一種葉酸靶向的納米粒，其用途以及合成和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種葉酸靶向的納米粒，其用途以及合成和檢測方法。抗腫瘤藥物給藥后，在機體內(nèi)呈非特異性分布，毒副作用大，治療指數(shù)低。采用納米技術(shù)構(gòu)建的具有主動靶向功能的藥物載體—納米粒，可有效解決這一問題。葉酸是常用的靶向分子，可引導藥物主動靶向含葉酸受體的腫瘤細胞，提高藥物抗腫瘤效果。本發(fā)明選用植物甾醇.海藻酸鈉構(gòu)建葉酸靶向的新型納米粒植物甾醇-海藻酸鈉納米粒，將疏水性的抗腫瘤藥物阿霉素包載在其疏水內(nèi)核內(nèi)，制備成載藥的納米粒，使海藻酸鈉、植物甾醇成為抗腫瘤藥物載體的新型材料，自組裝的植物甾醇-海藻酸鈉納米粒作為抗腫瘤藥物載體具有安全性、有效性和靶向性，為將來其作為一種新型藥物載體應用于臨床提供理論基礎(chǔ)。
【專利說明】一種葉酸靶向的納米粒，其用途以及合成和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種葉酸靶向的納米粒，其用途以及合成和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗腫瘤藥物給藥后，在機體內(nèi)呈非特異性分布，毒副作用大，治療指數(shù)低。采用納米技術(shù)構(gòu)建的具有主動靶向功能的藥物載體一納米粒，可有效解決這一問題。葉酸是常用的靶向分子，可引導藥物主動靶向含葉酸受體的腫瘤細胞，提高藥物抗腫瘤效果。本發(fā)明選用植物留醇.海藻酸鈉構(gòu)建葉酸靶向的新型納米粒植物留醇-海藻酸鈉納米粒，將疏水性的抗腫瘤藥物阿霉素包載在其疏水內(nèi)核內(nèi)，制備成載藥的納米粒，使海藻酸鈉、植物留醇成為抗腫瘤藥物載體的新型材料，自組裝的植物留醇-海藻酸鈉納米粒作為抗腫瘤藥物載體具有安全性、有效性和靶向性，為將來其作為一種新型藥物載體應用于臨床提供理論基礎(chǔ)。主動靶向優(yōu)于被動靶向給藥系統(tǒng)，它是經(jīng)過特殊和周密的生物識別設(shè)計，將藥物導向至特異性的識別靶區(qū)，實現(xiàn)到達預定目標的靶向給藥。葉酸是人體必需的維生素，也是主動靶向常用的靶向分子。葉酸受體介導的抗腫瘤藥物載體是利用腫瘤細胞和正常細胞表面FR表達的差異性，特異性結(jié)合腫瘤細胞表面高表達的FR，來實現(xiàn)葉酸結(jié)合物的靶向傳遞，從而減少藥物治療癌癥時對正常細胞的損害。葉酸具有與FR的高親和力、低免疫原性、易于修飾、體積小、高度化學穩(wěn)定性和生物學穩(wěn)定性、高的腫瘤滲透性以及低成本等優(yōu)點，因此葉酸介導腫瘤靶向的研究得到迅速發(fā)展，成為對腫瘤有高度選擇性的新一代靶向劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種葉酸靶向的納米粒，其用途以及合成和檢測方法，以植物留醇作為疏水部分，海藻酸鈉作為親水部分，構(gòu)建新型兩親性的抗腫瘤藥物載體——植物留醇-海藻酸鈉納米粒，同時將葉酸偶聯(lián)在納米粒中，使其具有葉酸靶向的特性，并對其作為藥物載體的可行性進行研究。`研究中將植物留醇和海藻酸鈉聚合成核殼式的結(jié)構(gòu)，并將葉酸偶聯(lián)于其上，制備靶向葉酸的納米粒。利用傅里葉紅外光譜學(FTIR)和熒光光譜學實驗對其結(jié)構(gòu)進行檢測，用透析法制備包載阿霉素的納米粒，用透射電鏡對納米粒的粒徑和形態(tài)進行檢測，并進行納米粒臨界聚集濃度的測定以及阿霉素載藥、釋藥實驗。在體外進行細胞攝取和毒性檢測以及葉酸競爭實驗，最后進行體內(nèi)外抗腫瘤效應檢測。
[0004]具體技術(shù)方案如下:
[0005]一種葉酸靶向的納米粒，其為以植物甾醇作為疏水部分，海藻酸鈉作為親水部分，將葉酸偶聯(lián)在納米粒中構(gòu)建的植物留醇-海藻酸鈉納米粒。
[0006]上述葉酸祀向的納米粒的用途，進一步地，用作藥物載體。
[0007]進一步地，作為抗腫瘤藥物載體。
