生物人工過(guò)濾器官的制作方法【專利摘要】通過(guò)在負(fù)壓環(huán)境中用內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞、以及用上皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞祖細(xì)胞對(duì)支架進(jìn)行再接種，可由器官支架制造生物人工過(guò)濾器官。所述負(fù)壓促進(jìn)了對(duì)所述支架進(jìn)行更大程度的再接種?！緦＠f(shuō)明】生物人工過(guò)濾器官[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用[0002]根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/635,043(2012年4月18日提交）的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將其整體內(nèi)容并入本文。[0003]政府支持[0004]本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的合同DP20D008749-01的美國(guó)政府支持下作出的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明擁有一定的權(quán)利?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0005]本發(fā)明針對(duì)生物人工過(guò)濾器官（bioartificialfiltrationorgan)和用于制造該器官的方法和系統(tǒng)。更具體而言，本發(fā)明針對(duì)生物人工過(guò)濾器官及其制造方法，所述生物人工過(guò)濾器官例如為腎和肝型器官?！?br>背景技術(shù)：
】[0006]在美國(guó)，有近一百萬(wàn)終末期腎?。‥SRD)患者，且每年新發(fā)病例超過(guò)100,000例（（CDC),C.f.D.C.a.P.Nationalchronickidneydiseasefactsheet:generalinformationandnationalestimatesonchronickidneydiseaseintheUnitedStates,2010.(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(HHS),CDC,Atlanta,GA,2010))。盡管血液透析提高了終末期腎病（ESRD)患者的存活率，然而移植仍然是唯一可行的有效治療。在美國(guó)，每年進(jìn)行約18,000例腎移植，然而目前仍有近10萬(wàn)美國(guó)人在等待供體腎（0PTN:0rganProcurementandTransplantationNetworkWebsite,Vol.2012)。不斷上升的患者需求與停滯的供體器官數(shù)量導(dǎo)致了取決于診斷，平均等候時(shí)間超過(guò)三年、等待名單死亡率達(dá)到5-10%。盡管腎移植免疫學(xué)有所進(jìn)展（Kawai，T?等，HLA-mismatchedrenaltransplantationwithoutmaintenanceimmunosuppression.NEnglJMed358,353-361(2008))，仍有20%的接受者在移植5年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)急性排異反應(yīng)，并且約40%的接受移植（尸體供體移植體（deceased-donorgrafts))個(gè)體在接受移植后的十年內(nèi)死亡或喪失移植體功能。通過(guò)在需要時(shí)提供移植體以避免在ESRD中對(duì)長(zhǎng)期血液透析的需要，建立自體（autologous)生物工程化腎理論上可以繞開(kāi)這些問(wèn)題。[0007]腎執(zhí)行過(guò)濾、分泌、吸收和合成功能，從而維持體液內(nèi)穩(wěn)態(tài)和電解質(zhì)平衡，并清除代謝物和毒素。血液過(guò)濾和血液透析使用無(wú)細(xì)胞半透膜來(lái)替代部分（但并非全部）上述功能。已對(duì)生物工程化的活（Viable)管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了若干嘗試，以為血液過(guò)濾補(bǔ)充細(xì)胞依賴性功能（Humes，H.D.，Krauss，J.C.，Cieslinski，D.A.&Funke，A.J.，Tubulogenesisfromisolatedsinglecellsofadultmammaliankidney:clonalanalysiswitharecombinantretrovirus.TheAmericanjournalofphysiology271,F42-49(1996)；Humes,H.D.,MacKay,S.M.,Funke,A.J.&Buffington,D.A.,Tissueengineeringofabioartificialrenaltubuleassistdevice:invitrotransportandmetaboliccharacteristics.Kidneyinternational55,2502-2514(1999))。當(dāng)將血液過(guò)濾裝置與生物工程化腎小管結(jié)合時(shí)，所得到的生物人工腎（BAK)替代了患尿毒癥的犬中的腎功能（Humes，H.D.，Buffington，D.A.，MacKay，S.M.，F(xiàn)unke，A.J.&Weitzel，W.F.,Replacementofrenalfunctioninuremicanimalswithatissue-engineeredkidney.NatBiotechnol17,451-455(1999))，并暫時(shí)改善了急性腎衰竭患者的腎功能(Humes,H.D.等，InitialclinicalresultsofthebioartificialkidneycontaininghumancellsinICUpatientswithacuterenalfailure.Kidneyinternational66,1578-1588(2004)；Humes,H.D.,ffeitzel,ff.F.&Fissell,ff.H.,Renalcelltherapyinthetreatmentofpatientswithacuteandchronicrenalfailure.BloodPurif22,60-72(2004))。在另一方法中，當(dāng)移植到無(wú)腎大鼠中時(shí)，腎原基（kidneyprimordia)已顯示出在體內(nèi)發(fā)育為功能性器官并延長(zhǎng)了壽命（Rogers,S.A.&Hammerman，M.R.，Prolongationoflifeinanephricratsfollowingdenovorenalorganogenesis.OrganogenesisI，22-25(2004))。使得腎輔助設(shè)備更便攜（Gura，V.，Macy，A.S.，Beizai，M.，Ezon，C.&Golper,T.A.,Technicalbreakthroughsinthewearableartificialkidney(WAK),(：11111八1115〇〇他口111'〇14，1441-1448(2009))、或甚至是可植入（卩188611，111.&1?〇7,5.，Theimplantableartificialkidney，SeminDial22,665-670(2009))的設(shè)備已經(jīng)達(dá)到了臨床前評(píng)估階段，并為改善末期腎衰竭患者的生活質(zhì)量保留了極大希望。開(kāi)發(fā)完全可植入的永久移植體的一個(gè)關(guān)鍵步驟在于開(kāi)發(fā)支架材料，所述支架材料促進(jìn)過(guò)濾和重吸收、支持從接種（seeded)細(xì)胞再生為功能性組織、并且允許經(jīng)由血液灌注的完全接受者整合?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明針對(duì)用于制造生物人工過(guò)濾器官（例如腎或肝）的方法和系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)尸體的（cadaveric)全器官進(jìn)行脫細(xì)胞（decellularized)，從而制造細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架?？赏ㄟ^(guò)用內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞進(jìn)行接種來(lái)對(duì)ECM支架進(jìn)行再殖（r印opulate)。根據(jù)本發(fā)明，接種可以通過(guò)經(jīng)腎動(dòng)脈灌注內(nèi)皮細(xì)胞（例如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC))和經(jīng)輸尿管滴注懸浮的新生兒腎細(xì)胞（NKC)來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一些實(shí)施方式，可在接種室中進(jìn)行細(xì)胞遞送，所述接種室在接種期間為ECM支架提供受控的壓力和溫度。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)ECM支架施加0?80cmH2O范圍內(nèi)的環(huán)境真空作用，從而在支架上產(chǎn)生跨腎(transrenal)壓力梯度。接種步驟可進(jìn)行至腎構(gòu)建體變得穩(wěn)定，然后可將器官轉(zhuǎn)移到灌注生物反應(yīng)器，以提供全器官培養(yǎng)條件，以將器官培養(yǎng)至進(jìn)一步成熟的水平。[0009]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可在接種系統(tǒng)中對(duì)脫細(xì)胞的全器官進(jìn)行接種。接種系統(tǒng)可包含第一室，所述第一室可適于將ECM支架支持或懸掛在第一室的底部表面上方，并為ECM支架的細(xì)胞接種提供受控的壓力和/或溫度。可提供真空泵和壓力傳感器，使得能夠例如使用專用控制器或編程計(jì)算機(jī)對(duì)第一室內(nèi)的環(huán)境壓力進(jìn)行控制。[0010]可將ECM支架的腎動(dòng)脈連接至配置為含有動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液的細(xì)胞儲(chǔ)液池(reservoir)，所述動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液可在受控的壓力下被泵入腎動(dòng)脈中?？蓪毫鞲衅鬟B結(jié)至將動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞供給至腎動(dòng)脈中的管線（tube)，并可將傳感器輸出連接至控制器或編程計(jì)算機(jī)，所述控制器或編程計(jì)算機(jī)控制泵的運(yùn)行，從而控制進(jìn)入腎動(dòng)脈的壓力?？蓪CM支架的輸尿管連接至配置為含有上皮細(xì)胞懸液的細(xì)胞儲(chǔ)液池，所述上皮細(xì)胞懸液可在受控的壓力下被泵入輸尿管中?？蓪毫鞲衅鬟B結(jié)至將上皮細(xì)胞供給至輸尿管中的管線，并可將傳感器輸出連接至控制器或編程計(jì)算機(jī)，所述控制器或編程計(jì)算機(jī)控制泵的運(yùn)行，從而控制進(jìn)入輸尿管的壓力。可將ECM支架的腎靜脈連接至配置為含有靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液的細(xì)胞儲(chǔ)液池，所述靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液可在受控的壓力下被泵入腎靜脈中?？蓪毫鞲衅鬟B結(jié)至將靜脈內(nèi)皮細(xì)胞供給至腎靜脈中的管線，并可將傳感器輸出連接至控制器或編程計(jì)算機(jī)，所述控制器或編程計(jì)算機(jī)控制泵的運(yùn)行，從而控制進(jìn)入腎靜脈的壓力。[0011]還可將第一室、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液、上皮細(xì)胞懸液和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液保持在溫度受控的環(huán)境中。根據(jù)一些實(shí)施方式，可將第一室、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液、上皮細(xì)胞懸液和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液包含于第二室中，所述第二室包含連接至控制器或編程計(jì)算機(jī)的加熱元件和溫度傳感器。溫度傳感器允許控制器或編程計(jì)算機(jī)監(jiān)控細(xì)胞接種環(huán)境的溫度，并對(duì)加熱元件進(jìn)行控制，從而控制細(xì)胞接種環(huán)境溫度。[0012]根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，可使用脫細(xì)胞肺支架形成生物人工腎。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，可使用脫細(xì)胞肺支架形成生物人工肝。[0013]根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，形成的人工ECM支架在接種后可制造生物工程化腎，所述生物工程化腎提供了在血管腔（vascularspace)和泌尿管腔（urinaryspace)之間的逆流過(guò)濾（counter-currentfiltration)。在該實(shí)施方式中，血管結(jié)構(gòu)以預(yù)定構(gòu)造形成，其提供第一方向的流動(dòng)；泌尿管提供相反方向的逆流流動(dòng)，從而引起溶質(zhì)和水從血管轉(zhuǎn)移至泌尿管。[0014]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，可提供如下一種或多種功能。在一些實(shí)施方式中，提供了基于將兩種以上細(xì)胞類型引入脫細(xì)胞基質(zhì)來(lái)制造生物人工過(guò)濾全器官的方法。該方法可以包括在脫細(xì)胞器官支架上施加真空壓力梯度，以促進(jìn)上皮細(xì)胞有效進(jìn)入具有盲端的（blind-ended)生物過(guò)濾區(qū)室（compartment)。類似地，提供了通過(guò)將兩種以上細(xì)胞類型引入脫細(xì)胞基質(zhì)而制造的生物人工過(guò)濾全器官。細(xì)胞類型包括再接種（re-seeds)和重構(gòu)（re-constitutes)器官的功能性血管腔的至少一種內(nèi)皮細(xì)胞類型或祖細(xì)胞；以及再接種和重構(gòu)功能性上皮生物過(guò)濾區(qū)室的至少一種上皮細(xì)胞類型或其祖細(xì)胞，血液流過(guò)(transits)血管腔時(shí)，所述生物過(guò)濾區(qū)室與血液供給交界。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明使得能夠在生物人工構(gòu)建體中進(jìn)行過(guò)濾和重吸收。在一些實(shí)施方式中，獲得了生物人工腎。在一些實(shí)施方式中，獲得了生物人工肝。在一些實(shí)施方式中，提供了用于制備執(zhí)行一種或多種生物過(guò)濾功能的生物人工器官的系統(tǒng)。[0015]閱讀了以下附圖、【具體實(shí)施方式】和所附權(quán)利要求書之后，將更完全地理解本發(fā)明的這些和其它功能以及本發(fā)明本身?！緦＠綀D】【附圖說(shuō)明】[0016]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的細(xì)胞接種系統(tǒng)的示意圖。