專利名稱：紫外線誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的抑制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過增強(qiáng)扁平上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCCA-1和/或SCCA-2)的表達(dá)，強(qiáng)化皮膚的紫外線(UV)防御機(jī)制的方法。
背景技術(shù)：
已知表皮受到由紫外線(UV)照射引起的多種損傷。皮膚一旦受到紫外線照射就會(huì)產(chǎn)生色素沉著，如果受到連續(xù)的反復(fù)照射，表皮就會(huì)肥厚化，失去彈性。作為表皮的紫外線損傷的癥狀，除了知道炎癥、皮膚變粗糙、皺紋、松弛、色素沉著、斑點(diǎn)著色、變成土色、黑痣、紫癜發(fā)病、毛細(xì)管擴(kuò)張等之外，還知道這些癥狀與惡性腫瘤的發(fā)病相關(guān)。一般而言，臉、脖頸子、手和腳等習(xí)慣性暴露于日光下的皮膚往往容易發(fā)生紫外線損傷。由于臭氧層的破壞，紫外線照射引起的皮膚損傷是現(xiàn)在特別被關(guān)注的問題。
與表皮的生理學(xué)UV防御機(jī)制相關(guān)的認(rèn)識(shí)以與基底層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素相關(guān)的研究、以及抗氧化物質(zhì)的探索和開發(fā)為中心。此外，還知道放射線/紫外線照射誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡(三浦正幸、山田武編實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊(cè)《術(shù)語(yǔ)文庫(kù)程序性細(xì)胞死亡》1996)，還在進(jìn)行基底細(xì)胞中的抗程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)bcl-2的研究(Fang等人，J.Immunol.1994，153，4388-4398；Takahashi等人，Photochem.Photobiol.2001，74(4)579-586)。認(rèn)為bcl-2通過阻斷程序性細(xì)胞死亡或使之延遲，發(fā)揮其UV防御機(jī)制。但是，幾乎沒有關(guān)于表皮上層中的內(nèi)源性UV防御蛋白質(zhì)等的闡述。
發(fā)明的公開本發(fā)明以闡明新的表皮特異性UV防御機(jī)制，并提供新型且有效的UV防御方法作為課題。
皮膚病中的其中一種，是以表皮細(xì)胞的增殖/分化異常和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性、再發(fā)性的炎癥性不全角化癥的牛皮癬(Hopso-Havu等人，British Journal of Dermatology(1983)109，77-85)。認(rèn)為牛皮癬除遺傳因素之外還因多種環(huán)境因子而發(fā)病。已知如果將牛皮癬的發(fā)病的表皮與正常表皮比較，就會(huì)發(fā)現(xiàn)牛皮癬表皮的上層中扁平上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原(Squamous Cell Carcinoma Antigen，以下稱為“SCCA”)的表達(dá)增強(qiáng)(Takeda A.等人，J.Invest.Dermatol.(2002)118(1)，147-154)。SCCA是從子宮頸部扁平上皮癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的抗原，其在子宮頸部、肺、食道、皮膚的扁平上皮癌中顯示出高的血液濃度，其常用于扁平上皮癌的診斷和治療效果的判定。SCCA也被用于皮膚扁平上皮癌的診斷，但是在本發(fā)明人的研究中，發(fā)現(xiàn)皮膚的扁平上皮癌中的SCCA表達(dá)不高。SCCA是由染色體18q21.3上的串聯(lián)排列的兩個(gè)基因SCCA-1和SCCA-2編碼。認(rèn)為SCCA-1和SCCA-2均為分子量約45,000的蛋白質(zhì)，同源性非常高，但是二者反應(yīng)部位的氨基酸序列不同，具有不同的功能(Schick等人，J.Biol.Chem.(1997)27213，1849-55)。
本發(fā)明人關(guān)注于SCCA-1和SCCA-2，進(jìn)行了皮膚UV防御機(jī)制的研究。免疫組織的方法和原位雜交的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非露光部位相比，露光部位皮膚的SCCA的表達(dá)顯著增強(qiáng)。進(jìn)而，清楚了由于對(duì)人皮膚的UV照射，棘層和顆粒層中SCCA的表達(dá)有力地增強(qiáng)。基底層中沒有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)。而且，在三維皮膚模型、培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞中同樣也確認(rèn)了由UV照射引起的SCCA表達(dá)的增強(qiáng)。
然后，本發(fā)明人在沒有發(fā)現(xiàn)SCCA表達(dá)的3T3細(xì)胞中導(dǎo)入人SCCA-1和SCCA-2基因，建立穩(wěn)定的表達(dá)體系。以膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙錠(PI)作為程序性細(xì)胞死亡指標(biāo)，用FACS(熒光活性細(xì)胞分選)分析，結(jié)果在任一SCCA穩(wěn)定表達(dá)體系中均發(fā)現(xiàn)由UV照射引起的程序性細(xì)胞死亡顯著減少。
進(jìn)而，通過以pSilencer載體使siRNA在高表達(dá)SCCA的HaCat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的RNA干涉法，建立了SCCA-1和SCCA-2的敲低(knockdown)(siSCCA)細(xì)胞株。通過定量PCR，在siSCCA細(xì)胞株中確認(rèn)出SCCA的表達(dá)有90％及90％以上被抑制。進(jìn)行75mJ/cm2的UV照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照株中38％的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，與之相反siSCCA細(xì)胞株中約80％的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。
