配制含有至少兩種能夠吸附到羥基氧化鋁上的抗原的疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題是制備疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物包含羥基氧化鋁（AlOOH）和至少一種乙型肝炎表面抗原與B型流感嗜血桿菌抗原。根據(jù)本發(fā)明，該乙型肝炎表面抗原保持吸附在AlOOH上，而Hib抗原保持未吸附。為此。將該乙型肝炎表面抗原吸附到AlOOH上以獲得AlOOH/HBsAg復合物，隨后使所述AlOOH/HBsAg復合物與Hib抗原在濃度為至少100mg/l的陽離子氨基酸和濃度為35至45mMol/l的磷酸根離子的存在下混合。
【專利說明】配制含有至少兩種能夠吸附到羥基氧化鋁上的抗原的疫苗的方法
[0001]本發(fā)明涉及包含由乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)組成的乙型肝炎效價(hepatitis B valence consisting of the hepatitis B virus surface antigen)和由其莢膜多糖——稱為多聚核糖磷酸鹽(PRP)組成的B型流感嗜血桿菌效價(HBsAg) XHaemophilusinfluenzae type b valence, consisting of its capsular polysaccharide, calledpolyribosylribitol phosphate (PRP))的疫苗組合的領(lǐng)域,所述莢膜多糖為了有效用于兩歲以下兒童而綴合到載體蛋白例如破傷風蛋白上。
[0002]此類組合(其意在施用于幼兒)通常包含能夠在單一操作中針對幾種疾病接種的其它抗原，以及鋁基佐劑。
[0003]因此，專利申請WO 99/13906公開了一種疫苗組合物，如第13頁中所述，包含針對白喉、破傷風、脊髓灰質(zhì)炎、百日咳、乙型肝炎和B型流感嗜血桿菌感染的抗原。這些抗原的一部分必須吸附到鋁鹽上以便是免疫原性的。這尤其是具有乙型肝炎表面抗原或HBsAg的情況。
[0004]但是，如申請WO 99/13906的第12頁上所示，由綴合到破傷風蛋白上的莢膜多糖組成的該Hib效價當其吸附到招鹽上時傾向于經(jīng)時(au cours du temps)喪失其免疫原性。為了避免這一缺點，現(xiàn)有技術(shù)中提出的解決方案是，如已經(jīng)在在線申請PCT/FR96/00791中建議的那樣，添加陰離子，特別是磷酸根、碳酸根或檸檬酸根離子。
[0005]但是，本發(fā)明的作者已經(jīng)注意到，雖然添加陰離子特別是添加磷酸根或碳酸根實際上能夠防止PRP-T吸附到羥基氧化鋁(A100H)上，并因此經(jīng)時保持其免疫原性，這種添加仍具有解吸附乙型肝炎表面抗原的缺點(當后者本身已經(jīng)吸附到羥基氧化鋁上時)。
[0006]因此需要尋找一種制備包含羥基氧化鋁的疫苗組合的方法，其中該乙型肝炎表面抗原保持吸附在A100H上，而Hib抗原保持未吸附。
[0007]為此，本發(fā)明的主題是用于制備液體疫苗組合的方法，所述液體疫苗組合包含至少:
-一種乙型肝炎表面抗原(HBsAg) (hepatitis B surface antigen (HBsAg)),
-一種由綴合到載體蛋白上的莢膜多糖組成的B型流感嗜血桿菌(Hib)抗原(Maemophilus influenzae type b (Hib) antigen consisting of capsular polysaccharideconjugated to a carrier protein),
-羥基氧化鋁(A100H)，
其中該乙型肝炎表面抗原保持吸附在A100H上，而該Hib抗原保持未吸附，
其中:
-該乙型肝炎表面抗原吸附到A100H上以獲得AlOOH/HBsAg復合物，
-所述AlOOH/HBsAg復合物在濃度為至少100 mg/1的陽離子氨基酸和濃度為35至45mMol/1磷酸根離子的存在下與該Hib抗原混合。
[0008]借助本發(fā)明的方法，有可能在保持乙型肝炎表面抗原在羥基氧化鋁上的吸附和保持Hib抗原的未吸附之間實現(xiàn)所需平衡。[0009]根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，通過在攪拌下混合AlOOH的懸浮液與HBsAg的懸浮液至少4小時，優(yōu)選至少12小時，優(yōu)選20至24小時將該HBsAg抗原吸附到鋁上。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，在與Hib抗原混合前將陽離子氨基酸添加到所述AlOOH/HBsAg復合物中。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一個替代實施方案，在與AlOOH/HBsAg復合物混合前將陽離子氨基酸添加到所述Hib抗原中。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在與Hib抗原混合前將磷酸根離子添加到所述AlOOH/HBsAg復合物中。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在與Hib抗原混合前將包含AlOOH/HBsAg復合物的制劑的pH值調(diào)節(jié)至7.1 ± 0.1。