[0008]上述葉酸靶向的納米粒的合成方法，包括如下步驟:
[0009]( 1)將植物留醇和海藻酸鈉聚合成核殼式的結(jié)構(gòu)；[0010]( 2 )將葉酸偶聯(lián)于其上，形成葉酸靶向的納米粒。
[0011]進一步地，步驟(1)中通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)介導的酯化反應將植物留耦合在海藻酸鈉分子上。
[0012]進一步地，步驟(2)中通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)介導的酯化反應將葉酸耦合在聚合物分子上。
[0013]進一步地，自組裝的納米?？稍谒橘|(zhì)中用探針聲波降解法制備，形成粗糙的球形結(jié)構(gòu)。
[0014]上述葉酸靶向的納 米粒的檢測方法，包括如下步驟:
[0015]a.利用傅里葉紅外光譜學(FTIR)和熒光光譜學實驗對其結(jié)構(gòu)進行檢測；
[0016]b.用透析法制備包載阿霉素的納米粒，用透射電鏡對納米粒的粒徑和形態(tài)進行檢測；
[0017]c.進行納米粒臨界聚集濃度的測定；
[0018]d.進行阿霉素載藥、釋藥實驗；
[0019]e.在體外進行細胞攝取和毒性檢測以及葉酸競爭實驗；
[0020]f.進行體內(nèi)外抗腫瘤效應檢測。
[0021]進一步地，步驟a中，納米粒子和海藻酸鈉的紅外光譜學檢測(FTIR)采用KBr壓片法測定納米粒子和殼聚糖樣品的紅外光譜；納米粒子的熒光光譜學檢測采用芘作為疏水探針，采用熒光光譜學檢測納米粒子的自聚合行為，檢測其臨界聚集濃度。
[0022]進一步地，步驟b中將制備得到的納米粒溶液滴于載有碳膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干表面液體，用2%的磷鎢酸(pH6.0)負染，室溫下自然干燥后在透射電鏡下對納米粒的形態(tài)進行觀察。
[0023]與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明含有葉酸的抗腫瘤藥物載體可通過設(shè)計自組裝的納米粒來實現(xiàn)。納米技術(shù)在藥物輸送系統(tǒng)中的應用，將有助于克服化療過程中的靶向問題，這種應用也將成為今后制藥工業(yè)和生物技術(shù)工業(yè)發(fā)展的重點方向。為達到葉酸靶向的目的，在制備過程中，可采用偶聯(lián)劑將葉酸與納米粒進行偶聯(lián)，制備成具有葉酸靶向的納米粒。在制備納米粒時可通過加入海藻酸鈉和植物留醇來合成，構(gòu)建葉酸靶向的新型兩親性殼聚糖納米?！参锪舸家缓Ｔ逅徕c，將疏水性的抗腫瘤藥物阿霉素包載在其疏水內(nèi)核內(nèi)，制備成載藥的納米粒，探討海藻酸鈉、植物留醇能否成為抗腫瘤藥物載體的新型材料，評價自組裝的納米粒作為抗腫瘤藥物載體的安全性、有效性和靶向性，為將來其作為一種新型藥物載體應用于臨床提供理論基礎(chǔ)。
[0024]具體來說:
[0025]1、納米粒的結(jié)構(gòu)中偶聯(lián)有葉酸，可與腫瘤細胞表面的葉酸受體相識別，將阿霉素靶向運輸至腫瘤細胞，達到良好的治療效果。已通過葉酸競爭實驗得到證實。
[0026]2、納米粒結(jié)構(gòu)中的植物留醇等具有很好的生物相容性、生物降解能力、無毒性和低免疫原性等特征，大大提高了納米粒的生物安全性。
[0027]3、納米粒結(jié)構(gòu)的設(shè)計的殼-核結(jié)構(gòu)在水溶液中很穩(wěn)定，且臨界聚集濃度很低，這為將來這種納米粒應用于疏水藥物的運輸載體提供了必要的保證。
[0028]4、納米粒具有較高的EE比例，減少了藥物的浪費和載體系統(tǒng)使用的限制。
[0029]5、納米粒在偏酸性的腫瘤組織中具有較高的釋藥性能，葉酸受體過表達的腫瘤細胞藥物攝取率高，取得了較好的靶向腫瘤治療效果。
[0030]6、載藥的納米粒對葉酸受體過表達的口腔上皮癌KB細胞和葉酸受體失表達的肺癌A549細胞中具有不同的毒性作用。在葉酸受體過表達的細胞中具有更好的抗腫瘤作用。