整理以上結(jié)果，可以清楚SCCA是承擔(dān)UV防御機(jī)制的主要蛋白質(zhì)。
基于以上認(rèn)識(shí)，完成了本發(fā)明，在第一觀點(diǎn)中，提供了一種通過使表皮細(xì)胞的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)，抑制表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的方法。在合適的方案中，程序性細(xì)胞死亡是由紫外線照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，因此通過該方法，可以提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的發(fā)病的抵抗力。表皮細(xì)胞包括角質(zhì)形成細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、棘細(xì)胞等。
在其它的觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力(以下有時(shí)也稱為“UV抵抗力”)的皮膚檢查方法。這種方法的特征在于，當(dāng)表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)比表皮細(xì)胞的表達(dá)低時(shí)，判斷為表皮的UV抵抗力弱。
優(yōu)選的是，通過測(cè)定細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2量，確定表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)的增強(qiáng)?？梢岳缋每筍CCA-1和/或SCCA-2的特異性抗體，通過ELISA法或者RIA法實(shí)施這種測(cè)定。此外，也可以通過測(cè)定從表皮細(xì)胞中提取的編碼SCCA-1和/或SCCA-2的mRNA，確定表皮細(xì)胞中SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)。這種mRNA測(cè)定也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)進(jìn)行，優(yōu)選通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行。
在其它觀點(diǎn)中，本發(fā)明還提供了篩選提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力的藥物(以下有時(shí)也稱為“UV抵抗強(qiáng)化劑”)的方法。這種方法的特征在于選擇增強(qiáng)SCCA-1和/或SCCA-2表達(dá)的藥物作為UV抵抗強(qiáng)化劑。
通過本發(fā)明，使得提供提高皮膚的UV抵抗力的方法、提供檢測(cè)皮膚的UV抵抗力的方法以及提供新型的UV抵抗強(qiáng)化劑成為可能。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示在露光和非露光部位的表皮中SCCA的表達(dá)。
圖2表示由UV照射引起的表皮中SCCA表達(dá)的變化。
圖3表示培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞中UV照射對(duì)SCCA表達(dá)的影響。
圖4表示對(duì)SCCA高表達(dá)細(xì)胞與不表達(dá)SCCA細(xì)胞，比較由UV照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡率。
圖5表示SCCA敲低細(xì)胞株的建立。
圖6表示SCCA敲低細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的由UV照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡率的比較。
用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式如上所述，沒有啟示SCCA與紫外線照射之間存在關(guān)系的報(bào)告，SCCA能夠抑制紫外線誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的令人驚奇的事實(shí)。
在第一觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了通過使表皮細(xì)胞的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)，抑制表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，尤其是抑制由紫外線照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的方法。通過該方法，可以提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的發(fā)病的抵抗力。
SCCA是存在于如上所述的子宮等的扁平上皮癌細(xì)胞和牛皮癬表皮中的分子量約為45,000的蛋白質(zhì)。SCCA-1和/或SCCA-2的氨基酸序列及編碼其的核酸序列記載于Takeda A等人，J.Invest.Dermatol.118，147-154(2002)(前述)。表皮細(xì)胞的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)可以通過例如應(yīng)用使之表達(dá)增強(qiáng)的藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)。作為藥物，還可以使用SCCA-1和/或SCCA-2自身。