[0017]圖2A和圖2B示出了根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的來(lái)自脫細(xì)胞肺支架的生物工程化腎的示意圖。[0018]圖3A和圖3B示出了根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的來(lái)自脫細(xì)胞肺支架的生物工程化肝的示意圖。[0019]圖4說(shuō)明了對(duì)完整大鼠腎的灌注脫細(xì)胞。（a)進(jìn)行順行（antegrad)腎動(dòng)脈灌注脫細(xì)胞的尸體大鼠腎的縮時(shí)（timelapse)照片。Ra,腎動(dòng)脈；Rv，腎靜脈；U，輸尿管。新鮮分離的腎（左）；SDS灌注6小時(shí)后（中）；SDS灌注12小時(shí)后（右）。（b)相應(yīng)的灌注脫細(xì)胞期間大鼠腎Movat'sPentachrome染色的代表性切片（黑色箭頭顯示腎小球囊（Bowman'scapsule)，比例尺為250iim)。（c)尸體大鼠腎切片的代表性免疫組化染色，示出彈性蛋白(黑色箭頭指向皮質(zhì)管中膜（tunicamediaofcorticalvessels)的彈性纖維）、IV型膠原和層粘連蛋白（黑色箭頭強(qiáng)調(diào)腎小球基底膜）的分布（比例尺為250i!m，插入圖為40X)。(d)對(duì)彈性蛋白、IV型膠原和層粘連蛋白進(jìn)行免疫組化染色后的相應(yīng)的脫細(xì)胞大鼠腎組織切片，確認(rèn)在無(wú)細(xì)胞狀態(tài)下保留了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（比例尺為250pm，插入圖為40X)。（e)尸體大鼠腎小球的透射電鏡照片（TEM)，示出由腎小球囊（BC)包圍的毛細(xì)血管（C)、系膜基質(zhì)（M)和足細(xì)胞（P)(比例尺為IOiim)。（f)脫細(xì)胞大鼠腎小球的TEM，顯示出脫細(xì)胞腎中無(wú)細(xì)胞（acellularity)而保留由腎小球囊（BC)包封的毛細(xì)血管（C)、系膜基質(zhì)（M)和腎小球囊腔（Bowman'sspace)(比例尺為IOym)。（g-i)對(duì)尸體大鼠腎組織和脫細(xì)胞大鼠腎組織中的DNA、總膠原和硫酸糖胺聚糖的生化定量（平均值土SD，p值由學(xué)生t檢驗(yàn)確定），顯示灌注脫細(xì)胞后DNA含量下降，而保留膠原和糖胺聚糖（ns:不顯著）。（j)尸體大鼠腎和脫細(xì)胞大鼠腎的組織學(xué)橫切片（histologiccrosssections)的形態(tài)測(cè)定分析。脫細(xì)胞腎進(jìn)行脫水并包埋，使得每_2腎小球的數(shù)量明顯增加，腎小球直徑和腎小球囊腔減小。每一橫切片中腎小球的總計(jì)數(shù)在脫細(xì)胞后保持不變。[0020]圖5說(shuō)明了脫細(xì)胞大鼠腎的細(xì)胞接種和全器官培養(yǎng)。（a)細(xì)胞接種裝置的示意圖，所述裝置使得能夠經(jīng)由附接至腎動(dòng)脈（ra)的端口A進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞接種、并經(jīng)由附接至輸尿管（U)的端口B進(jìn)行上皮細(xì)胞接種，同時(shí)器官室中的負(fù)壓施加至端口C，從而產(chǎn)生跨腎壓力梯度。（b)生物反應(yīng)器中全器官培養(yǎng)的示意圖，所述生物反應(yīng)器使得能夠經(jīng)由附接至腎動(dòng)脈(ra)的端口A進(jìn)行組織灌注、并經(jīng)由端口B排出（drainage)至儲(chǔ)液池（u:輸尿管，k:腎）。(c)全器官培養(yǎng)中接種有細(xì)胞的脫細(xì)胞大鼠腎。（d)重新內(nèi)皮化的腎構(gòu)建體的熒光顯微照片。⑶31(紅）和DAPI陽(yáng)性的HUVEC在整個(gè)移植體橫切片的血管樹上排列（圖像重構(gòu)，左偵牝比例尺為500i!m)并形成直至腎小球毛細(xì)血管的單層（右側(cè)圖，白色箭頭指向內(nèi)皮細(xì)胞，比例尺為50i!m)。（e)重新內(nèi)皮化和重新上皮化的腎構(gòu)建體的熒光顯微照片，示出腎小球中表達(dá)podocin(綠色）的細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（0)31陽(yáng)性，紅色）的植入（engraftment)(左側(cè)圖，比例尺為25ym，白色箭頭標(biāo)記腎小球囊，白色星號(hào)標(biāo)記血管極）；腎小管（tubuli)內(nèi)基底側(cè)分布（basolateraldistribution)中的表達(dá)Na/KATPase的細(xì)胞（綠色）的植入，類似于具有適當(dāng)核極性的近端腎小管結(jié)構(gòu)（左中側(cè)圖，比例尺為10Um，T為腎小管，Ptc為腎小管周圍毛細(xì)血管）；腎小管內(nèi)表達(dá)E-鈣粘蛋白（E-cadherin)的細(xì)胞的植入，類似于遠(yuǎn)端腎小管結(jié)構(gòu)（右中側(cè)圖，比例尺為IOum,T為腎小管,Ptc為腎小管周圍毛細(xì)血管）；重新內(nèi)皮化管道（vessel)的3D重構(gòu)導(dǎo)致形成腎小球（白色箭頭標(biāo)記腎小球囊，白色星號(hào)標(biāo)記血管極）。（f)整個(gè)移植體橫切片的圖像重構(gòu)，證實(shí)了表達(dá)podocin的上皮細(xì)胞的植入（比例尺為500ym)。插入圖示出了位點(diǎn)特異性（右上方插入圖）和非特異性（下方插入圖）的細(xì)胞植入。大鼠尸體腎切片的代表性免疫組化染色示出腎小球中的podocin表達(dá)（中間圖，比例尺為50iim)。（g)大鼠尸體腎小球的podocin的免疫組化染色（比例尺為50iim)。(h)再生腎小球中的nephrin表達(dá)（左側(cè)圖）和尸體對(duì)照中的nephrin表達(dá)（右側(cè)圖，比例尺為50ym)。（i)再生近端腎小管結(jié)構(gòu)中的水通道蛋白-Uaquaporin-I)表達(dá)（左側(cè)圖）和尸體對(duì)照中的水通道蛋白-1表達(dá)（右側(cè)圖，比例尺為50ym)。（j)再生近端腎小管上皮細(xì)胞中的Na/KATPase表達(dá)（左側(cè)圖）和尸體對(duì)照中的Na/KATPase表達(dá)（右側(cè)圖，比例尺為50ym)。（k)再生遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞中的E-鈣粘蛋白表達(dá)（左側(cè)圖）和尸體對(duì)照中的E-鈣粘蛋白表達(dá)（右側(cè)圖，比例尺為50i!m)。（1)生物工程化腎構(gòu)建體切片的代表性免疫組化染色，示出腎小球中的￠-1整合素表達(dá)（左側(cè)圖）。（m)再生腎小球的代表性透射電鏡照片，示出帶有紅血細(xì)胞（RBC)的毛細(xì)血管以及沿腎小球基底膜的足突（黑色箭頭）(左側(cè)圖，比例尺為Mm);粘附于腎小球基底膜的足細(xì)胞（P)的透射電鏡照片（黑色箭頭）(右側(cè)圖，比例尺為MnuBC為腎小球囊）。（n)再生腎移植體橫切片中腎小球（白色箭頭）的掃描電鏡照片（血管蒂（vascularpedicle)*，比例尺為IOym)。（〇)尸體大鼠腎和再生大鼠腎組織學(xué)橫切片的形態(tài)測(cè)定分析。在再生腎中，每橫切片的腎小球、平均腎小球直徑和腎小球囊腔保持不變。與尸體腎相比，再生腎中的腎小球毛細(xì)血管腔（lumen)似乎較小，這是由于相比于尸體腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，再生構(gòu)建體中HUVEC的數(shù)量增加。[0021]圖6示出了生物工程化腎構(gòu)建體的體外（invitro)功能。（a)經(jīng)歷體外測(cè)試的生物工程化大鼠腎構(gòu)建體的照片。經(jīng)由插管的（canulated)腎動(dòng)脈（Ra)和腎靜脈（Rv)對(duì)腎進(jìn)行灌注，經(jīng)由輸尿管（U)將尿液排出。白色箭頭標(biāo)出了排出管線（tubing)中的尿液/空氣界面。（b)對(duì)在SOmmHg灌注的脫細(xì)胞腎、尸體腎和再生腎以及在120mmHg灌注的再生腎(再生*)的平均尿液流速（mL/min)進(jìn)行總結(jié)的柱狀圖。脫細(xì)胞腎表現(xiàn)出多尿（polyuric)狀態(tài)，而與尸體腎相比，再生構(gòu)建體相對(duì)少尿。（c)示出在SOmmHg灌注的尸體腎、脫細(xì)胞腎和再生腎以及在120mmHg灌注的再生腎（再生*)的平均肌酐（creatinine)清除的柱狀圖。隨著灌注壓力上升，再生腎中的肌酐清除有所改善。（d)分離的尸體腎（黃色）、脫細(xì)胞腎（藍(lán)色）以及再生腎（橙色）構(gòu)建體的尿分析。組間顯著差異以單因素方差分析和Bonferroni事后修正后獲得的*p〈0.05、**p〈0.01和***p〈0.001列出。溶質(zhì)的駐留(retention)分?jǐn)?shù)（R)、重吸收分?jǐn)?shù)（r)和排泄（excretion)分?jǐn)?shù)（e)以所計(jì)算的過(guò)濾量的百分?jǐn)?shù)表示。（e)示出尸體腎、脫細(xì)胞腎和再生腎的血管阻力（resistance)的柱狀圖，顯示隨著脫細(xì)胞血管阻力有所增加，而在再生腎中部分恢復(fù)。（f)基于組織學(xué)和體外功能測(cè)試結(jié)果的尸體腎、脫細(xì)胞腎和再生腎功能的示意模型。[0022]圖7示出了原位（orthotopic)移植和體內(nèi)（invivo)功能。（a)剖腹術(shù)、左腎切除術(shù)和再生左腎構(gòu)建體原位移植后的大鼠腹膜照片。將接受者的左腎動(dòng)脈（Ra)和左腎靜脈（Rv)連接至再生腎的腎動(dòng)脈和靜脈。再生腎的輸尿管（U)保持插管狀態(tài)，以收集植入后產(chǎn)生的尿液。（b)松開(kāi)（unclamping)左腎動(dòng)脈（Ra)和腎靜脈（Rv)后的移植再生腎構(gòu)建體的照片，示出移植體的均勻灌注，無(wú)出血跡象。（c)移植再生腎的復(fù)合組織學(xué)圖像，確認(rèn)了整個(gè)腎橫切片中的灌注（比例尺為500iim)。（d)更高放大倍數(shù)的再生腎切片，示出血管中的紅細(xì)胞進(jìn)入腎小球，而不存在間質(zhì)（interstitial)出血。[0023]圖8示出了灌注脫細(xì)胞大鼠腎的臺(tái)盼藍(lán)灌注。在經(jīng)由腎動(dòng)脈灌注臺(tái)盼藍(lán)的脫細(xì)胞腎的照片中，強(qiáng)調(diào)了段動(dòng)脈、葉間動(dòng)脈、弓形動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈，表明灌注脫細(xì)胞后保留的血管導(dǎo)管（vascularconduits)?！揪唧w實(shí)施方式】[0024]本發(fā)明針對(duì)用于制造生物人工過(guò)濾器官（例如腎或肝）的方法和系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)尸體腎和肺進(jìn)行脫細(xì)胞，以產(chǎn)生全器官的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)支架。可通過(guò)用內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)支架進(jìn)行接種，對(duì)ECM支架進(jìn)行再殖。根據(jù)本發(fā)明，可在溫度和/或壓力受控的環(huán)境中進(jìn)行接種。[0025]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的細(xì)胞接種系統(tǒng)100的示意圖。細(xì)胞接種系統(tǒng)100可以包含接種室112,接種室112可具有足夠大小，以包封（enclose)待接種的全過(guò)濾器官支架200,并提供受控的壓力環(huán)境。接種室112可包含多個(gè)端口，所述端口使得可將流體（例如氣體和液體）泵入和泵出接種室112。支架200可包含多根管道（vessels)，包括腎動(dòng)脈a、腎靜脈V和輸尿管u，這些管道可用于將細(xì)胞灌注至支架200中。[0026]接種室112可包含壓力控制系統(tǒng)，其包含可連結(jié)至控制器160的真空泵122及壓力傳感器124?？刂破?60可響應(yīng)來(lái)自于壓力傳感器124的信號(hào)（所述信號(hào)表不接種室112內(nèi)部的壓力）而控制真空泵122,從而控制接種室112內(nèi)部的壓力。真空泵122可與穿過(guò)接種室112中的一個(gè)端口的管線相連。控制器160可以是專用壓力控制器，其適于并被配置為控制真空泵122,從而將接種室112中的壓力保持在設(shè)定水平?；蛘?，控制器160可以是編程計(jì)算機(jī)，其將壓力控制在設(shè)定水平、或根據(jù)可隨時(shí)間改變壓力的程序來(lái)控制壓力。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，壓力控制系統(tǒng)可以將接種室112中的壓力保持在Ocm?80cmH2O的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，壓力控制系統(tǒng)可以將接種室112中的壓力保持在IOcm?70cmH2O的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，壓力控制系統(tǒng)可以將接種室112中的壓力保持在20cm?60cmH2O的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，壓力控制系統(tǒng)可以將接種室112中的壓力保持為高于80cmH20?？筛鶕?jù)支架孔隙度和待接種細(xì)胞的性質(zhì)來(lái)確定接種室中保持的壓力。根據(jù)一些實(shí)施方式，可基于待接種在支架中的細(xì)胞數(shù)量，憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定壓力。[0027]可將支架與一個(gè)或多個(gè)提供用于接種的細(xì)胞的儲(chǔ)液池連接。如圖1所示，可為能夠提供進(jìn)入支架200的流路的各管道a、V和u提供單獨(dú)的儲(chǔ)液池。當(dāng)支架200是腎時(shí)，可通過(guò)管線將輸尿管u流路連接至含有上皮細(xì)胞懸液134的儲(chǔ)液池132?？墒褂眠B接至控制器160的泵136以預(yù)定壓力將上皮細(xì)胞懸液134泵入輸尿管u?？蓪⑦B接至控制器160的壓力傳感器138連接至該管線，來(lái)監(jiān)測(cè)泵入支架200的上皮細(xì)胞懸液134的壓力。可通過(guò)管線將支架200的動(dòng)脈管道a連接至含有動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液144的儲(chǔ)液池142?？墒褂眠B接至控制器160的泵146以預(yù)定壓力將動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液144泵入動(dòng)脈a?？蓪⑦B接至控制器160的壓力傳感器148連接至該管線，來(lái)監(jiān)測(cè)泵入支架200的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液144的壓力?？赏ㄟ^(guò)管線將支架200的靜脈管道V連接至含有靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液154的儲(chǔ)液池152。可使用連接至控制器160的泵156以預(yù)定壓力將靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液154泵入靜脈V?？蓪⑦B接至控制器160的壓力傳感器158連接至該管線，來(lái)監(jiān)測(cè)泵入支架200的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液154的壓力。各儲(chǔ)液池132、142和152可包含混合組件（如磁混合器ml、m2、m3和攪拌棒si、s2、s3)，以維持所述懸液。