[0014]本發(fā)明的主題還是根據(jù)所要求保護的方法獲得的疫苗組合，并包含至少:
-該乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen),
-白喉毒素 D 形式的白喉抗原(diphtheria antigen in the form of diphtheria toxin
D)，
-破傷風毒素 T 形式的破傷風抗原(tetanus antigen in the form of tetanus toxin
T)，
-純化毒素(PTxd)和絲狀血凝素(FHA)形式的百日咳抗原(whooping cough antigensin the form of Purified Toxin (PTxd) and of Filamentous Hemagglutinin (FHA)),
-綴合到破傷風蛋白上的多聚核糖磷酸鹽(PRP-T)形式的B型流感嗜血桿菌抗原{Haemophilus influenzae type b antigen, in the form of polyribosylribitol phosphateconjugated to the tetanus protein (PRP-T))，
-滅活的I型、2型和3型病毒形式的脊髓灰質(zhì)炎抗原(pol1 antigens in the form ofinactivated type I, 2 and 3 viruses)。
[0015]此類疫苗組合物具有為液體形式的優(yōu)點，由此避免了獲取凍干物的操作；其已經(jīng)被證實足夠穩(wěn)定以保持免疫原性直到使用時，即使在其制造日期后36個月。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，該疫苗組合物包含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。該抗原特別是乙型肝炎表面抗原，如存在于Recombivax HB ?疫苗，或任何其它乙型肝炎疫苗中的抗原。其特別可以是通過已經(jīng)根據(jù)Crucell開發(fā)的技術(shù)修飾的多形漢遜酵母(Zimse/wJa polymorphayeast)發(fā)酵獲得的重組抗原，如存在于Ifepavax-Gene ?疫苗中的重組抗原。對本發(fā)明的目的而言，存在于0.5毫升劑量中的HBsAg的量有利地為5至15 Pg，特別是10 Pg。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，該疫苗組合物包含B型流感嗜血桿菌(Hib)祝^XHaemophiIusinfluenzae type b (Hib) antigen)。這種抗原由綴合到(conjugu6 ?)載體蛋白上的細菌的莢膜多糖或多聚核糖磷酸鹽(PRP)組成。該載體蛋白可以是疫苗領(lǐng)域的這一方面中使用的任何蛋白質(zhì)。其可以是例如白喉毒素D (diphtheria toxin D)、破傷風毒素T (tetanustoxin T)、流感嗜血桿菌脂蛋白 D {Haemophilus influenzae lipoprotein D)、CRM197 或腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMP) (CRM197 or the N.meningitidis outer membrane protein(OMP))。優(yōu)選使用破傷風蛋白以獲得PRP-T綴合物。對本發(fā)明的目的而言，該PRP-T綴合物可以以每0.5 ml劑量I至30 Pg的PRP ;有利地為每劑量5至25 Pg的PRP ;優(yōu)選每劑量10至15 μδ的PRP ;完全優(yōu)選每劑量10至12 μδ的PRP和更特別為12 μδ的PRP的比例存在，綴合到22-36 μδ的破傷風蛋白上。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，該疫苗組合物包含羥基氧化鋁Α100Η。這種鋁鹽非常普遍地被誤稱為氫氧化鋁?？捎糜诒景l(fā)明的目的的Α100Η可以是例如由Brenntag AG銷售的Α100Η鹽，或來自 ReheisCorp.(Berkeley Heights, NJ)的 Rehydragel ΗΡΑ,盡管這兩種佐劑各自的制造方法不同。計算所用的Α100Η的量以便能夠?qū)崿F(xiàn)令人滿意的免疫反應；這尤其取決于存在于該組合物中的抗原的數(shù)量與性質(zhì)以及這些抗原各自的量。
[0019]純粹作為信息，HBsAg在Α100Η上的最大吸附為每毫克鋁大約780 Pg蛋白質(zhì)(通常，Α100Η的量以鋁Al3+的量表示)。對于包含10 μg的HBsAg的疫苗劑量，不含有任何其它附加抗原，13 μg的鋁因此是足夠的，但是當添加其它抗原時該量不足以獲得所需的功效。而且，取決于一種或多種附加抗原的加入，可以令10 μg的HBsAg與0.01毫克至1.25毫克的鋁接觸，這是歐洲藥典推薦的最大量。