被檢驗(yàn)者中編碼SCCA-1和/或SCCA-2的基因以非活性狀態(tài)和沉默狀態(tài)存在，其結(jié)果是細(xì)胞處于SCCA-1和/或SCCA-2缺損狀態(tài)時(shí)，通過在表皮細(xì)胞中導(dǎo)入SCCA-1和/或SCCA-2基因本身，或者將提高SCCA-1和/或SCCA-2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子置于對(duì)SCCA-1和/或SCCA-2基因可起作用的位置，也可以實(shí)現(xiàn)其表達(dá)的增強(qiáng)。
作為在細(xì)胞中導(dǎo)入編碼SCCA-1和/或SCCA-2的基因的方法，可以應(yīng)用利用病毒載體的基因?qū)敕椒?，或者非病毒性的基因?qū)敕椒?日經(jīng)Science，1994年4月號(hào)，第20-45頁(yè)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，12(15)(1994)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊(cè)《基因治療的基礎(chǔ)技術(shù)》，羊土社(1996))的任一種方法。作為通過病毒載體導(dǎo)入基因的方法，可以例舉有向逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，皰疹病毒，牛痘病毒，痘病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒和辛德比斯病毒等DNA病毒或者RNA病毒中整合導(dǎo)入編碼SCCA-1和/或SCCA-2的DNA的方法。其中特別優(yōu)選的是使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，牛痘病毒的方法。非病毒性的基因?qū)敕椒?，可以例舉有直接向肌肉中施與表達(dá)質(zhì)粒的方法(DNA疫苗法)，脂質(zhì)體法，Lipofectin法，顯微注射法，磷酸鈣法，電穿孔法等，尤為優(yōu)選的是DNA疫苗法，脂質(zhì)體法。此外，在使上述基因?qū)嶋H上作為藥物作用時(shí)，有以下兩種方法將DNA直接導(dǎo)入體內(nèi)的體內(nèi)(in vivo)法，以及從人體取出某種細(xì)胞，然后在體外將DNA導(dǎo)入到該細(xì)胞中，再將該細(xì)胞返回到體內(nèi)的離體法(ex vivo)(日經(jīng)Science，1994年4月號(hào)，第20-45頁(yè)，月刊藥事，36(1)，23-48(1994)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，12(15)(1994))。更為優(yōu)選的是體內(nèi)法。通過體內(nèi)法施與時(shí)，可以根據(jù)疾病，癥狀等通過適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給藥。例如，可以在靜脈，動(dòng)脈，皮下，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)等處給藥。通過體內(nèi)法給藥時(shí)，一般而言可以制成注射劑，根據(jù)需要還可以添加常用的載體。此外，在制成脂質(zhì)體或膜融合脂質(zhì)體(仙臺(tái)病毒(HVJ)-脂質(zhì)體)的形態(tài)時(shí)，可以制成懸浮劑，冷凍劑，離心分離冷凍劑等脂質(zhì)體制劑。
在第二觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)皮膚的UV抵抗力的皮膚檢測(cè)方法。這種方法的特征在于，當(dāng)表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)比表皮細(xì)胞的表達(dá)低時(shí)，判斷為表皮的UV抵抗力弱。
作為這種評(píng)價(jià)基準(zhǔn)，可以是例如，如果表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)比對(duì)照值低10％或10％以上，或低20％或20％以上，或低30％或30％以上，或低50％或50％以上，或低70％或70％以上，或低100％，就判斷為“皮膚的UV抵抗力弱”。作為對(duì)照值，可以是例如統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著數(shù)量(例如，10或10人以上，優(yōu)選100或100人以上)的正常人的對(duì)應(yīng)部位中表皮細(xì)胞的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)量的平均值。
可以通過例如直接測(cè)定表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的量確定表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的增強(qiáng)。優(yōu)選的是，可以利用抗SCCA-1和/或SCCA-2的特異性抗體，通過本領(lǐng)域中公知的方法例如利用熒光物質(zhì)、色素、酶等的免疫染色法，Western印跡法，例如ELISA法、RIA法這樣的免疫測(cè)定法等多種方法實(shí)施。此外，也可以通過自皮膚提取RNA，測(cè)定編碼SCCA-1和/或SCCA-2的mRNA量進(jìn)行確定。mRNA的提取、mRNA量的測(cè)定也是本領(lǐng)域中公知的，例如RNA的定量可以通過定量多聚酶鏈反應(yīng)法(PCR)進(jìn)行。除此之外，也可以通過測(cè)定SCCA-1和/或SCCA-2已知的生物活性測(cè)定SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)量。此外，可以通過原位雜交法和其生物活性的測(cè)定確定SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)而還提供了一種篩選提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力的UV抵抗強(qiáng)化劑的方法。這種方法的特征在于選擇增強(qiáng)SCCA-1和/或SCCA-2表達(dá)的藥物作為UV抵抗強(qiáng)化劑。SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)的增強(qiáng)可以通過如上所述的細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2量的測(cè)定，從表皮細(xì)胞中提取的編碼SCCA-1和/或SCCA-2的mRNA量的測(cè)定等實(shí)施。