[0028]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，待接種的細(xì)胞的量將取決于器官的大小和性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于支架200而言，每I.0?1.5克支架200的組織可接種約1000萬(wàn)?1億個(gè)上皮細(xì)胞，每I.0?1.5克支架200的組織可接種約1000萬(wàn)?1億個(gè)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并且每I.〇?1.5克支架200的組織可接種約1000萬(wàn)?1億個(gè)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，各儲(chǔ)液池可填充有約50萬(wàn)?500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/cc的溶液。[0029]在接種過(guò)程中，可將接種室112保持在預(yù)定溫度。根據(jù)一些實(shí)施方式，可將接種室112包封在加熱室110中，加熱室110可包含連接至控制機(jī)制的加熱元件116和溫度傳感器118,所述控制機(jī)制對(duì)加熱元件進(jìn)行操作，以將溫度保持在設(shè)定的水平或范圍。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可將溫度傳感器118和加熱元件116連接至控制器120,控制器120可以響應(yīng)來(lái)自溫度傳感器的信號(hào)而對(duì)加熱元件116進(jìn)行控制，從而對(duì)接種室112的溫度進(jìn)行控制。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，加熱室還可包含儲(chǔ)液池132、142和152,從而將細(xì)胞懸液保持在相同溫度。根據(jù)一些實(shí)施方式，在接種過(guò)程中，可將接種室112維持在20°C?40°C的范圍內(nèi)。[0030]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，支架200可來(lái)自提供動(dòng)脈連接、靜脈連接以及第三連接的腎、肺或另一過(guò)濾器官，所述第三連接連接至單獨(dú)通路，為制得的過(guò)濾器官提供過(guò)濾輸出。在腎中，第三連接對(duì)應(yīng)于輸尿管；在肺中，第三連接對(duì)應(yīng)于氣管和氣腔（airspace)。在所建立的器官中，動(dòng)脈連接提供血液流入，靜脈連接提供血液流出，器官內(nèi)的膜或其它結(jié)構(gòu)將至少一種溶質(zhì)和水從血液轉(zhuǎn)移至第三連接。因此，例如，可以由腎支架或肺支架制造生物人工腎。在另一實(shí)例中，可以由腎支架或肺支架制造生物人工肝。[0031]圖2A和圖2B示出來(lái)自脫細(xì)胞肺支架200'的生物工程化腎的示意圖。如圖2A所示，肺支架200'包含動(dòng)脈連接202、靜脈連接204和氣管連接206。通過(guò)用動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種動(dòng)脈連接202,動(dòng)脈連接202將成為腎動(dòng)脈。通過(guò)用靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種靜脈連接204，靜脈連接204將成為腎靜脈；通過(guò)用上皮細(xì)胞接種氣管連接206,氣管連接206將成為輸尿管。圖2B示出了血液流入腎動(dòng)脈202并流出腎靜脈204、而尿液則從先前為肺氣道的氣管206排出的示意圖。[0032]圖3A和圖3B示出來(lái)自脫細(xì)胞肺支架的生物工程化肝的示意圖。如圖3A所示，該支架包含動(dòng)脈連接、靜脈連接和氣管（或支氣管）連接。通過(guò)用動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種動(dòng)脈連接，動(dòng)脈連接將成為肝動(dòng)脈。通過(guò)用靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種靜脈連接，靜脈連接將成為肝靜脈；通過(guò)用上皮細(xì)胞或肝細(xì)胞接種氣管連接，氣管連接將成為肝管。圖3B示出了血液流入肝動(dòng)脈并流出肝靜脈、而膽汁則從先前的肺氣道排出的示意圖。[0033]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，支架可以是三維的全器官支架，該支架包含用于將再接種的器官連接至血液供給的至少一根動(dòng)脈管道和至少一根靜脈管道。在植入后，再接種的器官可經(jīng)由動(dòng)脈管道接收血液并經(jīng)由靜脈管道送回血液。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，過(guò)濾器官至少可部分地發(fā)揮從經(jīng)由連接（connections)流至再接種器官的動(dòng)脈管道和靜脈管道的血液供給中除去濾液的功能。此外,過(guò)濾器官還可以包含接收濾液（例如尿液或膽汁）的區(qū)室或腔，并且包含輸出管道，使得器官能夠通過(guò)與例如動(dòng)物的尿道或消化道的連接而排出濾液。過(guò)濾器官的實(shí)例包括腎和肝，腎的輸出管道是輸尿管，肝的輸出管道是肝管。當(dāng)使用肺支架并接種腎細(xì)胞或肝細(xì)胞時(shí)，氣管或支氣管通道將成為所述輸出管道。[0034]根據(jù)本發(fā)明的一些方法，可通過(guò)對(duì)人和非人的尸體器官（包括例如腎、肺和類似器官）進(jìn)行脫細(xì)胞，來(lái)制造具有完整和可灌注的血管和管狀組件的過(guò)濾器官細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架?？蓹z查ECM支架以確認(rèn)ECM組合物（composition)是完整并保留了微結(jié)構(gòu)(microarchitecture)的?？赏ㄟ^(guò)利用功能性內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞再殖ECM支架，來(lái)制造根據(jù)本發(fā)明的一些生物人工器官。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，例如圖1所示及本文中所描述的，所述再殖可通過(guò)在接種室中對(duì)ECM支架進(jìn)行再接種來(lái)進(jìn)行。再接種后，可通過(guò)動(dòng)脈灌注在體外仿生培養(yǎng)中對(duì)接種的ECM支架進(jìn)行培養(yǎng)，以促進(jìn)功能性腎組織和相關(guān)腎功能（包括過(guò)濾、重吸收和產(chǎn)生尿液）的形成。或者，可通過(guò)移植入宿主體內(nèi)（替換現(xiàn)有器官或在其基礎(chǔ)上增加）來(lái)對(duì)接種的ECM支架進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。[0035]支架脫細(xì)胞[0036]對(duì)腎和肺組織進(jìn)行脫細(xì)胞，以生成適于借助合適的供體細(xì)胞進(jìn)行再接種或再細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)支架，這在本文的實(shí)施例中以及例如以下文獻(xiàn)中有所描述：Mishra等，2012，Ann.Thorac.Surg.93:1〇75_1〇81(肺脫細(xì)胞）；以及Song等，2〇11，Ann.Thorac.Surg.92:998-1005(肺脫細(xì)胞）。也請(qǐng)參見(jiàn)US2009/0202977,以引用的方式將其整體內(nèi)容并入本文，該專利文獻(xiàn)展示了對(duì)許多不同的實(shí)體器官（包括心臟、肝、肺和腎）進(jìn)行的脫細(xì)胞。[0037]用于支架再細(xì)胞化的細(xì)胞：[0038]對(duì)于如本領(lǐng)域中已知的、或是如本文所述的例如來(lái)自供體腎或供體肺的脫細(xì)胞支架，可用血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行再接種，從而重建（re-establish)脫細(xì)胞器官的血管系統(tǒng)；并可用上皮細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行再接種，從而重建功能性上皮。如果滴注腎上皮細(xì)胞，由此產(chǎn)生的生物人工器官可以執(zhí)行帶有尿液輸出的腎過(guò)濾功能。如果例如滴注的是肝上皮細(xì)胞，則該生物人工器官可以執(zhí)行帶有膽汁輸出的肝過(guò)濾功能。在任一情況下，用于對(duì)脫細(xì)胞支架進(jìn)行再細(xì)胞化的細(xì)胞可以來(lái)自于例如供體器官或器官，或者替代地，由干細(xì)胞分化而來(lái)，所述干細(xì)胞可以是例如來(lái)自對(duì)接受者而言是異源供體源或自體的胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。[0039]在一些實(shí)施方式中，可用如本文所述的內(nèi)皮細(xì)胞群和上皮細(xì)胞群對(duì)組織支架（例如脫細(xì)胞腎或肺支架）進(jìn)行接種，所述細(xì)胞群隨后可原位增殖，使得器官完全再殖或再生。也就是說(shuō)，預(yù)期在一些實(shí)施方式中在支架上會(huì)有顯著的細(xì)胞增殖，從而建立功能性器官組織。該增殖通常在將接種的組織支架在如本文所述的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中孵育時(shí)發(fā)生，在所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，例如在大體上（substantially)連續(xù)的流動(dòng)下，用培養(yǎng)基對(duì)血管系統(tǒng)進(jìn)行灌注。若有必要，可通過(guò)向培養(yǎng)基中添加合適的生長(zhǎng)因子來(lái)對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行刺激。例如，可通過(guò)添加VEGF和/或其它生長(zhǎng)因子以及本領(lǐng)域已知的激素來(lái)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖進(jìn)行刺激。可應(yīng)用類似方法、使用適合于所涉及的細(xì)胞類型的因子對(duì)上皮細(xì)胞擴(kuò)增進(jìn)行刺激。對(duì)用于再細(xì)胞化的各種細(xì)胞的制備如下所述。[0040]血管內(nèi)皮細(xì)胞:在一些實(shí)施方式中，可使用從人產(chǎn)后臍帶分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)作為內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞來(lái)源，所述內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞可被擴(kuò)增并用于對(duì)如下文所述的實(shí)施例中的脫細(xì)胞支架的血管系統(tǒng)（vasculature)進(jìn)行接種。這些未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞在本文所述的支架中的適當(dāng)植入和功能表明，甚至可使用相對(duì)未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，并且支架細(xì)胞外基質(zhì)可為細(xì)胞的排列、附著和進(jìn)一步成熟提供輔助（cues)，從而發(fā)揮動(dòng)脈血管內(nèi)皮和靜脈血管內(nèi)皮的功能。[0041]或者，人內(nèi)皮細(xì)胞可來(lái)自成年供體組織。用于對(duì)來(lái)自成體組織的人內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離和大規(guī)模擴(kuò)增的方法在例如以下文獻(xiàn)中有所描述：Hofmann等，2009,J.Vis.Exp.32:el524,題為"IsolationandLargeScaleExpansionofAdultHumanEndothelialColonyFormingProgenitorCells"。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，所述方法包括使用肝素化、但除此之外未經(jīng)其它處理的人外周血作為人內(nèi)皮細(xì)胞集落形成祖細(xì)胞（ECFC)的來(lái)源。Hofmann等的方法非常適合于提供大量尚未在動(dòng)物血清存在下培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞，以及大量在例如皮下引入小鼠模型中時(shí)形成功能性血管結(jié)構(gòu)的人內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞。[0042]作為另一替代,可使用誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞表型的胚胎干（ES)細(xì)胞來(lái)再殖脫細(xì)胞支架的血管腔。鼠科動(dòng)物ES細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞表型在例如以下文獻(xiàn)中有所描述：Darland等，2001，Curr.Top.Dev.Biol.52:107-149;以及Hirashime等，1999，Blood93:1253-1263,以引用的方式將二者整體并入本文。人ES細(xì)胞系分化為功能性血管內(nèi)皮細(xì)胞表型在例如以下文獻(xiàn)中有所描述：Levenberg等，2002,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:4391-4396。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，作者描述了通過(guò)將ES細(xì)胞從其成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層中移出、并以不含LIF和bFGF的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而由培養(yǎng)的ES細(xì)胞制備擬胚體（EB)。在擬胚體內(nèi)自發(fā)分化后，使用標(biāo)記的抗PECAMl抗體，通過(guò)FACS對(duì)解離的EB細(xì)胞進(jìn)行分選。對(duì)PECAMl陽(yáng)性細(xì)胞部分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)額外的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(包括vWF)呈陽(yáng)性、以及N-鈣粘蛋白和VE-鈣粘蛋白細(xì)胞連接（celljunctions)的存在，并且該細(xì)胞攝取乙酰化LDL。證明了當(dāng)移植到SCID小鼠中時(shí)，由此分離的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生功能性血管結(jié)構(gòu)。以這一方式或本領(lǐng)域已知的任何其它方式由ES細(xì)胞或ES細(xì)胞系制得的人內(nèi)皮細(xì)胞提供了用于接種至腎支架或肺支架的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。[0043]用于對(duì)支架血管系統(tǒng)進(jìn)行再細(xì)胞化的內(nèi)皮細(xì)胞的另一替代來(lái)源是由誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。