[0020]例如，0.5毫升劑量的包含白喉、破傷風、百日咳和乙型肝炎抗原的兒科疫苗可以常規(guī)地含有0.5至0.7毫克的鋁，優(yōu)選大約0.6毫克的鋁。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，該乙型肝炎表面抗原保持吸附在Α100Η上，這意味著該組合物中存在的這種抗原的總量的至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%以吸附形式存在。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，該Hib抗原保持未吸附在Α100Η上，這意味著該組合物中存在的這種抗原的總量的至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%以未吸附形式存在。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，從組合物制造日期起，當儲存溫度為5 土 3°C時，該乙型肝炎表面抗原保持吸附在A100H上和 Hib抗原保持未吸附的持續(xù)時間為至少3個月、優(yōu)選至少6個月、優(yōu)選至少12個月、優(yōu)選至少18個月、優(yōu)選至少24個月、更優(yōu)選至少36個月。優(yōu)選地，吸附或未吸附抗原的量是經(jīng)時穩(wěn)定的，但是也會發(fā)生改變，條件是其保持在可接受限度內(nèi)。由此，當組合物中存在的HBsAg總量的至少85%吸附在A100H上三個月，自該組合物(該組合物儲存在5 土 3°C下)的制造日期起，在一年后并且仍在相同儲存條件下，該組合物中存在的HBsAg總量的80%完全有可能保持吸附。
[0024]為了評估吸附的抗原的量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任何已知方法。
[0025]關(guān)于HBsAg的吸附百分比的測定，有可能根據(jù)歐洲藥典2.7.1定義的規(guī)則采用夾心ELISA法。簡而言之，在96孔板的孔中，通過IgM類型的抗-HBsAg—級單克隆抗體捕獲HBsAg0由此結(jié)合的HBsAg用IgG類型的抗HBsAg 二級單克隆抗體涂布,該二級抗體本身可以通過過氧化物酶偶聯(lián)抗IgG多克隆抗體來檢測。用于過氧化物酶的發(fā)色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)充當顯影劑。當其加入時，顏色顯現(xiàn)，其強度與孔中捕獲的HBsAg的量成正比。根據(jù)歐洲藥典5.3.3中描述的平行線方法分析結(jié)果。由總HBsAg含量和未吸附HBsAg含量的測定結(jié)果獲得吸附百分比。
[0026]關(guān)于未吸附的PRP-T的量，可以通過HPAEC-PAD(高性能離子交換色譜法-脈沖安培檢測)進行評估。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的方法，該乙型肝炎表面抗原吸附到A100H上。該步驟可以通過以下方法進行:在不存在任何其它抗原的情況下令該乙型肝炎表面抗原與該A100H接觸并令該乙型肝炎表面抗原吸附到該A100H上至少4小時、優(yōu)選至少12小時、完全優(yōu)選20至24小時以獲得含有AlOOH/HBsAg復合物的制劑。根據(jù)本發(fā)明，該吸附可以在不存在磷酸根離子的情況下進行。通過延長該乙型肝炎表面抗原與該AlOOH之間的接觸時間所追求的目的包括使靜電相互作用最大化并促進穩(wěn)定的相互作用，這由此通過配體交換來導致吸附。這種接觸有利地在攪拌下持續(xù)。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的方法，該AlOOH/HBsAg復合物與該Hib抗原在陽離子氨基酸和磷酸根離子的存在下混合。
[0029]對本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“陽離子氨基酸”意在指其PHi高于該疫苗組合物的PH并因此在該疫苗的pH值下為陽離子形式的氨基酸；這些特別是賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)或組氨酸(His);這些氨基酸各自可以單獨使用，以混合物形式結(jié)對使用(Lys+Arg ；Lys+His ；Arg+His)或所有三種一起使用(Lys+Arg+His)。根據(jù)一個特定實施方案,該陽離子氨基酸可以以二肽形式締合。特別可以提及二肽Lys-Lys、Lys_Arg、Lys-His> Arg-Arg>Arg-Lys>Arg-His>His-His>His-Lys和His-Arg?；蛘?用于本發(fā)明的目的的二肽可以由陽離子氨基酸和選自 Ala、Val、Leu、Iso、Pro、Met、Phe> Trp、Gly、Ser、Thr、Cys> Tyr> Asp 和Gln的不帶電荷的氨基酸組成。因此，在實踐中，可以使用含有一種或多種游離和/或二肽形式的陽離子氨基酸的制劑。還有可能使用與其它氨基酸的混合物形式的以所需量包含陽離子氨基酸的氨基酸制劑。為了在添加氨基酸過程中不會產(chǎn)生過大的PH值降低，有可能設想在將其添加到該AlOOH/HBsAg復合物之前通過堿，特別是氫氧化鈉提高包含該氨基酸的制劑的pH值。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，最終存在于該疫苗組合物中的陽離子氨基酸的量必須為至少100mg/Ι，有利地為至少300 mg/1，有利地為至少400 mg/1，完全優(yōu)選為至少500 mg/1。沒有關(guān)鍵的最大劑量。但 是，最大量優(yōu)選為至多2 mg/ml,更優(yōu)選至多I mg/ml,更優(yōu)選至多800 Pg/ml，完全優(yōu)選至多700 Pg/ml。當計算要添加的陽離子氨基酸的量時，應當考慮可以通過介質(zhì)引入的陽離子氨基酸，在所述介質(zhì)中存在除HBsAg與Hib抗原之外的抗原。