在合適的方案中，上述的篩選方法進(jìn)一步包括，將具有上述增強(qiáng)能力的候選藥物給藥于模型動(dòng)物，優(yōu)選SCCA-1和/或SCCA-2缺損動(dòng)物，選擇強(qiáng)化UV抵抗力的候選藥物。
可以通過例如研究由于對(duì)表皮細(xì)胞照射紫外線而被誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的抑制活性進(jìn)行表皮細(xì)胞的UV抵抗力的評(píng)價(jià)。程序性細(xì)胞死亡的評(píng)價(jià)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實(shí)施。例如，使用FACSCOULTER(EPIX XL-MCL，Beckman Coulter)，通過以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法(Annexin V-FITC試劑盒，Immunotech)作為指標(biāo)的FACS(熒光活性細(xì)胞分選)分析進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)。作為這種評(píng)價(jià)基準(zhǔn)，可以是例如，如果表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡抑制30％或30％以上，優(yōu)選50％或50％以上，更優(yōu)選70％或70％以上，最優(yōu)選90％或90％以上，就判斷為“提高皮膚的UV抵抗力”。
下面，通過列舉具體實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明。并且，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例免疫組織化學(xué)檢查按照AmeX步驟(Sato Y等人，Am.J.Pathol.，125，431-435(1986))，用冷丙酮固定表皮活組織檢查后包埋于石蠟中。用二甲苯脫石蠟處理切片，用丙酮，然后用PBS洗滌。然后，用10％正常山羊血清(Histofine，東京，日本)封閉該切片的非特異性結(jié)合部位。
將表皮切片分別與抗SCCA-1單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)(稀釋為1∶500)、抗SCCA-2單克隆抗體(Santa CruzBiotechnology，CA，USA)(稀釋為1∶500)或抗SCCA多克隆抗體(如TakedaA.等人，J，Invest.Dermatol.118，147-154(2002)中記載的方式純化)溫育。用PBS洗滌后，用蘇木精復(fù)染切片后，用DAKO.Envision System(DAKOCorp.，CA，USA)進(jìn)行觀察。
圖1是收集由非露光部位上臂部位(人24歲)，臀部(人46歲)，大腿部位(人75歲)獲得的表皮，以及由露光部位頰部(人20歲，76歲)，眼瞼(人82歲)獲得的表皮作為表皮樣本，使用與SCCA-1和SCCA-2二者結(jié)合的抗SCCA多克隆抗體作為抗體，顯微鏡觀察的結(jié)果。根據(jù)圖1，表明了與非露光部位相比，露光部位的表皮上層中SCCA顯著增強(qiáng)。但是，即使在露光部位，也沒有發(fā)現(xiàn)基底層中SCCA表達(dá)的增強(qiáng)。
圖2是作為表皮樣本，對(duì)實(shí)施了UV照射(使用transluminater-TOREXFL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply))，以2MED(最小紅斑劑量)的照射量照射)的人表皮和沒有實(shí)施照射的對(duì)照表皮中各自的SCCA-1和SCCA-2的表達(dá)的顯微鏡觀察結(jié)果。分別使用抗SCCA-1單克隆抗體，抗SCCA-2單克隆抗體作為抗體。根據(jù)圖2，清楚了通過對(duì)人表皮照射UV，使SCCA-1和SCCA-2的表達(dá)均被增強(qiáng)。此外，在表皮棘層和顆粒層表達(dá)的增強(qiáng)顯著。
根據(jù)上述內(nèi)容，清楚了如果表皮受到UV照射，在表皮中，尤其是在其棘層和顆粒層中SCCA-1和SCCA-2的表達(dá)被增強(qiáng)。
定量PCR實(shí)驗(yàn)接著，進(jìn)行基因水平確認(rèn)表皮中SCCA-1和SCCA-2的表達(dá)由于UV照射而被增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)。
在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基(GIBCO，Invitrogen)中，在L-谷氨酰胺和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在下，在高濕度，5％CO2環(huán)境下，于37℃培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞，對(duì)集密度為60-70％的細(xì)胞連續(xù)照射UVB 0-48小時(shí)。使用transluminater-TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)，以30mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。不對(duì)對(duì)照細(xì)胞實(shí)施UVB照射。
使用Isogen(Nippon Gene)按照所附的說(shuō)明書，從上述培養(yǎng)細(xì)胞中分離純化總RNA。通過定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)確定SCCA-1和SCCA-2各自的表達(dá)水平。簡(jiǎn)而言之，用Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，CA)使總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。用ABI PRISM 7900HT測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)，進(jìn)行40個(gè)2-步驟PCR循環(huán)，使所述試樣擴(kuò)增。使用G3PDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
