一種特異抑制p21基因表達的siRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異抑制p21基因表達的siRNA及其應用，特異抑制p21基因表達的siRNA為由SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA；對其進行修飾得到的修飾后RNA；體外試驗結果表明，本發(fā)明提供的RNA可以特異高效地抑制p21基因表達，降低脂滴和抑制甘油三酯的沉積。本發(fā)明可以應用于非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機制研究和非酒精性脂肪肝潛在治療。本發(fā)明具有重要價值。
【專利說明】—種特異抑制P21基因表達的siRNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特異抑制p21基因表達的siRNA及其應用。
【背景技術】
[0002]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制，指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在細胞內(nèi)特異降解該mRNA,從而致使特異性的基因有效封閉的過程，是一種序列特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)0 RNAi技術已成功應用于多種生物基因功能的研究。針對目的基因構建siRNA，利用RNAi技術關閉該基因的表達，根據(jù)表型的改變可以分析基因的功能。基因敲除技術需要較長時間永久性地關閉某個基因的表達，而RNAi技術則可在I周內(nèi)，甚至2天內(nèi)可控性地關閉10個基因，因此RNAi可以較靈活、快速得用于造模及后續(xù)的機制研究。籍此，RNAi技術已經(jīng)廣泛運用于疾病發(fā)病機制的研究。
[0003]裸siRNA(未修飾的siRNA)容易降解，其半衰期短，難以攝取，靶向性的缺乏誘發(fā)哺乳動物天然免疫反應，嚴重者可導致細胞和試驗動物死亡，故應用范圍不廣。而化學修飾的siRNA可以使其具有良好的熱力學穩(wěn)定性、細胞穿透力、靶基因沉默活性以及藥物代謝學特征，具有不可比擬的優(yōu)勢。
[0004]近年來，隨著人們生活習慣和飲食結構的改變，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率日益增高,我國已經(jīng)達到 15.35%,且呈不斷升高趨勢；在西方國家更是高達20-25%，已成為第一大肝病；與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝性疾病密切相關。根據(jù)病理學改變及臨床表現(xiàn)，可將NAFLD的自然病程分為單純性NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)?？偟膩碚f，單純性NAFLD是一種良性疾病，但NASH卻可逐漸進展為肝硬化、肝癌等終末期肝病?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，在13年內(nèi)約41 %的`NASH病人可以發(fā)展為肝纖維化，5.4%的NASH病人進展為終末期肝病甚至肝癌。目前NASH已成為隱源性肝硬化最重要的誘因。此外，由于脂變肝臟對很多藥物和毒物的敏感性增加，增加了臨床用藥風險；再者，NAFLD可通過加劇機體代謝紊亂促進糖尿病、冠心病等的發(fā)展，導致代謝綜合征相關腫瘤及心血管事件的高發(fā)；如果脂變肝臟作為供體，會引起移植后肝臟原發(fā)性無功能而導致移植失敗。因此加強NAFLD的相關研究，尤其是NAFLD發(fā)病機制的研究對推動NAFLD的防治工作有著重要的意義。NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制至今尚未明確，目前認為NAFLD與胰島素抵抗、脂肪儲積失調(diào)、脂肪分泌抑制等有關。
[0005]p21是細胞周期重要調(diào)控因子，是依賴周期素的蛋白激酶抑制因子(CKI)中的一員。在正常細胞DNA受損傷時，被P53誘導產(chǎn)生，隨之抑制DNA復制，增強DNA修復，確保遺傳物質(zhì)精確地傳遞給下一代，以消除由于DNA損傷的積累而引起腫瘤發(fā)生的隱患。p21的表達減弱或消失可能使抑制細胞增殖的作用減弱，或細胞正常增生轉變?yōu)樵錾只涣迹瑢е履[瘤發(fā)生的可能。在細胞周期中，如DNA損傷發(fā)生在Gl期，p21可通過抑制⑶K的活性而阻礙細胞進入S期，如DNA損傷發(fā)生在S期，則P21可通過使PCNA(DNA聚合酶的附屬因子)失活而停止DNA合成，從而使細胞修復。
[0006]在NAFLD中相比正常肝細胞，p21表達增強、胞核擴大和染色體端粒短縮。NAFLD患者中，在相同的端粒長度下，細胞核明顯大于正常個體。而RNS (細胞核相關大小)與p21蛋白有著同步的關系。這些結果表明在NAFLD中，肝細胞在端粒明顯縮短前已經(jīng)開始衰老。這一端粒非依賴性衰老可能是慢性氧化應激損傷所致。在當前的一些研究中揭示，在NAFLD的肝細胞中P21表達增加的同時細胞核變大，主要是p21通過結合并不激活大部分的周期依賴蛋白復合物來抑制細胞周期從而使胞核變大。在此基礎上我們推測通過下調(diào)P21的表達，可以延緩和改善肝臟的脂變。目前未見明確的有關P21與非酒精性脂肪肝關系的報道，采用RNAi技術進行p21在NAFLD發(fā)病中機制的研究是對NAFLD發(fā)病機制的重要補充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種特異抑制p21基因表達的siRNA及其應用。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:(該部分我最后添加)