iPS細(xì)胞是來(lái)自于分化細(xì)胞（包括成體分化細(xì)胞）的多能干細(xì)胞，借助一組重編程蛋白因子的表達(dá)將細(xì)胞"重編程"。iPS細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，可從待利用本文所述的生物人工器官進(jìn)行處理的個(gè)體產(chǎn)生多能干細(xì)胞，從而無(wú)需為了避免排異反應(yīng)而提供與供體組織相匹配的組織類型。也就是說(shuō)，iPS細(xì)胞和由其分化而來(lái)的細(xì)胞對(duì)于獲得這些細(xì)胞的個(gè)體的細(xì)胞而言是免疫等同的。iPS細(xì)胞易于培養(yǎng)擴(kuò)增，并具有分化為基本上任何細(xì)胞或組織類型的潛能，從而提供了大量期望類型細(xì)胞的來(lái)源。多能性的誘導(dǎo)最初由Yamanaka及其同事使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)使以下四種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)：KLF4、c-MYC、0CT4和S0X2(KMOS)(Takahashi，K?及S.Yamanaka，Cell,2006.126(4):663-76頁(yè)；丁&1?111&8111，1(.等，〇611，2007.131(5):861-72頁(yè)）。自從該首次發(fā)現(xiàn)起，用于產(chǎn)生1?5細(xì)胞的方法已改進(jìn)并擴(kuò)展至包括所述因子的非逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)；以及包括適用于不同細(xì)胞類型的重編程因子的不同組合（Chang，C.-W?等，StemCells，2009.27(5):1042-1049頁(yè)；Kaji，K?等，Nature，2009.458(7239):771-5頁(yè)；Okita，K?等，Science，2008.322(5903):949-53頁(yè)；Stadtfeld，M?等，Science，2008.322(5903):945-9頁(yè)；Woltjen，K?等，Nature，2009;Yu，J?等，Science，2009:1172482頁(yè)；Fusaki，N?等，ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci，2009.85(8):348-62頁(yè)）。[0044]當(dāng)考慮植入或移植iPS細(xì)胞或其分化后代時(shí)，由于細(xì)胞基因組不因病毒插入而改變，并且細(xì)胞不表達(dá)任何病毒基因，非逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)或者非病毒介導(dǎo)的重編程方法的進(jìn)展提供了安全性優(yōu)點(diǎn)。已使用無(wú)核酸方法產(chǎn)生了人多能干細(xì)胞，所述方法包括使用帶有細(xì)胞穿透肽部分的重組蛋白進(jìn)行連續(xù)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)（Kim,D.等，CellStemCell，2009.4(6):472-476頁(yè)；Zhou，H?等，CellStemCell，2009.4(5):381-4頁(yè)）。最近，由Rossi及其同事描述了一種基于核酸的方法，該方法導(dǎo)入經(jīng)修飾的編碼重編程因子的RNA(參見(jiàn)例如US2012/0046346)。由于所引入的RNA并不修改細(xì)胞基因組并自然降解，該方法既適于產(chǎn)生將被用于制備用于移植的分化細(xì)胞的iPS細(xì)胞，又適于在隨后引入促進(jìn)iPS細(xì)胞向期望方向分化的蛋白因子，例如，分化為血管內(nèi)皮或腎上皮或肝上皮表型。[0045]可借助本領(lǐng)域已知的方法使iPS細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞表型。例如，Taura等，Arteriosclerosis，ThrombosisandVascularBiology2009.29:1100-1103,題為"InductionandIsolationofVascularCellsfromHumanInducedPluripotentStemCells-BriefR印ort"的文獻(xiàn)描述了使iPS細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。作者證明了同樣方法也適用于人ES細(xì)胞系，并產(chǎn)生具有相似特性和制造效率的內(nèi)皮細(xì)胞。類似地，Choi等，StemCells2009.27:559-567,題為HematopoieticandEndothelialDifferentiationofHumanInducedPluripotentStemCells的文獻(xiàn)描述了人iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞系分化為⑶31+、⑶43-內(nèi)皮細(xì)胞?？蓪⑦@些方法中的任意一者或兩者用于提供本發(fā)明所述的方法和組合物所需的用于在以血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)組織支架進(jìn)行的再接種中使用的人內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞。[0046]置上皮細(xì)胞：腎上皮細(xì)胞可以分離自供體腎組織,或由ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞在合適條件下分化產(chǎn)生。[0047]從成體或例如新生兒組織分離腎上皮細(xì)胞的方法在Bussolati等，Am.J.Pathol.2005.166:545-555,題為IsolationofRenalProgenitorCellsfromAdultHumanKidney的文獻(xiàn)中有描述。由所述方法分離的細(xì)胞為⑶133+并表達(dá)PAX-2(-種胚胎腎細(xì)胞標(biāo)志物），但不表達(dá)造血標(biāo)志物。使用MACS系統(tǒng)（MiltenyiBiotec,Auburn,CA),通過(guò)磁性細(xì)胞分選從成體腎組織的腎小管（tubular)部分分離CD133+細(xì)胞。在擴(kuò)增培養(yǎng)基存在下將CD133+細(xì)胞鋪板于纖連蛋白上，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基由60%DMEMLG(Invitrogen，Paisley，UK)、40%MCDB-201組成，具有IX胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、IX亞油酸2-磷酸酯、l(T9m〇l/L地塞米松、KT4抗壞血酸2-磷酸酯、IOOU青霉素、1000U鏈霉素、lOng/ml表皮生長(zhǎng)因子和lOng/ml血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(全部來(lái)自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以及2%胎牛血清（EuroClone，Wetherby，UK)。為了進(jìn)行細(xì)胞克隆，在擴(kuò)增培養(yǎng)基存在下將單細(xì)胞置于96孔板中。在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(lOng/ml)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（20ng/ml，Sigma)存在下獲得上皮分化。細(xì)胞可在培養(yǎng)中擴(kuò)增，并可體外分化為腎上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表型。當(dāng)皮下植入SCID小鼠中時(shí)，未分化細(xì)胞形成表達(dá)腎上皮細(xì)胞標(biāo)志物的腎小管結(jié)構(gòu)。作者展示了將擴(kuò)增的CD133+細(xì)胞IV注射至患有甘油誘導(dǎo)的腎小管壞死（tubulonecrosis)的SCID小鼠中時(shí)，使得細(xì)胞歸位（homing)至受損腎并整合至腎小管中。從而，以所述方式分離的人供體腎上皮細(xì)胞祖細(xì)胞為本文所述的方法和組合物提供了供體腎上皮細(xì)胞的來(lái)源。[0048]用于使人胚胎干細(xì)胞分化為腎上皮細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，并且在例如Narayanan等，KidneyInternational.2013年2月6日，電子出版，題為"HumanEmbryonicStemCellsDifferentiateintoFunctionalRenalProximalTubular-LikeCells，'的文獻(xiàn)中有描述。作者描述了使人胚胎干細(xì)胞分化為腎上皮細(xì)胞以提供人腎細(xì)胞的可靠來(lái)源的方案。根據(jù)他們的方法分化的細(xì)胞表達(dá)腎近端腎小管細(xì)胞及其前體的特征標(biāo)志物，但其它腎細(xì)胞類型的標(biāo)志物未表達(dá)或低水平表達(dá)。標(biāo)志物表達(dá)類似于原代培養(yǎng)的人腎近端腎小管細(xì)胞上的標(biāo)志物；分離的細(xì)胞在體內(nèi)和體外均形成了腎小管結(jié)構(gòu)。這些分化干細(xì)胞和體外培養(yǎng)的原代人腎近端腎小管細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)模式是類似的。分化干細(xì)胞顯示出腎近端腎小管細(xì)胞的形態(tài)和功能特征，并在體外和體內(nèi)產(chǎn)生腎小管結(jié)構(gòu)。以這種方式產(chǎn)生的細(xì)胞可用于對(duì)腎支架進(jìn)行再接種，或者，可用于對(duì)例如本文其它地方所述的肺支架的上皮細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行接種。[0049]用于使人iPS細(xì)胞分化為腎上皮細(xì)胞的方法在例如Song等，2012,PLOSOne7:e46453中有描述。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，將人iPS細(xì)胞集落解離并用補(bǔ)充有活化素A、BMP-7和視黃酸的DMEM-F12和2.5%胎牛血清進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。在3天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至0.1%明膠包被的不存在滋養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，以單層培養(yǎng)另外的10天，在此期間，細(xì)胞具有培養(yǎng)的腎小球足細(xì)胞的形態(tài)。隨后在不含活化素A、BMP-7和視黃酸補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中維持該足細(xì)胞，使得允許在培養(yǎng)中長(zhǎng)期增殖。分化細(xì)胞表達(dá)podocin和synaptopodin，其定位與正常培養(yǎng)的人足細(xì)胞中的定位類似。當(dāng)與部分解離的鼠科動(dòng)物胚胎腎外植體進(jìn)行再聚集時(shí)，整合入腎小球的細(xì)胞發(fā)生聚集?？墒褂靡赃@一方式或本領(lǐng)域已知的另一方式從iPS細(xì)胞分化而來(lái)的腎上皮細(xì)胞對(duì)本文所述的腎支架進(jìn)行再殖。[0050]應(yīng)當(dāng)注意的是，例如，當(dāng)使用腎上皮細(xì)胞對(duì)腎支架進(jìn)行再接種時(shí)，完全無(wú)需使細(xì)胞徹底分化。在該情況下，支架ECM為祖細(xì)胞或部分分化的細(xì)胞提供輔助，使其完成分化，成為所期望的上皮細(xì)胞類型。這同樣適用于其它脫細(xì)胞組織支架。因此，本文所述方法中的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)可在于，將未成熟的或部分分化的細(xì)胞應(yīng)用至所述支架，并使所述支架驅(qū)動(dòng)適當(dāng)?shù)姆只?。因此，例如，特別考慮可通過(guò)接種干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞（committedprogenitorcell)或完全分化的細(xì)胞來(lái)對(duì)組織支架進(jìn)行再殖。例如，考慮通過(guò)接種中胚層祖細(xì)胞、腎祖細(xì)胞、或完全分化或部分分化的腎上皮細(xì)胞來(lái)對(duì)腎支架進(jìn)行再殖。[0051]肝細(xì)胞：肝細(xì)胞也可為由供體組織制備、由人ES細(xì)胞或ES細(xì)胞系分化、或由iPS細(xì)胞（包括來(lái)自預(yù)計(jì)接受者的iPS細(xì)胞）分化。從供體組織（包括來(lái)自活體供體的組織）分離肝細(xì)胞和肝上皮細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。從人iPS細(xì)胞高效產(chǎn)生肝細(xì)胞樣細(xì)胞在例如Si-Tayeb等，2010,Ifepatology51:297-305中有描述。這些細(xì)胞表現(xiàn)出關(guān)鍵的肝功能，并可體內(nèi)整合至肝實(shí)質(zhì)（hepaticparenchyma)中。[0052]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可將ECM支架（例如，腎支架或肺支架）懸浮在接種室中，并與儲(chǔ)液池相連，使得能夠灌注內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。根據(jù)一些實(shí)施方式，可將腎動(dòng)脈連接至用于灌注內(nèi)皮細(xì)胞（例如，懸浮的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC))的懸液儲(chǔ)液池。根據(jù)一些實(shí)施方式，可將腎靜脈連接至用于灌注內(nèi)皮細(xì)胞（例如，懸浮的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC))的懸液儲(chǔ)液池。根據(jù)一些實(shí)施方式，可將輸尿管連接至用于灌注上皮細(xì)胞（例如，懸浮的新生兒腎細(xì)胞（NKC))的懸液儲(chǔ)液池?？赏ㄟ^(guò)施加真空以建立跨支架的壓力梯度，促進(jìn)細(xì)胞移入較小空間并直至到達(dá)整個(gè)支架，從而改善細(xì)胞遞送和駐留。[0053]根據(jù)一些實(shí)施方式，為建立所需的跨腎壓力梯度，可向ECM支架施加0?80cmH2O范圍內(nèi)的環(huán)境真空。根據(jù)其它實(shí)施方式，并根據(jù)待接種器官的性質(zhì)和大小，可使用其它真空壓力范圍，例如10?70cmH20、20?60cmH20、30?50cmH2O和高于80cmH20。根據(jù)一些實(shí)施方式，真空壓力可隨時(shí)間改變，例如，以高值（例如80cmH2O)起始，從而將細(xì)胞引入支架最遠(yuǎn)和最深的區(qū)域，然后，隨著達(dá)到期望的細(xì)胞量，降低至例如20cmH20。根據(jù)一些實(shí)施方式，真空壓力可隨時(shí)間改變，例如，以低值（例如20cmH2O)起始，從而將細(xì)胞引入支架，然后，隨著達(dá)到期望的細(xì)胞量，提高至例如80cmH20。[0054]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于支架200,每I.0?I.5克支架200的組織可接種約1000萬(wàn)?1億個(gè)上皮細(xì)胞，每1.0?1.5克支架200的組織可接種約1000萬(wàn)?1億個(gè)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并且每1.