使用的引物如下所示。
SCCA-1正向引物5′-GTGCTATCTGGAGTCCT-3′(序列號(hào)1)反向引物5′-CTGTTGTTGCCAGCAA-3′(序列號(hào)2)Taq Man探針
5′-CATCACCTACTTCAACT-3′(序列號(hào)3)SCCA-2正向引物5′-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3′(序列號(hào)4)反向引物5′-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3′(序列號(hào)5)Taq Man探針5′-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3′(序列號(hào)6)G3PDH正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(序列號(hào)7)反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′(序列號(hào)8)Taq Man探針5′-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3′(序列號(hào)9)使報(bào)告色素(6-羧基-熒光素)與Taq Man探針序列的5’端結(jié)合，然后使淬火色素(6-羧基-四甲基-羅丹明)整合到其3’端。
圖3中顯示了UVB照射對(duì)培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞中SCCA表達(dá)的影響的結(jié)果。表明SCCA-1，SCCA-2均由于UVB照射而表達(dá)被增強(qiáng)。因此，清楚了表皮細(xì)胞由于UV照射，在基因水平上SCCA-1，SCCA-2的表達(dá)被增強(qiáng)。
研究UV照射中SCCA的作用根據(jù)上述內(nèi)容，清楚了在表皮細(xì)胞中由于受到UV照射，SCCA-1和SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)。然后，研究了SCCA-1和SCCA-2在受UV照射的表皮細(xì)胞中起什么作用。
SCCA-1和2高表達(dá)細(xì)胞的建立3T3細(xì)胞(由ATCC獲得)是不表達(dá)SCCA-1和2的小鼠胎兒來(lái)源的細(xì)胞。以如下所述方式將編碼SCCA-1或2的基因?qū)氲竭@種細(xì)胞中。
用Bam HI和Kpn I雙重消化SCCA-1和2的cDNA(Takeda A等人，J.Invest.Dermatol.118，147-154(2002))。將其亞克隆到pTarget載體中，然后用Lipofectamine Plus(GIBCO，Invitrogen Corp.)導(dǎo)入到3T3細(xì)胞中。簡(jiǎn)而言之，將675μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen Corp.)中的20μgcDNA與75μl的Plus試劑混合，于25℃放置15分鐘。向650μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中添加Lipofectamine(100μl)，然后將其加入到上述cDNA-Plus混合物中，然后于25℃放置15分鐘。將該cDNA混合物添加到10ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，然后于37℃，5％CO2環(huán)境下在其中培養(yǎng)3T3細(xì)胞4小時(shí)。將該培養(yǎng)基換成含有10％FCS(Invitrogen Corp.)的DMEM培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)過夜。第二天，以500μg/ml的終濃度添加G418(Calbiochem)。培養(yǎng)期間G418保持在該濃度。每2-3天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)4周后，可以分離出若干G418抗性克隆，建立SCCA-1和SCCA-2表達(dá)細(xì)胞系。
確認(rèn)導(dǎo)入了編碼SCCA-1的cDNA的細(xì)胞(SCCA-1導(dǎo)入細(xì)胞)特異且穩(wěn)定地表達(dá)SCCA-1，并確認(rèn)導(dǎo)入了編碼SCCA-2的cDNA的細(xì)胞(SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞)特異且穩(wěn)定地表達(dá)SCCA-2。此外，通過同樣的操作導(dǎo)入了非特異性序列的3T3細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)既不表達(dá)SCCA-1，也不表達(dá)SCCA-2。
采用上述SCCA-1導(dǎo)入細(xì)胞、SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，對(duì)施加UV照射時(shí)的SCCA-1、SCCA-2所產(chǎn)生的作用進(jìn)行研究。具體而言，研究了SCCA-1、SCCA-2對(duì)于表皮細(xì)胞中UV誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的作用。
在含有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中，在高濕度、5％CO2環(huán)境下，于37℃培養(yǎng)上述各種細(xì)胞。對(duì)集密度為60-70％的細(xì)胞連續(xù)照射UVB 0-48小時(shí)。使用transluminater-TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba MedicalSupply)，以30mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。
