞至(homesto)骨),這是由于其與祀向骨的試劑的連接。不希望被任 何具體理論束縛,據(jù)建議氧固醇化合物149選擇性在骨中聚集且刺激間質(zhì)干細胞經(jīng)歷成骨 性分化并制成新的骨,且這種成骨性分化的刺激是通過骨細胞中hedgehog信號傳導(dǎo)的活 化介導(dǎo)的。無論其作用機理是什么,因為氧固醇化合物149是選擇性和特異性遞送至骨,因 此在全身遞送至受試者后對于骨生成是有效的。全身遞送的能力代表一種顯著的優(yōu)點,例 如用于治療骨質(zhì)疏松受試者。氧固醇化合物149為小分子成骨的氧固醇,其可作為下一代 的骨合成治療劑的一員,以及治療多種其它疾病的有用藥物,包括將受益于Hh途徑活性的 刺激的疾病。
[0022] 本發(fā)明的一個方面為化合物,稱為氧固醇化合物149(Oxy149),具有下式
[0023]
【權(quán)利要求】
1. 一種化合物,其為氧固醇化合物149,具有式I,
或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
2. 生物活性組合物,其包含該化合物氧固醇化合物149和藥學(xué)上可接受的載體。
3. 權(quán)利要求2的生物活性組合物,其進一步包含至少一種另外的試劑,其選自甲狀旁 腺激素、氟化鈉、胰島素樣生長因子I(ILGF-I)、胰島素樣生長因子II(ILGF-II)、轉(zhuǎn)化生長 因子0 (TGF-0)、細胞色素P450抑制劑、成骨前列腺素類、BMP2、BMP4、BMP7、BMP14和 抗再吸收劑。
4. 治療患有骨病、骨質(zhì)疏松或骨折的受試者的方法,包括向受試者給藥有效量的權(quán)利 要求2的生物活性組合物。
5. 權(quán)利要求4所述的方法,包括向受試者以治療有效劑量以有效劑型在所選的間隔給 藥該生物活性組合物以增加骨量。
6. 權(quán)利要求4所述的方法,包括向受試者以治療有效劑量以有效劑型在所選的間隔給 藥該生物活性組合物以改善骨質(zhì)疏松癥狀。
7. 治療需要增加骨形態(tài)形成和/或骨質(zhì)增生的受試者的方法,包括向受試者給藥有效 量的權(quán)利要求2所述的組合物。
8. 治療受試者以誘導(dǎo)骨形成的方法,包括以有效劑型在所選的間隔給藥權(quán)利要求2所 述的組合物以增加骨量。
9. 誘導(dǎo)哺乳動物的間質(zhì)干細胞的成骨細胞分化的方法,包括將該細胞與有效量的權(quán)利 要求2所述的組合物接觸,其中該哺乳動物的間質(zhì)干細胞為受試者的骨髓基質(zhì)細胞。
10. 在受試者的細胞或組織中刺激hedgehog(Hh)途徑介導(dǎo)的響應(yīng)的方法,包括將該細 胞或組織與有效量的權(quán)利要求2的生物活性組合物接觸,其中該Hh途徑介導(dǎo)的響應(yīng)為成骨 細胞分化、骨形態(tài)形成和/或骨質(zhì)增生的刺激。
11. 治療受試者以誘導(dǎo)骨形成的方法,包括: 收集哺乳動物的間質(zhì)干細胞; 用權(quán)利要求2的生物活性組合物處理哺乳動物間質(zhì)細胞以誘導(dǎo)該細胞的成骨細胞分 化;和 將該分化的細胞給予受試者。
12. 權(quán)利要求4-10任一項所述的方法,其中將該生物活性組合物局部給予受試者的細 胞、組織或器官。
13. 權(quán)利要求4-10任一項所述的方法,其中將該生物活性組合物全身給予受試者。
14. 刺激哺乳動物中的哺乳動物細胞以使成骨細胞分化的生物標(biāo)記表達水平大于未處 理的細胞中的生物標(biāo)記水平的方法,包括將哺乳動物細胞暴露于有效量的權(quán)利要求1所述 的化合物。
15. 權(quán)利要求14所述的方法,其中所述生物標(biāo)記為堿性磷酸酶活性、鈣摻入、礦化和/ 或骨鈣蛋白mRNA的表達。
16. 權(quán)利要求14所述的方法,其中該哺乳動物細胞為間質(zhì)干細胞、骨原細胞或顏蓋損 傷、破裂或缺陷中的細胞。
17. 用于人或動物體的植入物,其包含具有表面的基材,其中該植入物的表面或內(nèi)部包 含足以在周圍骨組織誘導(dǎo)骨形成的量的權(quán)利要求2的生物活性組合物。
18. 權(quán)利要求17所述的植入物,其中所述基材形成針、螺桿、板或人工關(guān)節(jié)的形狀。
【文檔編號】A61K31/575GK104507951SQ201380033489
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月7日
【發(fā)明者】F.帕哈米, M.E.瓊格, F.斯塔彭貝克, 小威廉.M.皮爾斯, K.G.泰勒, K.E.默滕 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, 路易斯維爾大學(xué)研究基金會公司