〇?1.5克支架200的組織可接種約1000萬(wàn)?1億個(gè)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，各儲(chǔ)液池可填充有約50萬(wàn)?500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/cc的溶液。接種過(guò)程持續(xù)至已將期望數(shù)量的細(xì)胞灌注至所述支架中。[0055]根據(jù)一些實(shí)施方式，接種過(guò)程可在溫度受控的環(huán)境中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在整個(gè)過(guò)程中溫度可保持大體上恒定。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在接種過(guò)程期間溫度可發(fā)生改變。在一些實(shí)施方式中，可將接種室維持在20°C?40°C的范圍內(nèi)。[0056]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可將接種的支架轉(zhuǎn)移至適于提供全器官培養(yǎng)條件的灌注生物反應(yīng)器。根據(jù)一些實(shí)施方式，并不將接種的支架轉(zhuǎn)移，而可改變接種室內(nèi)部的環(huán)境條件，使其與為生物反應(yīng)器所確定的條件一致，并且可經(jīng)由動(dòng)脈連接輸入灌注介質(zhì)，同時(shí)可對(duì)來(lái)自輸尿管的器官產(chǎn)出進(jìn)行監(jiān)測(cè)。[0057]根據(jù)其它實(shí)施方式，可將接種的支架植入人類宿主或非人動(dòng)物宿主中進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)手術(shù)將腎植入腎盂（pelvis)中，并連接至接受者的腹股溝動(dòng)脈、靜脈和膀胱。在其它實(shí)施方式中，可通過(guò)手術(shù)將腎植入皮下位置，并連接至上腹部(印igastric)動(dòng)脈和靜脈，而可將輸尿管保留為排出至腹膜中，直至完全成熟。[0058]對(duì)再牛器官功能的評(píng)估:可通過(guò)對(duì)濾液的組成進(jìn)行監(jiān)測(cè)來(lái)對(duì)本文所述的再生的或合成的生物過(guò)濾器官或構(gòu)建體的功能進(jìn)行評(píng)估和監(jiān)測(cè)。[0059]舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)再生腎而言，所述濾液為尿液，其將經(jīng)由輸尿管離開(kāi)腎（或者，在使用腎上皮細(xì)胞對(duì)肺支架進(jìn)行再殖的情況下，尿液將積累并經(jīng)由氣管或支氣管從先前的氣腔離開(kāi)）。腎的正常功能之一為防止血糖（即葡萄糖）流失至尿液中。因此，來(lái)自正常健康個(gè)體的尿液的葡萄糖含量應(yīng)當(dāng)非常低。當(dāng)使用內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)腎支架進(jìn)行再殖時(shí)，通常需要一定的時(shí)間來(lái)建立過(guò)濾功能，并且來(lái)自輸尿管的流出液（effluent)最初將包含來(lái)自灌注介質(zhì)的葡萄糖。隨著再殖的腎開(kāi)始執(zhí)行其過(guò)濾功能，所產(chǎn)生的濾液中的葡萄糖濃度將逐漸降低，并且灌注介質(zhì)葡萄糖和尿液/流出液葡萄糖之間的差值將增大。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)尿液中的葡萄糖濃度與灌注介質(zhì)中的葡萄糖濃度相比小于50%時(shí)，優(yōu)選與灌注介質(zhì)中的葡萄糖濃度相比小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或更低時(shí)，再生腎已足夠成熟。[0060]健康腎通常保留的另一因素或代謝物是肌酐清除。隨著再殖的腎重新建立生物過(guò)濾功能，由于更多肌酐被從灌注液中清除，濾液/尿液中的肌酐將增加。通常，清除至少10%的灌注液肌酐表明了正常功能，優(yōu)選為至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多，直至正常人腎的肌酐清除速率。正常個(gè)體中的肌酐清除速率隨年齡增加而下降。然而，注意到具有如下范圍。在年齡小于40歲的男性中，正常速率通常為約107?139(mL/min)或1.8?2.3毫升/秒（mL/sec);在年齡小于40歲的女性中，正常速率通常為約87?107mL/min或1.5?I.8mL/sec。超過(guò)20歲后，隨著個(gè)體變老，肌酐清除值通常每10年下降約6.5mT,/min〇[0061]腎成熟度的另一量度為白蛋白的駐留。正常尿液中蛋白含量低。再殖后的初期，來(lái)自介質(zhì)的白蛋白將以相對(duì)高的濃度存在于流出液中。隨著腎重新建立其正常的半透屏障功能，血管系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)變得對(duì)介質(zhì)中的蛋白（包括白蛋白）的滲透性降低，尿液中的白蛋白濃度將降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中至少30%的白蛋白，優(yōu)選至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或更多。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中至少80%的白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中至少85%的白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中至少90%的白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中95%的白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中至少98%的白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中至少99%的白蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生腎保留了灌注液中100%的白蛋白。[0062]在一些實(shí)施方式中，腎構(gòu)建體的體外測(cè)試允許對(duì)尿液樣品和腎功能進(jìn)行化學(xué)分析。例如，尿分析數(shù)據(jù)可包括下列數(shù)據(jù)：比重1.003?1.040、？114.6?8.0、恥10?4011￡9/L、K低于8mEq/L、Cl低于8mEq/L、蛋白1?15mg/dL、摩爾滲透壓濃度（osmolality)80?1300m0sm/L、尿膽紅素陰性、尿血陰性、尿酮陰性、尿白細(xì)胞陰性、尿亞硝酸鹽陰性、RBC's0?2/HPF、WBC's0?2/HPF、RBC管型0/HPF、尿膽素原0?2?I.OEhrU/dl;24小時(shí)尿值：淀粉酶250?1100IU/24hr、鈣100?250mg/24hr、氯化物110?250mEq/24hr、肌酐1?2g/24hr、肌酐清除（男）100?140mL/min、肌酐清除（男）16?26mg/kg/24hr、肌酐清除（女）8〇?l3〇mL/min、肌酐清除（女）10?2〇mg/kg/24hr、鎂6?9mEq/24hr、摩爾滲透壓濃度450?900m0sm/kg、憐0?9?I.3g/24hr、鐘35?85mEq/24hr、蛋白0?150mg/24hr、納30?280mEq/24hr、尿素氣10?22gm/24hr、尿酸240?755mg/24hr。[0063]可替代地或額外地，可通過(guò)在灌注介質(zhì)中加入示蹤染料（如熒光標(biāo)記的微球和熒光標(biāo)記的白蛋白）來(lái)對(duì)再生腎的成熟度進(jìn)行監(jiān)測(cè)或評(píng)價(jià)。認(rèn)為染料在灌注介質(zhì)中的駐留表明再殖器官成熟并建立了生物過(guò)濾功能，進(jìn)入濾液/尿液的比例降低。[0064]作為在對(duì)支架進(jìn)行接種后在生物反應(yīng)器（例如本文所述的生物反應(yīng)器）中進(jìn)行培養(yǎng)的替代，在某些實(shí)施方式中可以考慮的是，給予足夠的時(shí)間供細(xì)胞附著后，可將再接種的器官直接移植給接受者，而不在反應(yīng)器中進(jìn)行灌注培養(yǎng)。在這些情況下，所述接受者通過(guò)其循環(huán)系統(tǒng)提供營(yíng)養(yǎng)物和天然生長(zhǎng)因子，該營(yíng)養(yǎng)物和天然生長(zhǎng)因子足以維持移植體，并允許或促進(jìn)接種細(xì)胞的擴(kuò)增和進(jìn)一步分化。因此，盡管優(yōu)選再殖器官、再生器官或人工再生器官盡可能地成熟，然而可以考慮的是，新器官無(wú)需變得完美即可提供治療益處。任何療法（例如延長(zhǎng)必要的腎透析治療之間的時(shí)間）都可對(duì)其接受者產(chǎn)生很大影響。正如所注意到的，植入相對(duì)未成熟的器官不但可允許立即獲得有效的生物過(guò)濾，還可允許器官隨時(shí)間進(jìn)一步成熟并且在功能上得以改善。[0065]趁植:可將如本文所述的再殖生物過(guò)濾器官移植至有需要的接受者。如本文中所指出的，所述接受者與再殖細(xì)胞來(lái)源的個(gè)體可以是同一人，或者，例如，所述細(xì)胞可來(lái)自組織匹配的供體。移植的器官通常只需要與循環(huán)系統(tǒng)相連，使得血液流入動(dòng)脈并流出靜脈。濾液可由移植器官排放至離開(kāi)機(jī)體的導(dǎo)管，例如，排出至收集袋；或者，可替代地，可將來(lái)自器官（例如，對(duì)于再殖腎而言為輸尿管，或者對(duì)于再殖肺而言為先前的氣腔或細(xì)支氣管）的流出液排出至選定的系統(tǒng)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，可引導(dǎo)尿液排入膀胱，或膽汁可排入膽囊。[0066]可將移植的器官置于其正常的解剖位置中，例如，在該器官位置處替代受損或患病器官?；蛘撸蓪⒁浦驳钠鞴僭灰浦驳教峁┍匾膭?dòng)脈/靜脈供給和排出系統(tǒng)、以及提供足以使器官存在的空間的任何位置。[0067]實(shí)施例[0068]方法和材料[0069]腎的灌灃脫細(xì)胞[0070]分離總計(jì)64個(gè)腎，用于灌注脫細(xì)胞。全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在符合動(dòng)物福利法（theAnimalWelfareAct)的情況下進(jìn)行，并經(jīng)位于MassachusettsGeneralHospital的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。使用吸入的5%異氟燒（isoflurane)(Baxter,Deerfield,IL)，將12周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠（CharlesRiverLabs，Wilmington，MA)麻醉。通過(guò)肝內(nèi)下腔靜脈（intrahepaticinferiorvenacava)進(jìn)行全身肝素化（AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumburg,IL)后，使用中位（median)剖腹術(shù)暴露腹膜后腔。去除Gerota's筋膜（fascia)、腎周脂肪和腎包膜（capsule)后，對(duì)腎動(dòng)脈、靜脈和輸尿管進(jìn)行橫切并從腹部取下腎。將25G(gauge)插管（HarvardApparatus，Holliston，MA)插入輸尿管。然后，將預(yù)填充的25G插管（HarvardApparatus,Holliston，MA)插入腎動(dòng)脈，使得在30mmHg動(dòng)脈壓下將肝素化的PBS(Invitrogen，GrandIsland,NY)順行動(dòng)脈灌注15分鐘，以從腎中去除殘余血液。隨后，在30mmHg恒壓下按下列順序給予脫細(xì)胞溶液：去離子水中的1%SDS(Fisher，Waltham，MA)，12小時(shí)；去離子水，15分鐘；以及去離子水中的1%Triton-X-100(Sigma，St.Louis，MO)，30分鐘。脫細(xì)胞后，使用具有10,000U/mL青霉素G、lOmg/mL鏈霉素和25iig/mL兩性霉素B(Sigma，St.Louis，MO)的PBS對(duì)腎進(jìn)行洗滌（在I.5mL/min的恒定動(dòng)脈灌注下進(jìn)行96小時(shí)）。[0071]大鼠新牛兒腎細(xì)朐的分離和制各[0072]對(duì)于2.5-3.0日齡的Sprague-Dawley新生鼠，首先在CO2室中安樂(lè)死，然后用70%乙醇（Fisher，Waltham，MA)去污。中位剖腹術(shù)使得可觸及腎，將其切除并儲(chǔ)存于冰上（4°C)的腎上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基（REGM;Lonza，Atlanta，GA)中。隨后將腎轉(zhuǎn)移到IOOmrn培養(yǎng)皿（Corning,Corning,NY)，去除殘留的結(jié)締組織并隨后切碎為〈1mm3的碎片。將腎組織楽液重懸于DMEM(Invitrogen，GrandIsland，NY)中的lmg/mL膠原酶I(Invitrogen，GrandIsland，NY)和lmg/mL分散酶（StemCellTechnologies，Vancouver，BC，Canada)中，并在37°C搖床中孵育30分鐘。將所得的消化楽液過(guò)濾（strained)(IOOiim;Fisher，Waltham，MA)，并以4°C的REGM洗滌。然后將如上所述在膠原酶/分散酶中消化的未過(guò)濾(non-strained)組織重懸，并重復(fù)培養(yǎng)、過(guò)濾和封閉（blocking)。對(duì)得到的細(xì)胞溶液進(jìn)行離心（200g，5分鐘），將細(xì)胞沉淀重懸在2.5mLREGM中，計(jì)數(shù)，并接種到如下所述的無(wú)細(xì)胞腎支架中。[0073]人臍靜脒內(nèi)皮細(xì)朐的傳代培養(yǎng)和制各[0074]在明膠-a(BDBiosciences，Bedford，MA)包被的細(xì)胞培養(yǎng)塑料板上對(duì)第8-10代的M-cherry標(biāo)記的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（JosephP.Vacanti贈(zèng)予）進(jìn)行擴(kuò)增，并利用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基-2(EGM2:Lonza，Atlanta，GA)使其生長(zhǎng)。在接種時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理、離心、重懸在2.OmLEGM2中、計(jì)數(shù)、并隨后接種到如下所述的脫細(xì)胞腎中。[0075]細(xì)朐接種[0076]經(jīng)由動(dòng)脈插管，以I.OmL/min的恒定流速將經(jīng)胰蛋白酶處理的、在2.OmLEGM-2中稀釋的50.67±12.84XIO6個(gè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)接種到無(wú)細(xì)胞腎支架中（n=26)。使細(xì)胞附著過(guò)夜，隨后恢復(fù)灌注培養(yǎng)。在上述步驟后，分離60.71±11.67XIO6個(gè)新生大鼠腎細(xì)胞、計(jì)數(shù)、并重懸在2.5mLREGM中。在對(duì)器官室施加-40cmH2O的壓力后，經(jīng)由輸尿管插管接種細(xì)胞懸液（n=26)。