[0031]根據(jù)該方法的一個替代方案，有可能相對于該Hib莢膜多糖的重量確定陽離子氨基酸的量，并且有可能提供1:4至1:100、有利地為1:10至1:80、優(yōu)選1:15至1:60或特別優(yōu)選為1:20至1:30或40的Hib多糖/陽離子氨基酸重量比。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法，在陽離子氨基酸的存在下，但也在磷酸根離子的存在下將該AlOOH/HBsAg復合物與該Hib抗原混合。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在AlOOH/HBsAg復合物與Hib抗原接觸前將該磷酸根離子添加到該AlOOH/HBsAg復合物中。該磷酸根離子可能例如通過添加磷酸一氫鈉或磷酸一氫鉀或二者的混合物來引入。計算磷酸根離子的量以使得最大量的乙型肝炎表面抗原保持吸附在A100H上并同時避免Hib抗原的吸附。該量隨存在的抗原的性質(zhì)與數(shù)量而改變，特別是隨HBsAg與Hib抗原之外的抗原而改變。
[0033]因此，對包含通常用于兒科疫苗的抗原——即除HBsAg與Hib抗原之外包含白喉、破傷風和百日咳抗原的疫苗組合，有利的是添加磷酸根離子以使得最終獲得的疫苗組合物中磷酸根離子的濃度至少等于35 mMol/1,更特別為35至45 mMol/1,包括端點；優(yōu)選38至44 mMol/1，包括端點；完全優(yōu)選38至42 mMol/1，包括端點。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，最終獲得的疫苗組合物中磷酸根離子的濃度為40 mMol/1 ο
[0034]根據(jù)一個替代實施方案，磷酸根離子以使得它們以35至38 mMol/1 (包括端點)的最終濃度存在于該疫苗組合物中的量添加。另外，這還可以通過添加碳酸根離子(但是以有限量)來完成，因為事實上已經(jīng)注意到過量的碳酸根離子是不利的。有利的是，它們可以以使得它們以小于或等于10 mMol/1的最終濃度存在于該疫苗組合物中的量添加。
[0035]為了避免可能使HBsAg脫穩(wěn)定化并促進其解吸的過度離子沖擊，建議以幾次(例如2次)不同的操作(步驟)添加磷酸根離子。由此，磷酸根離子可以以能夠?qū)崿F(xiàn)20至30mMol/1 (包括端點)的最終濃度的量在弟一?呆作中添加，；隨后以能夠?qū)崿F(xiàn)上文規(guī)定的最終濃度的量在第二操作中添加。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方案，在將Hib抗原與AlOOH/HBsAg復合物混合之前另外將獲得的制劑的PH調(diào)節(jié)至7.1±0.1。事實上已經(jīng)注意到，此類pH值對保持Hib抗原為未吸附狀態(tài)具有積極效果。
[0037]根據(jù)一個特定實施方案，在混合階段后另外將該pH值調(diào)節(jié)至7.1±0.1。
[0038]由此，通過本發(fā)明的方法可能獲得疫苗組合物，其中:
(i)自組合物制造日期起，在5±3°C的溫度下儲存的組合物中存在的乙型肝炎表面抗原總量的至少60%或80%，優(yōu)選至少85%吸附在A100H上至少3個月；和
(ii)組合物中存在的Hib抗原總量的至少65%、70%或75%未吸附在A100H上。
[0039]術(shù)語“AlOOH/HBsAg復合物”應解釋為是指該復合物至少包含吸附在A100H上的HBsAg抗原。該復合物可以含有其它抗原，無論是否具體說明。
[0040]一種或多種附加抗原可另外用于構(gòu)成該復合物。它們特別可以是白喉類毒素(D) (diphtheria toxoid (D))、破傷風類毒素(T) (tetanus toxoid (T))、百日咳非細胞抗原(whooping cough acellular antigens)如:百日咳博代氏桿菌脫毒毒素(PTxd)(.Bordetella pertussis detoxified toxin (PTxd))、絲狀血凝素(FHA) (filamentoushemagglutinin (FHA))、百日咳桿菌粘附素(69 kDa 抗原)(pertactin (69 kDa antigen))和相同細菌的凝集原(菌毛Xagglutinogens (fimbriae))。根據(jù)一種特別有利的實施方案，可以加入D、T、PTxd和FHA抗原以形成該復合物。
[0041]該附加抗原可以以各種方式加入。它們可以在預吸附的乙型肝炎表面抗原后順序
(i)添加到需要存在于該疫苗組合物中的A100H的總量上；(ii)添加到部分量上，隨后加入以達到該總量?；蛘?，該附加抗原可以如HBsAg那樣單獨吸附到部分量的A100H上。還可以提供混合吸附法——一部分抗原單獨吸附，其它順序吸附。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的方法的一個特定實施方案，獲得的組合物在添加各抗原后攪拌。