[0031]7、載藥的納米粒經(jīng)檢測可在體內(nèi)外發(fā)揮較好的抗腫瘤效應。
【具體實施方式】
[0032]下面為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。
[0033]1、植物甾醇-海藻酸鈉的合成:通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)介導的酯化反應將植物留耦合在海藻酸鈉分子上。
[0034]2、葉酸靶向的自組裝納米粒的制備:先通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)介導的酯化反應將葉酸耦合在聚合物分子上。方法同上。自組裝的納米?？稍谒橘|(zhì)中用探針聲波降解法制備，形成粗糙的球形結(jié)構(gòu)。
[0035]3、納米粒子和海藻酸鈉的紅外光譜學檢測(FTIR):采用KBr壓片法測定納米粒子和殼聚糖樣品的 紅外光譜。
[0036]4、納米粒子的熒光光譜學檢測:采用芘作為疏水探針，采用熒光光譜學檢測納米粒子的自聚合行為，檢測其臨界聚集濃度((^;[1:;[031388代831:;[011001106111^31:;[011,040。0八0水平出現(xiàn)在兩條直線的交叉點。
[0037]5、透射電鏡檢測納米粒的大小及形態(tài):將制備得到的納米粒溶液滴于載有碳膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干表面液體，用2%的磷鎢酸(pH6.0)負染，室溫下自然干燥后在透射電鏡下對納米粒的形態(tài)進行觀察。
[0038]6、納米粒對D0X的包載:采用透析的方法進行包載。
[0039]7、D0X載藥量及包封率檢測:為評價D0X的載藥量和包封率，采用紫外分光光度計在進行檢測并采用空白納米粒的上清液作為對照。
[0040]8、藥物釋放實驗:通過透析的方法檢測載藥納米粒的D0X釋放性能。
[0041]9、細胞攝取實驗:以異硫氰基熒光素(FITC)為標記，采用激光共聚焦顯微鏡觀察葉酸受體過表達的口腔上皮癌KB細胞和葉酸受體失表達的肺癌A549細胞對載藥納米粒的攝取情況。
[0042]10、腫瘤細胞培養(yǎng):選擇葉酸受體過表達的口腔上皮癌KB細胞和葉酸受體缺失的肺癌A549細胞進行體外培養(yǎng)后倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。
[0043]11、MTT比色法檢測細胞毒性:取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整濃度為IX 104/ml，接種于96孔板。藥物作用24、48、72h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5g/L)20y 1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心棄上清，加DMS0150y 1，震蕩后酶標儀570nm下測定各孔的吸光度A，按下式計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%) = (A對照-A實驗)/A對照X 100%
[0044]12、葉酸競爭抑制實驗:將特定濃度的載藥納米粒加入含有不同濃度(0_500mg/L)的游離葉酸的培養(yǎng)基，與兩種類型的腫瘤細胞共培養(yǎng)，通過MTT法檢測細胞毒性。
[0045]13、體內(nèi)抗腫瘤效果檢測:利用建立的荷瘤小鼠模型，研究載藥納米粒的體內(nèi)抑瘤效果。檢測載藥納米粒注入動物體內(nèi)對小鼠腫瘤大小、質(zhì)量、組織學等的影響。同時以健康小鼠為模型觀察載藥納米粒在正常小鼠體內(nèi)的組織分布情況。