使細(xì)胞附著過(guò)夜，隨后恢復(fù)灌注培養(yǎng)。[0077]牛物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和全器官培養(yǎng)[0078]將腎生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)為封閉系統(tǒng)，該封閉系統(tǒng)在凈化和組裝后可經(jīng)氣體消毒，只需要在放置器官時(shí)開(kāi)啟一次。灌注介質(zhì)和細(xì)胞懸液可經(jīng)由無(wú)菌通路端口（Cole-Parmer，VenonHills，IL)注入，以使污染風(fēng)險(xiǎn)最小。將脫細(xì)胞的腎基質(zhì)經(jīng)由腎動(dòng)脈、靜脈和輸尿管連接至灌注系統(tǒng)，并將其置于無(wú)菌且?guī)в兴祝╳ater-jacketed)的器官室（HarvardApparatus，Holliston，MA)中。在流經(jīng)以室內(nèi)空氣平衡的娃膠管（silicone)氧合器（oxygenator)(Cole_Parmer，VenonHills,IL)后，氧合介質(zhì)以I.5mL/min的流速灌注腎動(dòng)脈。在仿生培養(yǎng)過(guò)程中，輸尿管和靜脈可被動(dòng)地經(jīng)由單獨(dú)區(qū)室排入儲(chǔ)液池中。[0079]分離的腎的實(shí)騎[0080]為了對(duì)體外腎功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以0?22iim-過(guò)濾（Fisher,Waltham,MA)的Krebs-Henseleit(KH)溶液對(duì)單個(gè)天然腎、再生腎和脫細(xì)胞腎進(jìn)行灌注，所述溶液含有：NaHCO3(25.OmM)、NaCl(118mM)、KCl(4.7mM)、MgS04(I.2mM)'NaH2PO4(I.2mM)、CaCl2(I.2mM)、BSA(5.Og/dL)、D-葡萄糖（100mg/dL)、尿素（12mg/dL)、肌酐（20mg/dL)，（SigmaAldrich,St.Louis,M0)。在測(cè)試前添加下列氨基酸（Invitrogen，GrandIsland,NY):甘氨酸(750mg/L)、L-丙氨酸（890mg/L)、L-天冬酰胺（1，320mg/L)、L-天冬氨酸（1330mg/L)、L-谷氨酸（1470mg/L)、L-脯氨酸（1150mg/L)和L-絲氨酸（1050mg/L)。將KH溶液進(jìn)行氧合（5%C02,95%O2)、加熱（37°C)，并以80-120mmHg恒壓經(jīng)由動(dòng)脈插管進(jìn)行灌注，不進(jìn)行再循環(huán)。尿液和靜脈流出液被動(dòng)排入單獨(dú)的收集管中。在灌注開(kāi)始后10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘和50分鐘時(shí)取樣，并立即在_80°C冷凍直至進(jìn)行分析。使用CatalystDxChemistryAnalyzer(Idexx，Westbrook，ME)對(duì)尿液、靜脈流出液和灌注用KH溶液進(jìn)行定量。腎血管阻力計(jì)算為動(dòng)脈壓力（mmHg)/腎血流量（ml/g/min)。在體外實(shí)驗(yàn)完成后，以無(wú)菌PBS對(duì)腎進(jìn)行沖洗，拔除插管，將其轉(zhuǎn)移至無(wú)菌容器中的冷卻（4°C)PBS中，直至進(jìn)一步處理。[0081]鉬織學(xué)、免疫熒光和免疫纟目化[0082]利用相同的石蠟包埋固定方案（5%福爾馬林緩沖的PBS，F(xiàn)isher，Waltham，MA)將天然腎、脫細(xì)胞腎和再生腎在室溫處理24小時(shí)，并將用于冷凍切片的切片于4°C在4%多聚甲醛（Fisher，Waltham，MA)中固定過(guò)夜。將切片包埋在石蠟或TissueTekOCT復(fù)合物(VWR，Bridg印ort，NJ)中，用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行切片。將組織切片切為5iim的切片并使用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行H&E染色（SigmaAldrich,St.Louis,MO)。還按照制造商的方案，使用Movat'sPentachrome(AmericanMastertech，Lodi，CA)對(duì)切片進(jìn)行了染色。[0083]通過(guò)2次換為二甲苯（5分鐘）、2次換為100%乙醇（3分鐘）、2次換為95%乙醇(3分鐘）對(duì)石蠟包埋的切片進(jìn)行脫石蠟，將其放置于去離子水中（溶液全部來(lái)自Fisher，Waltham，MA)。為了進(jìn)行免疫染色，首先將脫蠟玻片（slides)在熱的（95°C)檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0)(Dako,Carpinteria，CA)中進(jìn)行抗原修復(fù)20分鐘，然后冷卻至室溫20分鐘。為了對(duì)IV型膠原、彈性蛋白和層粘連蛋白表位進(jìn)行免疫染色，在PBS中將玻片封閉5分鐘，然后將其與含有201^/1^蛋白酶-1((51§111&，5七1〇11&^0)的了￡緩沖液（?11=8.0)在371：孵育10分鐘。在PBS中封閉5分鐘后，使用雙內(nèi)源酶封閉劑（Dako，Carpinteria，CA)對(duì)玻片處理5分鐘，然后使用封閉緩沖液（含有1%BSA、0.1%Triton-X的PBS;Sigma，St.Louis，MO)處理30分鐘。在4°C使一抗附著過(guò)夜。使用封閉緩沖液制造一抗稀釋液，所述一抗稀釋液如下：1:50抗彈性蛋白，1:50抗層粘連蛋白（SantaCruzBiotech,SantaCruz,CA);1:50抗IV型膠原（LifespanBioscience，Seattle，WA);1:200抗podocin，1:200抗Na/K-ATPase(Abcam，Cambrige，MA);以及1:200抗E_|丐粘蛋白（R&DSystems，Minneapolis，MN)。在一抗孵育后，在PBS中洗滌玻片5分鐘，并以1:100添加綴合有HRP的二抗，處理30分鐘（Dako,Carpinteria，CA)。用PBS對(duì)所得玻片進(jìn)行洗漆，用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（Dako，Carpinteria，CA)進(jìn)行顯色，直至觀測(cè)到良好的染色強(qiáng)度。使用蘇木精（Sigma,St.Louis,MO)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。在使用連續(xù)酒精梯度和二甲苯（Fisher，Walthem，MA)脫水后，使用封片劑（permount)(Fisher,Walthem，MA)安裝蓋玻片。[0084]為了進(jìn)行免疫熒光，如上所述對(duì)石蠟包埋的切片進(jìn)行脫石蠟、抗原修復(fù)、并接受在封閉緩沖液中制備的一抗稀釋液。在添加一抗后，如上所述對(duì)玻片進(jìn)行封閉。使全部以1:250在封閉緩沖液中稀釋的突光二抗（綴合至Alexa-突光團(tuán)的抗體種類；Invitrogen,GrandIsland，NY)附著45分鐘。使用DAPI(Invitrogen，GrandIsland，NY)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，并使用Fluoromount-G(Southern-Biotech，Birmingham，AL)安裝蓋玻片（Fisher，Walthem，MA)。將省略一抗的樣品以及免疫球蛋白Gl抗體（VectorLabs,Burlingame,CA)的樣品作為免疫組化和免疫熒光的陰性對(duì)照。使用NikonEclipseTE200顯微鏡（Nikon，Tokyo,Japan)記錄免疫組化、H&E和pentachrome染色圖像，同時(shí)使用NikonAlR-Al共聚焦顯微鏡（Nikon，Tokyo,Japan)記錄免疫熒光圖像。[0085]誘射電鏡[0086]將組織在含2.0%戊二醒的0.IM甲胂酸鈉（sodiumcacodylate)緩沖液（pH7.4)中4°C固定過(guò)夜，漂洗，在含I.0%四氧化鋨的甲胂酸鹽緩沖液中室溫后固定（post-fix)1小時(shí)，并漂洗（ElectronMicroscopySciences,Hatfield,PA)。隨后，對(duì)切片進(jìn)行梯度乙醇脫水，并使用Epon樹脂（TedPella,Redding,CA)在1:1的Epon:乙醇溶液中浸透(infiltrated)過(guò)夜。隨后將切片置于新鮮Epon中數(shù)小時(shí)，并隨后包埋于Epon中60°C過(guò)夜。在UC6超薄切片機(jī)（Leica，BuffaloGrove,IL)上切出薄切片，收集在包被有聚乙酸甲基乙烯酯（formvar)的柵格（grids)上，使用醋酸雙氧鈾和朽1檬酸鉛染色，并在JEM1011透射電鏡上以80kV(Jeol，Peabody，MA)進(jìn)行檢測(cè)。使用AMT數(shù)字成像系統(tǒng)（AdvancedMicroscopyTechniques,Danvers,MA)米集圖像。[0087]SDS、DNA、膠原和sGAG定量[0088]如先前所描述的3°，使用Stains-All染料（Sigma，St.Louis，M0)對(duì)SDS進(jìn)行定量。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，在膠原酶緩沖液（Sigma，St.Louis，M0)中于37°C對(duì)凍干組織進(jìn)行消化48小時(shí)，伴有輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)。隨后將含有任何殘留SDS的消化上清液（IiiL)加至4ml工作Stains-All染料溶液中，隨后在488nm處測(cè)定吸光度。使用Quanti-iTPicoGreendsDNA試劑盒(Invitrogen，GrandIsland，NY)對(duì)DNA進(jìn)行定量。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，使用含有蛋白酶K(200iig/毫升）（Sigma，St.Louis，M0)的Tris-HCl緩沖液于37°C從凍干組織樣品中提取DNA3小時(shí)，伴有輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)。在TE緩沖液中對(duì)消化上清液（10iiL)進(jìn)行稀釋，然后與制備的PicoGreen試劑混合。在480nm處激發(fā)樣品，并在520nm處測(cè)量熒光。按照制造商說(shuō)明，使用Sircol測(cè)定（Biocolor)對(duì)可溶性膠原進(jìn)行定量。首先在4°C對(duì)凍干組織樣品進(jìn)行酸-胃蛋白酶膠原過(guò)夜提取，隨后過(guò)夜分離并濃縮。然后依據(jù)說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。使用Blyscan測(cè)定（Biocolor)對(duì)硫酸糖胺聚糖進(jìn)行定量。在測(cè)量之前，使用木瓜蛋白酶提取試劑（Sigma,St.Louis,MO)對(duì)sGAG進(jìn)行提取，并在65°C加熱3hr。然后依據(jù)說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。全部濃度均基于平行生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線而確定，并且使用原始組織干重對(duì)值進(jìn)行了歸一化。[0089]血液和尿液樣品的化學(xué)分析[0090]使用整合有用于綜合性樣品和數(shù)據(jù)管理的IDEXXVetLab?:工作站的CatalystDx?化學(xué)分析儀（IDEXXLaboratories，Westbrook，ME，USA)對(duì)血液和尿液化學(xué)進(jìn)行分析。根據(jù)制造商方案，對(duì)每一血液樣品分析700yL，對(duì)每一尿液樣品分析300yL。如有必要，基于所收集的尿液體積對(duì)尿液樣品進(jìn)行稀釋，加入稀釋液使得樣品體積為300yL，結(jié)果中考慮了稀釋計(jì)算。在分析前，首先使血液樣品通過(guò)肝素鋰全血分離器，這些樣品無(wú)需進(jìn)行稀釋。全部樣品均通過(guò)擁有專利權(quán)的（proprietary)IDEXX診斷CLIPsChem10(ALB、ALB/GLOB、ALKP、ALT、BUN、BUN/CREA、CREA、GLOB、GLU、TP)和Lyte4(Cl、K、Na、Na/K)，以及用于鎂、和磷酸鹽的單個(gè)診斷片（diagnosticslides)。[0091]腎小球的形杰測(cè)定定量[0092]從天然腎、脫細(xì)胞腎和再生腎（每一組中n=3)的H&E染色切片（5ym)的包膜下（subcapsular)和近髓質(zhì)（juxtamedullary)區(qū)域中隨機(jī)選擇十個(gè)低倍視野（4X)。在10個(gè)視野的每一個(gè)中對(duì)腎小球進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定每切片的平均腎小球數(shù)量；并且，使用來(lái)自同組實(shí)驗(yàn)的腎小球/切片數(shù)量來(lái)確定各類型腎中的平均腎小球（平均值土SEM)。作為子集，在10個(gè)低倍視野中的每一個(gè)中對(duì)再生腎的再接種腎小球進(jìn)行計(jì)數(shù)，并隨后計(jì)算每一實(shí)驗(yàn)的平均值。使用再接種腎小球的平均數(shù)量與腎小球/切片的平均數(shù)量之比對(duì)各實(shí)驗(yàn)中再接種腎小球的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算，并將該百分?jǐn)?shù)用于對(duì)再生腎中再接種腎小球的平均百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算（平均值％±SEM)。使用來(lái)自天然腎、脫細(xì)胞腎和再生腎的相同H&E切片的個(gè)別(individual)腎小球的10個(gè)高倍視野（20X)進(jìn)行形態(tài)測(cè)定分析（每組中n=3)。所有形態(tài)測(cè)定測(cè)量均使用ImageJ(NIH)來(lái)確定。對(duì)于個(gè)別腎小球中的每一個(gè)，對(duì)腎小體（renalcorpuscle)的長(zhǎng)軸和短軸直徑均進(jìn)行了測(cè)量。由腎小球毛細(xì)血管床的外表面周圍測(cè)得的面積減去由腎小球囊內(nèi)表面周圍測(cè)得的面積，對(duì)腎小球囊腔進(jìn)行確定。得出全部測(cè)量的每實(shí)驗(yàn)平均值，并用來(lái)自同一組的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定平均值土SEM。[0093]器官制各和原位移棺[0094]對(duì)天然腎、脫細(xì)胞腎或再生腎進(jìn)行相同處理，不同的是天然腎取自全身肝素化后的、麻醉（5%異氟燒吸入）的12周齡雄性Sprague-Dawley大鼠。與如上所述相同地暴露并取下天然腎以用于灌注脫細(xì)胞，不同的是，在對(duì)腎進(jìn)行手術(shù)處理之前，以lmL/min的流速用4°C的BelzerUW冷卻儲(chǔ)液（BridgetoLife，Columbia，SC)將左腎動(dòng)脈沖洗5分鐘，并在植入之前使用20mL的無(wú)菌4°CPBS漂洗。[0095]通過(guò)在冰上對(duì)腎門（hilar)結(jié)構(gòu)（動(dòng)脈、靜脈和輸尿管）進(jìn)行環(huán)切（dissecting…circumferentially)，準(zhǔn)備用于原位移植的腎移植體。使用先前描述的改進(jìn)的套管（cuff)技術(shù)17,分別使用24G和20G的FEP聚合物定制套管（Smith-Medical，Dubliln，0H)對(duì)移植體腎動(dòng)脈和靜脈進(jìn)行套管。