[0043]根據(jù)一個有利的實施方案，僅作為實例給出，該HBsAg單獨地吸附到相當于最終組合物中存在的A100H總量的大約30% (三分之一)的部分量A100H上。平行地，該D和T抗原順序吸附該A100H的附加部分上。該PTxd與FHA百日咳抗原隨后添加到含有該A100H-D-T復合物的制劑中，這兩種百日咳抗原各自本身單獨預吸附到A100H上。最后，將這兩種制劑(AlOOH-HBsAg復合物和AlOOH-D-T-PTxd-FHA復合物)組合以形成包含AlOOH-HBsAg-D-T-PTxd-FHA的制劑，其中選擇各元素的量以獲得常規(guī)包含以下成分的0.5毫升的疫苗劑量:
-5至15 Pg的HBsAg/劑量；優(yōu)選10 μδ/劑量，
-20至40 Lf的D/劑量；優(yōu)選25至35 Lf/劑量；完全優(yōu)選30 Lf/劑量(Lf =絮凝極限)(以其它方式表示，D的量大于或等于20 IU/劑量)，
-5至25 Lf的T/劑量；優(yōu)選10至15 Lf/劑量；完全優(yōu)選10 Lf/劑量(以其它方式表示，T的量大于或等于40 IU/劑量)，-20至30 μδ的FHA/劑量；優(yōu)選25 μδ/劑量，
-20至30 μδ的PTxd/劑量；優(yōu)選25 μδ/劑量。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，還加入脊髓灰質(zhì)炎抗原(其常規(guī)由滅活病毒組成)。可以預想加入通常存在于兒科疫苗中的三種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒，即I型、2型或3型，或者，在無需針對三種類型接種的情況下僅引入針對其尋求防護的類型。每劑量的脊髓灰質(zhì)炎病毒的量特別為:
-對于I型，20至43 DU (D抗原單位)，特別為40，
-對于2型，5至9 DU，特別為8，
-對于3型，17至36 DU，特別為32。
[0045]這些抗原不必在添加到疫苗制劑中之前預吸附到鋁鹽上。
[0046]根據(jù)一個特定實施方案，本發(fā)明的方法是一種方法，其中:
(i) Ca)在不存在任何其它抗原的情況下令HBsAg與A100H接觸，并令HBsAg吸附到A100H上至少4小時、優(yōu)選至少12小時、完全優(yōu)選大約24小時以獲得含有AlOOH/HBsAg復合物的制劑；
(i)(b)將包含預 吸附到A100H上的D、T、PTxd和FHA抗原以及任選附加的百日咳博代氏桿菌抗原如百日咳桿菌粘附素和凝集原的制劑添加到點(i) (a)中獲得的制劑中；
(ii)將磷酸根離子添加到點(i)(b)中獲得的制劑中以便獲得40 mMol/1的在疫苗中的最終濃度；
(iii)任選向點(ii)中獲得的制劑中添加脊髓灰質(zhì)炎抗原；
(iV)將含有Hib抗原的制劑添加到點(ii )或(iii )中獲得的制劑中；
(V)將pH值調(diào)節(jié)至7.1±0.1 ;并
(vi) (a)加入至少一種陽離子氨基酸以便在添加該Hib抗原之前完成點(ii)或(iii)中獲得的制劑，或
(b)將至少一種陽離子氨基酸添加到該Hib抗原中；
所述陽離子氨基酸以足以獲得至少100 mg/Ι的在疫苗中的最終濃度的量添加。
[0047]根據(jù)一個特定實施方案，本發(fā)明的疫苗組合物是包含已經(jīng)預先吸附到A100H上的HBsAg、白喉毒素D、破傷風毒素T、PTxd和FHA百日咳抗原，該Hib抗原以及任選的脊髓灰質(zhì)炎效價的組合物，其中:
(i)自組合物制造日期起，在5±3°C的溫度下儲存的組合物中存在的HBsAg總量的至少85%、優(yōu)選至少90%吸附在A100H上至少3個月；和
(ii)組合物中存在的Hib抗原總量的至少65%、70%或優(yōu)選75%未吸附在A100H上，該量經(jīng)時保持相對穩(wěn)定。
[0048]此外，通過本發(fā)明的方法，顯示出對它們有利的是吸附到羥基氧化鋁上以便為免疫原性的除HBsAg之外的抗原也保持吸附。
[0049]因此，例如，可以表明，本發(fā)明的組合物可以包含:
-10 至 30 Pg 的 HBsAg /ml ;優(yōu)選 20 Pg/ml ；
-40 至 80 Lf 的 D/ml，優(yōu)選 50 至 70 Lf /ml ；
-10 至 50 Lf 的 T/ml，優(yōu)選 10 至 30 Lf /ml ；
-40 至 60 Pg 的 FHA/ml ;優(yōu)選 50 Pg/ml ；-40 至 60 Pg 的 PTxd/ml ;優(yōu)選 50 Pg/ml ；
-2 至 60 Pg 的 PRP/ml ;優(yōu)選 20-24 μδ/πι1 ；
-1 至 2 mg 的 AlOOH/ml ;優(yōu)選 1.2 mg 的 ΑΙΟΟΗ/ml ；
-濃度為35至45 mMol/1的磷酸根離子，優(yōu)選38至42 mMol/1的磷酸根離子；
-100至1000 Pg/ml,優(yōu)選400至800 Pg/ml的陽離子氨基酸；和任選地 -滅活形式的I型、2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，各自量為80、16和64 DU/ml。
[0050]如前所述，本發(fā)明的組合物還包含附加的百日咳博代氏桿菌抗原，如百日咳桿菌粘附素(69 kDa)或凝集原。