本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提供能夠特異高效抑制P21基因表達的siRNA及對其進行修飾得到的修飾后RNA。體外試驗結果表明，本發(fā)明提供的RNA可以特異高效地抑制p21基因表達，降低脂滴和抑制甘油三酯的沉積。本發(fā)明可以應用于非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制的研究，具有重大價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為Western blottin g檢測轉染siRNA后L02細胞中p21的表達水平的掃描圖。
[0010]圖2為Western blotting檢測轉染siRNA后L02細胞中p21的表達水平半定量。
[0011]圖3為轉染siRNA后各組L02細胞脂變情況的油紅0染色圖。
[0012]圖4為轉染siRNA后各組L02細胞脂變情況的甘油三酯定量圖。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明特異抑制p21基因表達的siRNA，它它是由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA。將所述siRNA進行修飾后得到的修飾后RNA。對合成的siRNA進行化學修飾，能增加siRNA的穩(wěn)定性，同時有效抑制目的基因的表達。siRNA的化學修飾主要有三類:磷酸骨架修飾、核糖修飾和堿基修飾。其中，核糖修飾是siRNA化學修飾最重要的方式。為提高siRNA在體內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力，本發(fā)明中對p21 siRNA的核苷酸序列進行2' - 0-甲基(2' - 0 Me)修飾。2' - 0-甲基這種修飾方式能增強其在血清中的穩(wěn)定性，降低免疫刺激反應強度。具體如下:用甲氧基修飾所述siRNA中的嘧啶核苷酸的核糖的2'羥基，得到的修飾后RNA。
[0014]所述siRNA或所述修飾后RNA在抑制p21基因表達中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述P21基因序列如SEQ ID N0.5所示。
[0015]所述siRNA或所述修飾后RNA可應用于改善脂肪肝。[0016]所述siRNA或所述修飾后RNA可應用于非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制研究。
[0017]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0018]統(tǒng)計學方法:采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件分析，各樣本均數(shù)的比較采用Studentt test分析。
[0019]人正常肝臟細胞株L02，購于美國模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)。
[0020]高脂飼料和正常對照飼料購自浙江省實驗動物中心。兔抗人p21—抗、兔抗人GAPDH —抗購自ProtienTech公司。抗兔IgG 二抗、蘇木素購自北京中杉金橋公司。油紅0購自廣州奧凱公司。甘油三酯測定試劑盒、RIPA裂解液購自普利萊公司。BCA法蛋白測定試劑盒購自Thermo。Lipofectamine ? 2000購自Invitrogen。油酸鈉和軟脂酸鈉購自sigma 公司。PBS 購自 HyClone 公司?；瘜W發(fā)光劑 Supersignal West Pico 購自 Thermo。
[0021]實施例1、siRNA設計合成 一、p21 siRNA 的合成
通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中獲取人P21 mRNA的序列全長(NM_000389.4 ；SEQ ID N0.5)，跟據(jù)RNAi原理，結合設計軟件，在實驗的基礎上，設計合成并針對4個轉錄本篩選出有效的針對人p21基因的一段21nt的siRNA。進行BLAST比對檢查以保證和其他基因沒有同源性。
[0022]p21 siRNA 序列為:
5，-GUCACUGUCUUGUACCCUUTT-3，(正義鏈)(SEQ ID N0.1);5’-AAGGGUACAAGACAGUGACTT-3’(反義鏈)(SEQ ID N0.2)。
[0023]由上海吉瑪制藥技術有限公司(廠址:浦東張江哈雷路1011號602，郵編:201203)進行化學合成:以NTP為原料，利用ABI3900核酸合成儀分別化學合成單鏈RNA，最后在退火緩沖液的條件下各單鏈RNA退火形成雙鏈RNA。為提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，在各鏈化學合成之前，利用化學反應將各鏈合成原料中的嘧啶核苷酸的核糖進行2'羥基的甲氧基替代修飾。