對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，使10周齡（220-225克）的NIHRNU-M接受者大鼠（TaconicFarms,Germantown,NY)接受5%吸入異氟燒誘發(fā)，并通過(guò)16G氣管內(nèi)管(endotrachealtube)(BDBiosciences，Bedford，MA)保持通入1-3%的異氟燒吸入。將動(dòng)物仰放于加熱墊（Sunbeam,Salem,MA)上。在施以中位剖腹術(shù)并通過(guò)右腎靜脈進(jìn)行全身肝素化后，對(duì)接受者左腎動(dòng)脈、靜脈和輸尿管進(jìn)行識(shí)別和環(huán)切，在左腎門附近切入，留下(sparing)左腎上腺動(dòng)脈。隨后使用微彈簧夾鉗（FineScienceTools,FosterCity,CA)夾住左腎動(dòng)脈和靜脈。隨后小心地將左腎與Gerota's筋膜分開(kāi)并移除。將再生腎移植體的動(dòng)脈和靜脈套管插入接受者的血管中，使用6-0絲結(jié)扎（FineScienceTools,FosterCity,CA)固定。隨后不再夾住接受者的動(dòng)脈和靜脈，并確認(rèn)明顯接合（patentanastomose)。通過(guò)25G留置針（angiocath)(HarvardApparatus，Holliston，MA)使尿液被動(dòng)地從輸尿管排出。使用尸體原位腎移植和脫細(xì)胞腎移植作為對(duì)照。[0096]實(shí)施例1.尸體腎灌注脫細(xì)胞[0097]在40mmHg恒壓下，使用1%十二烷基硫酸鈉（SDS)，通過(guò)腎動(dòng)脈灌注對(duì)尸體大鼠腎進(jìn)行脫細(xì)胞（圖4a，縮時(shí)）。無(wú)細(xì)胞腎的組織學(xué)示出了組織架構(gòu)的保留、以及細(xì)胞核和細(xì)胞組分的完全去除（圖4b，縮時(shí)）。灌注脫細(xì)胞保留了對(duì)于過(guò)濾（腎小球基底膜）、分泌和重吸收（腎小管基底膜）來(lái)說(shuō)完整的腎ECM的結(jié)構(gòu)和組成。如在其它組織中所看到的，動(dòng)脈彈性纖維網(wǎng)仍保留在無(wú)細(xì)胞的皮質(zhì)和髓質(zhì)實(shí)質(zhì)（acellularcorticalandmedullaryparenchyma)中。[0098]免疫組化染色證實(shí)了關(guān)鍵ECM組分（如層粘連蛋白和IV型膠原）在生理分布（如無(wú)細(xì)胞腎小球基底膜）中的存在（圖4c、圖4d)。從小葉中心莖（centrilobularstalk)延伸的帶有毛細(xì)血管和系膜基質(zhì)的分葉腎小球（lobulatedglomerular)基底膜的微結(jié)構(gòu)仍保持完整。無(wú)細(xì)胞腎小球進(jìn)一步被多層連續(xù)的具有褶皺的腎小球囊基底膜覆蓋（圖4e、圖4f)。腎小管基底膜仍保留有延伸到近端腎小管腔中的齒狀外突（dentateevaginations)。在高倍率掃描電鏡下，近端腎小管腔表面的平行嵴與遠(yuǎn)端腎小管腔表面的不太平行的網(wǎng)狀組織并置，這與先前報(bào)道的對(duì)無(wú)細(xì)胞腎組織的電鏡評(píng)估一致（Atala，A.，Bauer，S.B.，Soker,S.,Yoo,J.J.&Retik,A.B.Tissue-engineeredautologousbladdersforpatientsneedingcystoplasty.Lancet367,124I-I246(2〇〇6)(未不出））。SDS、去離子水和Triton-X100將每腎的總DNA含量降至低于10%(圖AghPBS洗滌后，在無(wú)細(xì)胞腎支架中不能檢出SDS。ECM總膠原和糖胺聚糖的濃度保持在與尸體腎組織并無(wú)顯著區(qū)別的水平（圖4h、圖4i)。為了確認(rèn)灌注脫細(xì)胞方案對(duì)大型動(dòng)物腎和人腎的可擴(kuò)展性（scalability)，使用類似灌注方案成功地對(duì)豬腎和人腎進(jìn)行了脫細(xì)胞（圖5對(duì)大型動(dòng)物腎和人腎的灌注脫細(xì)胞進(jìn)行了說(shuō)明。尸體（左側(cè)）和脫細(xì)胞（中間圖）的人大小的腎的照片表明，對(duì)大鼠腎進(jìn)行的灌注脫細(xì)胞可放大為產(chǎn)生用于直接臨床轉(zhuǎn)化的無(wú)細(xì)胞腎ECM。Ra,腎動(dòng)脈；Ur，輸尿管。脫細(xì)胞豬腎與人腎的相應(yīng)Pentachrome染色（右圖）。比例尺為250iim)。通過(guò)灌注染料，確認(rèn)了沿著分層（hierarchical)血管床的可灌注通道的保留，這與灌注脫細(xì)胞心和肺的在先經(jīng)驗(yàn)是類似的（圖8)。通過(guò)在生理灌注壓力下使用改進(jìn)的Krebs-Henseleit溶液對(duì)血管系統(tǒng)進(jìn)行灌注而進(jìn)行的無(wú)細(xì)胞腎支架功能測(cè)試導(dǎo)致產(chǎn)生的濾液具有與灌注液幾乎等量的蛋白、葡萄糖和電解質(zhì)，表明進(jìn)行了跨腎小球和腎小管基底膜的流體靜力學(xué)（hydrostatic)過(guò)濾，而缺失了大分子篩分（sieving)和主動(dòng)重吸收（下文進(jìn)一步詳細(xì)描述）。[0099]實(shí)施例2.無(wú)細(xì)胞腎基質(zhì)的形態(tài)測(cè)定[0100]為了對(duì)無(wú)細(xì)胞腎支架的微結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，采用已建立的基于組織學(xué)的形態(tài)測(cè)定方案來(lái)對(duì)腎小球平均數(shù)、腎小球直徑、腎小球毛細(xì)血管腔以及部分腎小球囊腔進(jìn)行定量(Olivetti,G.,Anversa,P.,Rigamonti,ff.,Vitali-Mazza,L.&Loud,A.V.Morphometryoftherenalcorpuscleduringnormalpostnatalgrowthandcompensatoryhypertrophy.Alightmicroscopestudy.JCellBiol75,573-585(1977))。隨著進(jìn)行固定、脫水和包埋，與尸體腎相比，灌注脫細(xì)胞腎的萎縮最為明顯（圖5j)。因此，隨著脫細(xì)胞的進(jìn)行，每mm2腎皮質(zhì)的腎小球表觀數(shù)量增加，但當(dāng)相對(duì)于橫切片總面積進(jìn)行歸一化后，其數(shù)量保持不變。與此相對(duì)應(yīng)，隨著脫細(xì)胞的進(jìn)行，經(jīng)由腎門的每冠狀（coronalcrosssection)橫切片的腎小球總計(jì)數(shù)保持不變。腎小球直徑、腎小球囊腔和腎小球毛細(xì)血管的表面積在尸體腎與脫細(xì)胞腎之間并無(wú)差異。[0101]實(shí)施例3.無(wú)細(xì)胞腎基質(zhì)的再細(xì)胞化[0102]為了使可灌注的功能性腎組織再生，嘗試?yán)脙?nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)無(wú)細(xì)胞大鼠腎進(jìn)行再殖。通過(guò)經(jīng)由腎動(dòng)脈灌注懸浮的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)、并經(jīng)由輸尿管滴注懸浮的新生大鼠腎細(xì)胞（NKC)，完成細(xì)胞接種。當(dāng)將腎支架安置在允許施加真空以產(chǎn)生跨支架的壓力梯度的接種室中時(shí)，細(xì)胞遞送和駐留得到了極大改善（圖5a)。向收集系統(tǒng)施加正壓力來(lái)接種NKC的嘗試并未到達(dá)腎小球，而使用跨腎梯度的細(xì)胞接種使得細(xì)胞分散在整個(gè)腎實(shí)質(zhì)內(nèi)。當(dāng)在細(xì)胞接種期間將環(huán)境真空增加至高于7〇cmH2O時(shí)，在腎蓋（calyxes)和實(shí)質(zhì)中觀測(cè)到組織損傷，并在極端情況下觀測(cè)到組織破壞。40cmH2O的真空度不產(chǎn)生宏觀或微觀組織損傷或細(xì)胞泄漏，這與在分離的腎小管基底膜機(jī)械性能中獲得的數(shù)據(jù)一致（Welling，L.ff.&Grantham,J.J.Physicalpropertiesofisolatedperfusedrenaltubulesandtubularbasementmembranes.JClinInvest51,1063-1075(1972))。接種后，將腎構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到設(shè)計(jì)用于提供全器官培養(yǎng)條件的灌注生物反應(yīng)器中（圖5b、圖5c)。與使用肺和心臟支架的在先實(shí)驗(yàn)類似，發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)植入無(wú)細(xì)胞腎基質(zhì)中。進(jìn)行灌注器官培養(yǎng)三至五天后，觀察到血管通道排列有內(nèi)皮細(xì)胞，其在整個(gè)支架橫切面上延伸，由段動(dòng)脈、葉間動(dòng)脈和弓狀動(dòng)脈直至腎小球和腎小管周圍毛細(xì)血管（圖5d)。由于沿腎單位的不同區(qū)位（niches)中的多種上皮細(xì)胞表型對(duì)尿液產(chǎn)生均有貢獻(xiàn)，我們選擇了除了經(jīng)由腎動(dòng)脈再接種HUVEC以外、再經(jīng)由輸尿管再接種大鼠NKC(2-3日齡）的組合。由新鮮分離的2-3日齡新生大鼠腎的酶消化產(chǎn)物制備NKC單細(xì)胞懸液，所述懸液由全部腎細(xì)胞類型（包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞譜系）的異質(zhì)混合物組成。當(dāng)分離后在細(xì)胞培養(yǎng)塑料板上培養(yǎng)12小時(shí)時(shí)，8%的附著細(xì)胞對(duì)podocin染色呈陽(yáng)性，表示其為腎小球上皮表型；69%的附著細(xì)胞對(duì)Na/K-ATPase染色呈陽(yáng)性，表示其為近端腎小管表型；且25%的附著細(xì)胞對(duì)E-鈣粘蛋白染色呈陽(yáng)性，表示其為遠(yuǎn)端腎小管表型（數(shù)據(jù)未示出）。細(xì)胞接種后，將腎構(gòu)建體安置于灌注生物反應(yīng)器中，并在全器官仿生培養(yǎng)中培養(yǎng)（n=31)。最初的靜止培養(yǎng)階段使細(xì)胞得以附著，隨后開(kāi)始灌注，以提供氧合作用、營(yíng)養(yǎng)物供給及過(guò)濾刺激。由于管狀器官(tubularapparatus)不成熟，新生大鼠無(wú)法排泄?jié)饪s尿液（Falk,G.Maturationofrenalfunctionininfantrats.AmJPhysiol181,157-170(1955))。為了促進(jìn)無(wú)細(xì)胞腎基質(zhì)中的體外腎生成和NKC成熟，我們向培養(yǎng)基中補(bǔ)充了已知體內(nèi)成熟信號(hào)（如糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺）來(lái)加速尿液濃縮功能的發(fā)育。我們?cè)谏項(xiàng)l件下將再接種腎培養(yǎng)了多達(dá)12天。對(duì)于早在培養(yǎng)第四天時(shí)的組織學(xué)評(píng)估，我們觀察到上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)腎支架的再殖以及腎小球、腎小管和血管結(jié)構(gòu)的保留。NKC和HUVEC植入至其合適的上皮區(qū)室和血管區(qū)室(圖5e)。再生上皮和內(nèi)皮間的空間關(guān)系類似于為水和溶質(zhì)過(guò)濾、分泌和重吸收提供解剖學(xué)基礎(chǔ)的天然腎單位的微觀解剖學(xué)性質(zhì)和極性。免疫染色顯示了被內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞密集接種的腎小球。在整個(gè)腎中，盡管偶爾也能觀察到非位點(diǎn)特異性植入，足細(xì)胞似乎更傾向于植入腎小球區(qū)域（圖5f-圖5h)。植入至腎小球基底膜上的上皮細(xì)胞對(duì)P-1整合素染色呈陽(yáng)性，表明細(xì)胞位點(diǎn)特異性粘附至ECM區(qū)域的潛在可能，并對(duì)觀測(cè)到的位點(diǎn)特異性細(xì)胞植入提供了機(jī)理（mechanistic)解釋（圖5i)。發(fā)現(xiàn)植入的上皮細(xì)胞重建了極性，并在表達(dá)Na/K-ATPase和水通道蛋白的腎小管結(jié)構(gòu)中組織化（organize)，這與天然近端腎小管上皮相似。類似地，表達(dá)E-鈣粘蛋白的上皮細(xì)胞形成類似于天然遠(yuǎn)端腎小管上皮和集尿管(collectingduct)的結(jié)構(gòu)（圖5e、圖5j-圖51)。排列于腎盂的E-I丐粘蛋白陽(yáng)性的上皮細(xì)胞類似于天然變移上皮（transitionalepithelium)。再生腎的透射電鏡和掃描電鏡示出灌注的腎小球毛細(xì)血管與植入的足細(xì)胞，并示出足突形成（圖5m、圖5n)。再生腎的形態(tài)測(cè)定分析顯示，超過(guò)一半的腎小球基質(zhì)的再細(xì)胞化導(dǎo)致每再生腎中的細(xì)胞化腎小球平均數(shù)量約為尸體腎的70%。與尸體腎相比，再生腎中的腎小球平均直徑、腎小球囊腔和腎小球毛細(xì)血管腔似乎較?。▓D5〇)。[0103]實(shí)施例4.無(wú)細(xì)胞腎和再生腎的體外功能[0104]在細(xì)胞接種和全器官培養(yǎng)之后，我們對(duì)再生腎過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)灌注液、清除代謝物、重吸收電解質(zhì)和葡萄糖、以及生成濃縮尿液的體外能力進(jìn)行了測(cè)試（圖6a)。用含有白蛋白、尿素和電解質(zhì)的Krebs-Henseleit(KH)碳酸氫鹽緩沖溶液在生理壓力下經(jīng)由腎動(dòng)脈對(duì)尸體腎、脫細(xì)胞腎和再生腎進(jìn)行灌注。對(duì)尿液樣品進(jìn)行分析并在三組之中進(jìn)行比較。與尸體腎對(duì)照相比，脫細(xì)胞腎產(chǎn)生了近兩倍的濾液；再生腎產(chǎn)生了最少量的尿液。所有三組在測(cè)試期間均維持平穩(wěn)的尿液輸出（圖6b、圖6c)?；谀蚍治龅慕Y(jié)果，作為對(duì)腎小球過(guò)濾率的評(píng)估，我們計(jì)算了肌酐清除；作為對(duì)腎小管吸收和分泌功能的分析，我們計(jì)算了溶質(zhì)排泄分?jǐn)?shù)(圖6d)。由于稀釋尿液的產(chǎn)出增加，與尸體腎相比，脫細(xì)胞腎中計(jì)算所得的肌酐清除增加，表明跨無(wú)細(xì)胞基底膜的腎小球（可能還包括腎小管和導(dǎo)管（ductal))過(guò)濾有所增加。在利用內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞再殖之后，再生構(gòu)建體的肌酐清除達(dá)到尸體腎的約10%，表明跨部分重構(gòu)的、且可能未成熟的腎小球膜的腎小球過(guò)濾有所下降（圖6c)。發(fā)現(xiàn)血管阻力隨著脫細(xì)胞而有所增加，并且在重新內(nèi)皮化之后下降，但與尸體腎相比，再生構(gòu)建體中仍保持更高水平（圖6e)。這一發(fā)現(xiàn)與我們先前在心臟和肺的重新內(nèi)皮化中觀測(cè)的結(jié)果相一致，并可能與血管床的相對(duì)未成熟以及來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)基的微栓（micro-emboli)有關(guān)。當(dāng)體外腎動(dòng)脈灌注壓升至120mmHg時(shí)，再生腎中的尿液產(chǎn)生和肌酐清除速率達(dá)到尸體腎的至多23%(圖6b、圖6c)。在脫細(xì)胞腎中，白蛋白駐留降低至與剝離的（denuded)腎小球基底膜對(duì)大分子篩分的預(yù)期貢獻(xiàn)相一致的水平。