[0051]附圖描述:圖1是其中在添加各組分后進行混合的現(xiàn)有技術(shù)的方法的示意圖。
[0052]實施例-工業(yè)規(guī)模制備大批量(250升)的H印B-Dt-Tt-百日咳-脊髓灰質(zhì)炎-HiB六價疫苗
在無菌條件并用連續(xù)攪拌進行制備。
[0053]A -吸附到A100H上的HBsAg的制備
將由Brenntag AG銷售的羥基氧化鋁(A100H)凝膠的均勻懸浮液以8克鋁/升在無菌條件下引入到50升罐中。 [0054]在經(jīng)0.22 Mffl過濾器過濾后，將在最終疫苗中獲得20 μδ/πι1的濃度所需體積的HBsAg連續(xù)添加到已經(jīng)含有該Α100Η的罐中。
[0055]令混合物在環(huán)境溫度下攪拌20至24小時以獲得均勻的懸浮液。
[0056]B -制備吸附到鋁凝膠上的D + T + PTxd + FHA
平行地，以下列方法制備鋁凝膠、白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(Τ)、百日咳博代氏桿菌類毒素(PTxd)和百日咳博代氏桿菌絲狀血凝素(FHA)的混合物:
將由Brenntag AG銷售的Α100Η凝膠的均勻懸浮液以8克鋁/升在無菌條件下引入到250升罐中。
[0057]在經(jīng)0.22 Mffl過濾器過濾后，將D的溶液引入到已經(jīng)含有該Α100Η的罐中并在均化后隨即連續(xù)地將T的溶液引入到該罐中以分別獲得60 Lf (絮凝極限)/ml和20 Lf/ml的在最終疫苗中的D與T濃度。
[0058]一旦已經(jīng)獲得均勻混合物，將預吸附到A100H上的PTxd的懸浮液和隨后預吸附到A100H上的FHA的懸浮液連續(xù)地在無菌條件下添加到該罐中以便獲得25 μδ/πι1的在最終疫苗中的PTxd和FHA濃度。
[0059]最后，在經(jīng)0.22 Mm過濾器過濾后添加獲得20至30 mMol/1磷酸根離子濃度所需體積的500 mM磷酸鹽緩沖液。
[0060]在5±3°C的溫度下將所得D-T-PTxd-FHA-AlOOH懸浮液攪拌至少14小時。
[0061 ] C -制備吸附到鋁凝膠上的HBsAg + D + T + PTxd + FHA的混合物
將點A中獲得的制劑在無菌條件下添加到點B中獲得的制劑中。
[0062]攪拌該混合物以獲得均勻的懸浮液。
[0063]隨后在經(jīng)0.22 Mm過濾器過濾后添加在最終組合物中獲得40 mMol/1的磷酸根離子濃度所需體積的500 mM磷酸鹽緩沖液。
[0064]D -用氨基酸溶液飽和該鋁凝膠/HBsAg + D + T + PTxd + FHA復合物的靜電位點 制備含有12種基本氨基酸并具有以下組成的氨基酸溶液:-精氨酸鹽酸鹽……2.1 g/Ι，即1.73 g/Ι的精氨酸
-胱氨酸........................1.2 g/1
-組氨酸........................0.8 g/1
-異亮氨酸.....................2.6 g/1
-亮氨酸........................2.6 g/ 1-賴氨酸鹽酸鹽...............3.65 g/Ι，即2.91 g/Ι的賴氨酸
-蛋氨酸........................0.75 g/1
-苯丙氨酸.....................1.65 g/1
-蘇氨酸........................2.4 g/1
-色氨酸........................0.4 g/1
-酪氨酸........................1.8 g/1
-繳氨酸........................2.35 g/1
也就是說21.2 g/1的氨基酸，包括5.44 g/Ι的陽離子氨基酸(His-Arg-Lys)。
[0065]添加450毫升(0.5升/分鐘)的2.5 N氫氧化鈉(NaOH)。攪拌10分鐘以令其均化。
[0066]該氨基酸溶液，經(jīng)0.22 Mffl過濾器過濾，連續(xù)添加到C中獲得的混合物中以便在最終組合物中獲得572 μδ/πι1的陽離子氨基酸的濃度。
[0067]E - pH 調(diào)節(jié)
用2.5 N的氫氧化鈉過濾原料液將點D中獲得的懸浮液的pH調(diào)節(jié)至pH 7.1 (7.0 -
7.2)。
[0068]F -添加脊髓灰質(zhì)炎抗原
隨后向含有E中獲得的懸浮液的罐中引入經(jīng)0.22 Mffl過濾器過濾的含有滅活形式的脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型1、2和3的制劑(分別為Mahoney、MEF-1和Saukett菌株)。
[0069]G -添加 PRP-T
PRP-T的中間溶液首先以下列方式制備:將預先經(jīng)0.22 Mffl過濾器過濾的Tris-蔗糖緩沖液添加到經(jīng)0.22 Mm過濾器過濾的PRP-T的制劑中，以便構(gòu)成中間混合物。
[0070]將該混合物在無菌條件下引入到F中獲得的混合物中。
[0071]H -最終調(diào)節(jié)階段
在均化G中獲得的懸浮液后，添加足以達到250升的目標體積的一定量的預先過濾的注射級水。隨后，如果需要的話，通過添加預先過濾的2.5 N氫氧化鈉或10%乙酸溶液將該混合物的PH調(diào)節(jié)至pH 7.1 ±0.1。
[0072]混合物在5±3°C下儲存，隨后以0.5毫升/劑量的比例分配到注射器或瓶中。