對(duì)于這些細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)，使用FACS COULTER(EPIXXL-MCL，Beckman Coulter)，通過以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法(Annexin V-FITC試劑盒，Immunotech)作為指標(biāo)的FACS(熒光活性細(xì)胞分選)分析進(jìn)行。
結(jié)果如圖4所示。如圖4清楚所示，SCCA-1和SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)因UV照射引起的程序性細(xì)胞死亡顯著減少。因此，推定SCCA-1和SCCA-2均能夠抑制由UV誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。
為了確認(rèn)這一點(diǎn)，本發(fā)明人接下來(lái)通過RNA干涉法建立SCCA-1和SCCA-2敲低的細(xì)胞株，進(jìn)而對(duì)于表皮細(xì)胞內(nèi)的SCCA-1和SCCA-2在UV照射中的作用進(jìn)行研究。
建立SCCA敲低的細(xì)胞HaCat細(xì)胞(H.Hans.等人，Experimental Cell Research 239，399-410(1998))是高表達(dá)SCCA的人角質(zhì)形成細(xì)胞。通過按照RNA干涉法，以pSilencer載體使siRNA(小干擾性RNA)在這種細(xì)胞中恒定表達(dá)，建立SCCA-1和2敲低的細(xì)胞株。
采用pSilencer載體，按照所附說(shuō)明書構(gòu)建siRNA。詳細(xì)的是，將這樣的雙鏈寡核苷酸克隆入pSilencer載體的Hind III部位和BamH I部位，所述雙鏈寡核苷酸由含有與編碼SCCA的基因中第46-66位核苷酸互補(bǔ)的21mer寡核苷酸(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T序列號(hào)10)的65mer有義寡核苷酸(序列號(hào)11)和含有與第46-66位核苷酸同源的21mer寡核苷酸(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T序列號(hào)12)的65mer反義寡核苷酸(序列號(hào)13)組成。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，按照附說(shuō)明書進(jìn)行對(duì)HaCat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。使用這樣的雙鏈寡核苷酸制備對(duì)照細(xì)胞，所述雙鏈寡核苷酸由與哺乳動(dòng)物的基因序列具有顯著同源性、互補(bǔ)性的兩條寡核苷酸組成。在潮霉素B選擇培養(yǎng)基中對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)4-6周，進(jìn)行選擇從而獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。為了確認(rèn)SCCA的表達(dá)是否受到抑制，以上述方式，通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)定SCCA-1和SCCA-2的表達(dá)。
有義寡核苷酸(序列號(hào)11)GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGAACATGAACTTGGTGTTGGCTTTTTTGGAAA(下劃線是同源區(qū)域)反義寡核苷酸(序列號(hào)13)AGCTTTTCCAAAAAAGCCAACACCAAGTTCATGTTCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG(下劃線是互補(bǔ)性區(qū)域)結(jié)果如圖5所示。導(dǎo)入了上述siRNA的細(xì)胞中，確認(rèn)了與對(duì)照細(xì)胞相比，SCCA-1和2的表達(dá)均被抑制(敲低)90％及90％以上。
使用上述敲低細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，對(duì)于SCCA-1和2對(duì)表皮細(xì)胞中的UV誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的作用進(jìn)行研究。
在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基中(GIBCO，Invitrogen)，在L-谷氨酰胺和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在下，在高濕度，5％CO2環(huán)境下，于37℃培養(yǎng)上述各種細(xì)胞。對(duì)集密度為60-70％的細(xì)胞照射UVB。使用transluminater-TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)，以75mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。
使用FACS COULTER，通過以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法作為指標(biāo)的FACS(熒光活性細(xì)胞分選)分析進(jìn)行對(duì)于這些細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)。
結(jié)果如圖6所示。對(duì)敲低細(xì)胞進(jìn)行UV照射，結(jié)果表明與對(duì)照細(xì)胞中38％的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡相對(duì)，敲低細(xì)胞中約80％的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。因此，清楚了SCCA顯著抑制由UV照射誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。因此，我們認(rèn)為SCCA承擔(dān)著表皮細(xì)胞的UV防御機(jī)制。