隨著再細(xì)胞化的進(jìn)行，白蛋白駐留得以部分恢復(fù)，導(dǎo)致再生腎中改善的、但仍是持續(xù)性的白蛋白尿。隨著脫細(xì)胞化，葡萄糖重吸收喪失，這與自由過(guò)濾和腎小管上皮細(xì)胞的喪失相一致。再生腎表現(xiàn)出部分恢復(fù)的葡萄糖重吸收，表明具有功能性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的近端腎小管上皮細(xì)胞的植入，使得葡萄糖尿減少。更高的灌注壓力并未導(dǎo)致再生腎中白蛋白增加或葡萄糖損失。脫細(xì)胞腎中喪失了電解質(zhì)的選擇性重吸收。過(guò)濾的肌酐比電解質(zhì)稍多，使得有效的電解質(zhì)駐留分?jǐn)?shù)為5?10%。這一差異可能是由所保持的離子和基底膜的電荷引起的（Bray，J.&Robinson，G.B.Influenceofchargeonfiltrationacrossrenalbasementmembranefilmsinvitro.KidneyInt25,527-533(1984)),同時(shí)離子范圍可能與跨無(wú)細(xì)胞血管、腎小球和腎小管基底膜中擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)的細(xì)微差別有關(guān)。在再生腎中，電解質(zhì)重吸收恢復(fù)至約50%的生理水平，進(jìn)一步表明了近端腎小管和遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞的植入和功能。尿素排泄分?jǐn)?shù)在脫細(xì)胞腎中有所增加，并在再生腎中回到更接近生理范圍的水平，這表明具有尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能性集尿管上皮細(xì)胞得以部分重建。[0105]實(shí)施例5.再生腎的原位移植和體內(nèi)功能[0106]由于再生腎在體外產(chǎn)生尿液，我們推測(cè)生物人工腎可以在原位移植后在體內(nèi)發(fā)揮作用。我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性的左腎切除并原位移植了再生左腎。我們使再生左腎與接受者的腎動(dòng)脈和靜脈相接合（圖7a)。在整個(gè)測(cè)試期間，再生腎移植體表現(xiàn)出良好灌注，而無(wú)任何血管系統(tǒng)、收集系統(tǒng)或?qū)嵸|(zhì)（parenchyma)出血的跡象（圖7b)。輸尿管保持插管狀態(tài)，以記錄體內(nèi)產(chǎn)生清澈尿液而無(wú)肉眼可見(jiàn)的血尿跡象，并收集尿液樣品。在將接受者血管系統(tǒng)松開(kāi)后不久直至實(shí)驗(yàn)計(jì)劃的終點(diǎn)，再生腎產(chǎn)生尿液。外植再生腎的組織學(xué)評(píng)價(jià)顯示，灌流血液的血管系統(tǒng)沒(méi)有實(shí)質(zhì)出血或微血管血栓形成的跡象（圖7c、圖7d)。[0107]對(duì)應(yīng)于體外研究，脫細(xì)胞腎產(chǎn)生高血糖（249±62.9mg/dL，天然對(duì)照則為29±8.5mg/dL)、高白蛋白（26.85±4.03g/dL，天然對(duì)照則為0?6±0.4g/dL)、低尿素(18±42.2mg/dL，天然對(duì)照則為617.3±34.8mg/dL)和低肌酐（0?5±0.3mg/dL，天然對(duì)照則為24.6±5.8mg/dL)的濾液。[0108]與天然腎相比，再生腎產(chǎn)出較少尿液（1.2±0.liU/min，天然腎對(duì)照中為3.2±0.9iil/min，脫細(xì)胞腎中為4.9±I.4iil/min);與天然腎對(duì)照相比，該尿液具有較低的肌酐（I.3±0.2mg/dL)和尿素（28.3±8.5mg/dL)，但與脫細(xì)胞腎相比表現(xiàn)出改善的葡萄糖尿（160±20mg/dL)和白蛋白尿（4.67±2.51g/L)。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，再生腎中的肌酐清除低于天然腎（〇.〇l±〇.〇〇2ml/min，天然腎對(duì)照中為0.36±0.09ml/min)，尿素排泄也較低（〇.003±0.001mg/min，天然腎對(duì)照中為0.19±0.Olmg/min)。在經(jīng)由接受者血管系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)血液灌注時(shí)，再生腎的原位移植顯示出直接的移植體功能，而無(wú)形成血栓或出血的跡象。尿分析結(jié)果與體外觀測(cè)的相對(duì)不成熟的構(gòu)建體相對(duì)應(yīng)。[0109]其它實(shí)施方式也涵蓋于本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。例如，由于軟件的性質(zhì)，上述功能可以使用軟件、硬件、固件、硬接線，或以上要素的任意組合來(lái)實(shí)施。實(shí)施功能的特征也可在物理上位于不同位置，包括被分散而使得在不同的物理位置處實(shí)施部分功能。[0110]此外，盡管以上說(shuō)明針對(duì)本發(fā)明，但該說(shuō)明也可包括一個(gè)以上發(fā)明?！緳?quán)利要求】1.一種用于對(duì)過(guò)濾器官支架進(jìn)行接種的細(xì)胞接種系統(tǒng)，所述過(guò)濾器官包含至少一根動(dòng)脈管道和至少一根輸出管道，所述系統(tǒng)包含：密封的接種室，所述接種室適于包封用于細(xì)胞接種的生物人工過(guò)濾器官支架，并適于在所述接種室的內(nèi)部提供壓力受控的環(huán)境，所述接種室包含多個(gè)端口，所述端口適于允許第一流體通道將細(xì)胞懸液流體輸送入所述接種室，并適于允許至少一個(gè)空氣壓力通道將所述接種室的內(nèi)部與空氣壓力泵相連；壓力傳感器，所述壓力傳感器適于對(duì)所述接種室內(nèi)部的環(huán)境壓力進(jìn)行檢測(cè)；并且其中，所述空氣壓力泵能夠在所述接種室內(nèi)部保持負(fù)壓。2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其進(jìn)一步包含第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，所述第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池連接至至少一個(gè)流體通道，用于將第一細(xì)胞懸液遞送至所述細(xì)胞接種室。3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其進(jìn)一步包含第一懸液泵，所述第一懸液泵連接至所述第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，用于將所述第一細(xì)胞懸液泵送至所述細(xì)胞接種室。4.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其中，所述細(xì)胞懸液包含內(nèi)皮細(xì)胞。5.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其中，所述細(xì)胞懸液包含上皮細(xì)胞。6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其進(jìn)一步包含第二流體通道，所述第二流體通道穿過(guò)所述接種室的端口；以及第二細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，所述第二細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池連接至所述第二流體通道，用于將第二細(xì)胞懸液遞送至所述細(xì)胞接種室。7.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其進(jìn)一步包含第一懸液泵，所述第一懸液泵連接至所述第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，用于將所述第一細(xì)胞懸液泵送至所述細(xì)胞接種室。8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其中，所述細(xì)胞接種室至少部分地包封在加熱室中，并且所述細(xì)胞接種室包含加熱元件，所述加熱元件適于將所述接種室保持在大體上恒定的溫度。9.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其中，將所述細(xì)胞接種室保持在10cm?70cmH20的負(fù)壓范圍內(nèi)。10.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞接種系統(tǒng)，其中，將所述細(xì)胞接種室保持在30cm?50cmH20的負(fù)壓范圍內(nèi)。11.一種用于對(duì)過(guò)濾器官支架進(jìn)行接種的細(xì)胞接種系統(tǒng)，所述過(guò)濾器官支架包含至少一根動(dòng)脈管道、至少一根靜脈管道和至少一根輸出管道，所述系統(tǒng)包含：密封的接種室，所述接種室適于包封用于細(xì)胞接種的過(guò)濾器官支架，并適于在所述接種室的內(nèi)部提供壓力受控的環(huán)境，所述接種室包含多個(gè)端口，所述端口適于允許第一流體通道將細(xì)胞懸液流體輸送入所述接種室，適于允許第二流體通道將細(xì)胞懸液流體輸送入所述接種室，適于允許第三流體通道將細(xì)胞懸液流體輸送入所述接種室，并適于允許至少一個(gè)空氣壓力通道將所述接種室的內(nèi)部與空氣壓力泵相連；壓力傳感器，所述壓力傳感器適于對(duì)所述接種室內(nèi)部的環(huán)境壓力進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述空氣壓力泵能夠在所述接種室內(nèi)部保持約40cmH20的負(fù)壓；第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，所述第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池適于將第一細(xì)胞群保持于懸液狀態(tài)，所述第一細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池連接至所述第一通道，并將處于懸液狀態(tài)的所述第一細(xì)胞群遞送至所述細(xì)胞接種室；第二細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，所述第二細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池適于將第二細(xì)胞群保持于懸液狀態(tài)，所述第二細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池連接至所述第二通道，并將處于懸液狀態(tài)的所述第二細(xì)胞群遞送至所述細(xì)胞接種室；以及第三細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池，所述第三細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池適于將第三細(xì)胞群保持于懸液狀態(tài)，所述第三細(xì)胞懸液儲(chǔ)液池連接至所述第三通道，并將處于懸液狀態(tài)的所述第三細(xì)胞群遞送至所述細(xì)胞接種室。12.-種工程化生物過(guò)濾組織組合物，所述組合物包含脫細(xì)胞組織支架，所述脫細(xì)胞組織支架在血管區(qū)室中用血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞進(jìn)行再接種，并在僅具有一根輸出管道的具有盲端的上皮細(xì)胞區(qū)室中用上皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞祖細(xì)胞進(jìn)行接種，其中，在對(duì)脫細(xì)胞支架外部施加負(fù)壓梯度的情況下，通過(guò)經(jīng)由所述輸出管道滴注細(xì)胞懸液，將所述上皮細(xì)胞或所述上皮細(xì)胞前體導(dǎo)入所述具有盲端的區(qū)室。13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述支架為脫細(xì)胞腎支架。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述上皮細(xì)胞是腎上皮細(xì)胞或腎上皮細(xì)胞前體。15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述上皮細(xì)胞是肝上皮細(xì)胞或肝上皮細(xì)胞前體。16.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述支架為脫細(xì)胞肺組織支架。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中，所述上皮細(xì)胞是腎上皮細(xì)胞或腎上皮細(xì)胞前體。18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中，所述上皮細(xì)胞是肝上皮細(xì)胞或肝上皮細(xì)胞前體。19.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述血管區(qū)室具有單根輸入管道和單根輸出管道，所述輸入管道與所述輸出管道彼此流體連通；并且其中，通過(guò)將所述細(xì)胞懸液滴注至所述輸入管道中，將內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞前體引入。20.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，施加在所述脫細(xì)胞支架外部的所述負(fù)壓梯度在10cm?70cmH20的范圍內(nèi)。21.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，施加在所述脫細(xì)胞支架外部的所述負(fù)壓梯度在20cm?60cmH20的范圍內(nèi)。22.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，施加在所述脫細(xì)胞支架外部的所述負(fù)壓梯度在30cm?50cmH20的范圍內(nèi)。23.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物從血液中除去多于20%的代謝廢棄產(chǎn)物。24.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物從血液中除去多于40%的代謝廢棄產(chǎn)物。25.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物從血液中除去多于60%的代謝廢棄產(chǎn)物。26.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物除去血液中多于20%的肌酐。27.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物保留血液中多于20%的血糖。28.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物保留血液中多于20%的血清白蛋白。29.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述工程化生物過(guò)濾組織組合物保留血液中多于40%的血糖?！疚臋n編號(hào)】A61M1/14GK104379726SQ201380032312【公開(kāi)日】2015年2月25日申請(qǐng)日期:2013年3月15日優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日【發(fā)明者】哈拉爾德·C·奧特申請(qǐng)人:通用醫(yī)療公司