[0073]0.5毫升的一劑由此含有600 μδ的Al'lO μδ的HBsAg、不少于20 IU的D、不少于40 IU的Τ、25 μδ的Pt、25 μδ的FHA、20至43 DU (D抗原單位)的I型脊髓灰質(zhì)炎、5至9 DU的2型脊髓灰質(zhì)炎、17至36 DU的3型脊髓灰質(zhì)炎、12 μg的PRP (PRP-T形式)、濃度為40 mMol/1的磷酸根離子、濃度為2.5 mMol/1的Tris和2.125%的鹿糖的Tris-鹿糖緩沖液、以及286 Pg的陽離子氨基酸(His - Arg - Lys)。
[0074]臨床試驗
在臨床試驗中測試了根據(jù)上面的實施例制備的疫苗組合物，與市場上目前已經(jīng)存在的稱為Infanrix Hexa?的六價疫苗進行比較,該疫苗能夠針對與根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗相同的疾病(白喉、破傷風、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎、Hib感染和乙型肝炎)為兒童接種疫苗，但是該疫苗特別具有其一部分被凍干并因此在給藥程序之前需要吸收凍干物的操作的缺點。
[0075]在臨床試驗過程中，以包含在2、4和6個月時施加3劑的疫苗方案將兩種類型的疫苗組合物施用給兒童。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的液體疫苗證實具有非常良好的耐受性，并具有與存在于市場上的疫苗相同的免疫原性。
[0076]實驗數(shù)據(jù)
HBsAg的吸附百分比/未吸附的PRP-T的量
三批最終批量產(chǎn)品(PFV39-41-42)和分配到瓶中的三批(S12-13-14)——所有批次根據(jù)提供的實施例獲得一儲存在+5°C下并分別在9和22個月期間的不同時間進行分析。該分析涉及HBsAg的吸附百分比和未吸附的PRP-T的量。
[0077]該HBsAg的吸附百分比如前所述由總HBsAg含量和未吸附的HBsAg含量確定，該HBsAg測定根據(jù)歐洲藥典2.7.1所定義的規(guī)則使用夾心ELISA方法進行。簡而言之，在96孔板的孔中，通過IgM類型的抗-HBsAg —級單克隆抗體捕獲HBsAg。由此結(jié)合的HBsAg用IgG類型的抗HBsAg 二級單克隆抗體涂布,該二級抗體本身可以通過過氧化物酶偶聯(lián)抗IgG多克隆抗體來檢測。用于過氧化物酶的發(fā)色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)充當顯影劑。當其加入時，顏色顯現(xiàn)，其強度與孔中捕獲的HBsAg的量成正比。根據(jù)歐洲藥典5.3.3中描述的平行線方法分析結(jié)果 。
[0078]為了測定HBsAg的吸附百分比，對該疫苗施以離心(8800 g ;5分鐘；20°C)，這能夠回收含有未吸附的HBsAg的上清液。以包括在例如1/400至1/12 800的范圍內(nèi)的2-倍(enserie de 2)連續(xù)稀釋將待測試的上清液樣品在包含解吸緩沖液的ELISA緩沖液中進行稀釋。
[0079]以包括在例如1/8至1/25 600的范圍內(nèi)的2_倍(en serie de 2)連續(xù)稀釋將總疫苗和標準范圍樣品在包含解吸緩沖液的ELISA緩沖液中進行稀釋。
[0080]涂有一級單克隆抗體的96孔板在5°C下培育12小時并隨后用PBS-Tween 20溶液洗滌。將總疫苗的和標準范圍的稀釋上清液分配到孔中。隨后加入二級抗體并用過氧化物酶-綴合抗體和TMB (四甲基聯(lián)苯胺)進行顯色。反應通過加入I N的HCl停止。在各步驟后，將該板在25°C下培育30分鐘并隨后用PBS-Tween 20溶液洗滌。將空白樣(稀釋緩沖液)加入到可用孔中并接受相同的處理。在OD 450和630 nm下讀板。
[0081]關(guān)于未吸附的PRP-T的量，可以通過HPAEC-PAD(高性能離子交換色譜法-脈沖安培檢測)以下列方式進行評估:
首先制備0.5至12.5 μδ/πι1的標準范圍的參比PRP-T。
[0082]待測試樣品以及標準范圍樣品在5000 g下在環(huán)境溫度下離心5分鐘。收集上清液并隨后用含有葡糖胺-1-磷酸鹽作為內(nèi)標(standard interne)的1.5 N的NaCl溶液進行水解。加入空白樣(0.9%的NaCl ;1.5 N的NaOH+內(nèi)標)。
[0083]采用以1.2毫升/分鐘的速率注入柱中的由35 mM的NaOH和114 mM的乙酸鈉組成的流動相進行色譜法。
[0084]使用下列等式計算未吸附的PRP的濃度(Pg/ml):
(PRP峰的表面積/內(nèi)標峰的表面積)=a X [PRP濃度]+ b其中，“a”是斜率，“b”是在y軸上的截距，a和b已經(jīng)由回歸線確定。
[0085]結(jié)果在下面4個表中給出:
【權(quán)利要求】
1.制備液體疫苗組合的方法，所述液體疫苗組合包含至少: -羥基氧化鋁(AlOOH)， -一種乙型肝炎表面抗原(HBsAg)， -一種由綴合到載體蛋白上的莢膜多糖組成的B型流感嗜血桿菌(Hib)抗原， 其中該乙型肝炎表面抗原保持吸附在A100H上，而該Hib抗原保持未吸附， 其中: -該乙型肝炎表面抗原吸附到A100H上以獲得AlOOH/HBsAg復合物， -所述AlOOH/HBsAg復合物在濃度為至少100 mg/1的陽離子氨基酸和濃度為35至45mMol/1磷酸根離子的存在下與該Hib抗原混合。