[0046]采用天然植物留醇和海藻酸鈉合成納米粒子，探討天然產(chǎn)物植物留醇、海藻酸鈉能否成為抗腫瘤藥物載體的新型材料，評價自組裝、偶聯(lián)有葉酸的納米粒作為阿霉素靶向給藥系統(tǒng)的安全性、有效性和靶向性，從而為其將來作為一種新的抗腫瘤藥物載體應用于臨床提供理論基礎(chǔ)。采用納米技術(shù)進行聚合物的合成，采用傅里葉變換紅外光譜學、熒光光譜學、透射電鏡法等方法鑒定自組裝的納米粒的物理化學特性及形態(tài)學表征等。通過物理包埋法將阿霉素包裹在自組裝的納米粒之中，檢測其藥物裝載及釋放特性。另外在體外進行納米粒的毒性檢測，評價其安全性。并進行細胞攝取實驗和葉酸競爭實驗的檢測，評價其靶向性。最后進行自組裝納米粒的體內(nèi)外抗腫瘤效應檢測，評價其有效性。本研究最主要的目的是探討天然 的植物留醇、海藻酸鈉分別作為疏水部分和親水部分能否成為抗腫瘤藥物載體的新型材料，評價自組裝的納米粒作為抗腫瘤藥物載體的安全性、有效性和靶向性，研究結(jié)果為其將來作為一種新的抗腫瘤藥物載體應用于臨床提供理論基礎(chǔ)。我們期待這種載體具有良好的增溶效果，能大大降低抗腫瘤藥物的毒副作用、有效提高藥物的治療指數(shù)，增強藥物作用的靶向性，能成為將來可以應用于臨床的安全、有效的抗腫瘤藥物載體。
【權(quán)利要求】
1.一種葉酸靶向的納米粒，其特征在于，其為以植物留醇作為疏水部分，海藻酸鈉作為親水部分，將葉酸偶聯(lián)在納米粒中構(gòu)建的植物留醇-海藻酸鈉納米粒。
2.如權(quán)利要求1所述葉酸靶向的納米粒的用途，其特征在于，用作藥物載體。
3.如權(quán)利要求2所述葉酸靶向的納米粒的用途，其特征在于，作為抗腫瘤藥物載體。
4.如權(quán)利要求1所述葉酸靶向的納米粒的合成方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)將植物留醇和海藻酸鈉聚合成核殼式的結(jié)構(gòu)；(2)將葉酸偶聯(lián)于其上，形成葉酸靶向的納米粒。
5.如權(quán)利要求4所述葉酸祀向的納米粒的合成方法，其特征在于，步驟(1)中通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)介導的酯化反應將植物留耦合在海藻酸鈉分子上。
6.如權(quán)利要求4或5所述葉酸靶向的納米粒的合成方法，其特征在于，步驟(2)中通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)介導的酯化反應將葉酸耦合在聚合物分子上。
7.如權(quán)利要求6所述葉酸靶向的納米粒的合成方法，其特征在于，自組裝的納米?？稍谒橘|(zhì)中用探針聲波降解法制備，形成粗糙的球形結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求1所述葉酸靶向的納米粒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟:a.利用傅里葉紅外光譜學(FTIR)和熒光光譜學實驗對其結(jié)構(gòu)進行檢測；b.用透析法制備包載阿霉素 的納米粒，用透射電鏡對納米粒的粒徑和形態(tài)進行檢測；c.進行納米粒臨界聚集濃度的測定；d.進行阿霉素載藥、釋藥實驗；e.在體外進行細胞攝取和毒性檢測以及葉酸競爭實驗；f.進行體內(nèi)外抗腫瘤效應檢測。
9.如權(quán)利要求8所述葉酸祀向的納米粒的檢測方法，其特征在于，步驟a中，納米粒子和海藻酸鈉的紅外光譜學檢測(FTIR)采用KBr壓片法測定納米粒子和殼聚糖樣品的紅外光譜；納米粒子的熒光光譜學檢測采用芘作為疏水探針，采用熒光光譜學檢測納米粒子的自聚合行為，檢測其臨界聚集濃度。
10.如權(quán)利要求8或9所述葉酸靶向的納米粒的檢測方法，其特征在于，步驟b中將制備得到的納米粒溶液滴于載有碳膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干表面液體，用2%的磷鎢酸(PH6.0)負染，室溫下自然干燥后在透射電鏡下對納米粒的形態(tài)進行觀察。
【文檔編號】A61K31/704GK103638528SQ201310674971
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】龔仁敏, 郭瓊, 王建婷 申請人:安徽師范大學