序列表<110>株式會(huì)社資生堂<120>紫外線誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的抑制方法<130>1034468<140>JP 2004-087051<141>2004-03-24<160>13<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>1gtgctatctg gagtcct17<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>2ctgttgttgc cagcaa 16<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<223>Taq Man探針<400>3catcacctac ttcaact 17<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>4ctctgcttcc tctaggaac acag 24<210>5<211>20
<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>5tgttggcgat cttcagctca 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>Taq Man探針<400>6agttccagat cacatcgagt t21<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>7gaaggtgaag gtcggagtc 19<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>8gaagatggtg atgggatttc 20<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>Taq Man探針<400>9aggctgagaa cgggaagctt gt 22<210>10<211>21<212>DNA
<213>人工序列<223>SiRNA靶序列<400>10acatgaactt ggtgttggct t21<210>11<211>65<212>DNA<213>人工序列<223>SiRNA的有義寡核苷酸<400>11gatcccggcc aacaccaagt tcatgtttca agagaacatg aacttggtgt tggctttttt 60ggaaa 65<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>SiRNA靶序列<400>12aagccaacac caagttcatg t21<210>13<211>65<212>DNA<213>人工序列<223>SiRNA的反義寡核苷酸<400>13agcttttcca aaaaagccaa caccaagttc atgttctctt gaaacatgaa cttggtgttg 60gccgg 6權(quán)利要求
1.通過增強(qiáng)表皮細(xì)胞的SCCA-1和/或-2的表達(dá)而抑制表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的方法。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述程序性細(xì)胞死亡是由紫外線照射誘導(dǎo)的，而且通過前述方法提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的發(fā)病的抵抗力。
3.評(píng)價(jià)皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力的皮膚檢查方法，其特征在于測(cè)定表皮細(xì)胞中的SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)，將與表皮細(xì)胞中的表達(dá)相比表達(dá)降低的情況，判斷為表皮的UV抵抗力弱。
4.權(quán)利要求3所述的檢查方法，其利用分別抗SCCA-1和/SCCA-2的特異性抗體，通過ELISA法或者RIA法測(cè)定SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)。
5.權(quán)利要求3所述的檢查方法，其通過測(cè)定從表皮細(xì)胞提取的編碼SCCA-1和/或SCCA-2的mRNA而測(cè)定SCCA-1和/或SCCA-2的表達(dá)。
6.篩選提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力的藥物的方法，其特征在于選擇增強(qiáng)SCCA-1和/或SCCA-2表達(dá)的藥物作為UV抵抗強(qiáng)化劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過增強(qiáng)表皮細(xì)胞的SCCA－1和/或－2的表達(dá)，抑制表皮細(xì)胞的紫外線照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的發(fā)病的抵抗力的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力的皮膚檢查方法，特征在于測(cè)定表皮細(xì)胞中的SCCA－1和/或－2的表達(dá)，將與表皮細(xì)胞中的表達(dá)相比表達(dá)降低的情況，判斷為表皮的UV抵抗力弱。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了篩選提高皮膚對(duì)由紫外線照射引起的皮膚損傷的抵抗力的藥物的方法，其特征在于選擇增強(qiáng)SCCA－1和/或－2表達(dá)的藥物作為UV抵抗強(qiáng)化劑。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1925872SQ200580006470
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者片桐千華, 日比野利彥 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