2.如權(quán)利要求1中所要求保護的方法，其中通過在攪拌下混合A100H的懸浮液與HBsAg的懸浮液至少4小時，優(yōu)選至少12小時，優(yōu)選20至24小時將該HBsAg抗原吸附到鋁上。
3.如前述權(quán)利要求之一所要求保護的方法，其特征在于在與Hib抗原混合前將陽離子氨基酸添加到所述AlOOH/HBsAg復合物中。
4.如權(quán)利要求1和2 之一所要求保護的方法，其特征在于在與AlOOH/HBsAg復合物混合前將陽離子氨基酸添加到所述Hib抗原中。
5.如前述權(quán)利要求之一所要求保護的方法，其特征在于在與Hib抗原混合前將磷酸根離子添加到所述AlOOH/HBsAg復合物中。
6.如前述權(quán)利要求之一所要求保護的方法，其特征在于與Hib抗原混合前將包含AlOOH/HBsAg復合物的制劑的pH值調(diào)節(jié)至7.1 ± 0.1。
7.如權(quán)利要求1中所要求保護的方法，其特征在于所述方法還包括: -制備包含至少一種選自白喉、破傷風、脊髓灰質(zhì)炎和百日咳抗原的抗原，以及羥基氧化鋁的組合物，和 -在進行與Hib抗原的混合之前，將所述AlOOH/HBsAg復合物與所述組合物混合。
8.如權(quán)利要求7中所要求保護的方法，其特征在于其包括通過將各抗原連續(xù)添加到羥基氧化鋁懸浮液中并在各抗原加入之間攪拌來制備所述組合物。
9.如權(quán)利要求1中所要求保護的方法，其特征在于: -將HBsAg吸附到占最終組合物中存在的A100H總量的三分之一的部分量A100H上20至24小時以形成AlOOH/HBsAg復合物， -平行地，將下列物質(zhì)連續(xù)吸附到附加量的A100H上:白喉毒素D、破傷風毒素T、本身預吸附到A100H上的百日咳博代氏桿菌純化毒素PTxd、和本身預吸附到A100H上的百日咳博代氏桿菌絲狀血凝素FHA，隨后向其中添加磷酸根離子，隨后向其中添加所述A100H/HBsAg復合物， -以能夠在最終組合物中實現(xiàn)40 mMol/1的濃度的量再次添加磷酸根離子， -以以能夠在最終組合物中實現(xiàn)至少100 mg/1的濃度的量添加至少一種陽離子氨基酸， -將該pH調(diào)節(jié)至7.1±0.1， -添加滅活的I型和/或2型和/或3型形式的脊髓灰質(zhì)炎抗原， -添加Hib抗原，-將該pH調(diào)節(jié)至7.1±0.1， -將獲得的組合物分配到注射器中或分配到瓶中。
10.如前述權(quán)利要求之一所要求保護的方法，其特征在于以工業(yè)規(guī)模制備至少250升的疫苗組合物。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法獲得的疫苗組合物，并至少包含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和由綴合到破傷風蛋白上的多聚核糖磷酸鹽(PRP-T)組成的Hib抗原。
12.前述權(quán)利要求中要求保護的疫苗組合物，其特征在于其還包含白喉、破傷風、脊髓灰質(zhì)炎和百日咳抗原。
13.如權(quán)利要求11或12中所要求保護的疫苗組合物，其特征在于其包含至少: -該乙型肝炎表面抗原HBsAg， -白喉毒素D形式的白喉抗原， -破傷風毒素T形式的破傷風抗原， -純化毒素(PTxd)和絲狀血凝素(FHA)形式的百日咳抗原， -綴合到破傷風蛋白上的多聚核糖磷酸鹽(PRP-T)形式的B型流感嗜血桿菌抗原， -滅活的I型、2型和3型病毒形式的脊髓灰質(zhì)炎抗原。
14.如權(quán)利要求13中所要求保護的疫苗組合物，其特征在于其包含至少:
-10 至 30 Pg 的 HBsAg /ml ;優(yōu)選 20 Pg/ml ；
-40 至 80 Lf 的 D/ml，優(yōu)選 50 至 70 Lf /ml ；
-10 至 50 Lf 的 T/ml，優(yōu)選 10 至 30 Lf /ml ；
-40 至 60 Pg 的 FHA/ml ;優(yōu)選 50 Pg/ml ；
-40 至 60 Pg 的 PTxd/ml ;優(yōu)選 50 Pg/ml ； -2 至 60 Pg 的 PRP/ml ;優(yōu)選 20-24 Pg/ml，呈綴合 PRP-T 形式；
-1 至 2 mg 的 AlOOH/ml ;優(yōu)選 1.2 mg 的 ΑΙΟΟΗ/ml ； -濃度為35至45 mMol/1的磷酸根離子，優(yōu)選38至42 mMol/1的磷酸根離子； -100至1000 mg/ι,優(yōu)選400至800 mg/1的陽離子氨基酸；和任選地 -滅活形式的I型、2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，各自量為80、16和64 DU/ml。
【文檔編號】A61K39/295GK104039348SQ201380005797
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月17日
【發(fā)明者】L.貝爾托, I.沙科納克, A.弗朗孔, J-F.奧, S.倫奇格拉夫 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司