[0024]二、陰性對照siRNA的合成 陰性對照siRNA序列為:
5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(正義)(SEQ ID N0.3)；
5’ -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(反義鏈)(SEQ ID N0.4)。
[0025]由上海吉瑪制藥技術有限公司(廠址:浦東張江哈雷路1011號602，郵編:201203)進行化學合成:以NTP為原料，利用ABI3900核酸合成儀分別化學合成單鏈RNA，最后在退火緩沖液的條件下各單鏈RNA退火形成雙鏈RNA。為提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，在各鏈化學合成之前，利用化學反應將各鏈合成原料中的嘧啶核苷酸的核糖進行2'羥基的甲氧基替代修飾。
[0026]實施例2 、p21 siRNA在體外對L02細胞p21基因表達的影響 一、分組轉染
將L02細胞均勻鋪在6孔板中，分為4組:
高脂實驗組:含有10% (體積百分含量)滅活的新生牛血清、666iimol/L的油酸鈉和333 u mol/L的軟脂酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基；轉染200pmol實施例1的p21 siRNA。
[0027]高脂對照組:含有10% (體積百分含量)滅活的新生牛血清、666 u mol/L的油酸鈉和333 u mol/L的軟脂酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基；轉染200pmol實施例1的陰性對照siRNA。
[0028]正常實驗組:含有10% (體積百分含量)滅活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基；轉染200pmol實施例1的p21 siRNA。
[0029]正常對照組:含有10% (體積百分含量)滅活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基；轉染200pmol實施例1的陰性對照siRNA。
[0030]四組細胞先常規(guī)培養(yǎng)24h，然后根據(jù)組別進行轉染(按Lipofectamine ? 2000試劑說明書操作)，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)36h后換液一次，72小時后根據(jù)組別換相應的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行實驗；培養(yǎng)條件:置于37°C、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0031]二、Western blotting 檢測 p21 蛋白的表達
吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，用冷的PBS洗滌2次，每孔加120 u I預冷的PBS和40 yl4X Loading Buffer [1.0M Tris-HCL (PH 6.8) 2.4ml，十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.8g，二巰基蘇糖醇(DTT) 0.6g，甘油4ml]，充分裂解后收集裂解液，于95°C加熱變性5分鐘，4°C、12000g離心5min后收集上清液，每個樣品取8 yl上樣，行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白充分分離后，轉移到NC膜上，于含5%脫脂奶粉TBST的封閉液中，室溫封閉lh，取出膜用TBST溶液洗滌5minX5次，將膜在合適的分子量處剪開，分別用p21 —抗(1:200稀釋)和內(nèi)參GAPDH—抗(1:1000稀釋)室溫孵育2h，然后TBST洗膜5minX5次，與抗兔IgG 二抗(I:5000稀釋)室溫孵育lh，將膜與化學發(fā)光試劑孵育5min進行顯色反應，在暗室中壓X膠片曝光，洗膠片。對條帶進行光密度掃描。檢測各組ECHSl蛋白和內(nèi)參GAPDH蛋白所對應條帶A值,然后將AeqisiAmpdh的`比值進行統(tǒng)計學分析(Quantity One軟件)。
[0032]結果如圖1、圖2。與陰性對照組比較，p21 siRNA轉染后細胞中p21基因表達顯著下調(diào)0°〈0.01)。
[0033]實施例3、ECHSl siRNA在體外對L02細胞脂變的影響 一、分組轉染
將L02細胞均勻鋪在6孔板中，分為4組。具體分組同實施例2的步驟一。
[0034]二、p21 siRNA在體外對L02細胞脂變的影響 分別將步驟一后的細胞進行如下I或2的實驗。
[0035]1、油紅染色
在6孔板中加入4%多聚甲醛在4°C固定30min，蒸餾水洗兩次后加入油紅0稀釋液(油紅0 0.5g溶于異丙醇100ml配成的飽和液與蒸懼水按3:2稀釋,靜置5_10min后過濾使用)，避光染色10-15min，水洗一次后用60%乙醇鏡下分化至間質(zhì)清晰，水洗兩次后Mayer氏蘇木素復染核8s，水洗兩次后在自來水中反藍30min。對染色后的細胞顯微照相。
[0036]油紅0能夠特異性地將脂滴染成鮮紅色，直觀得反應細胞中脂滴形成情況。結果如圖3所示，油紅0染色顯示高脂實驗組的脂滴明顯低于高脂對照組，有顯著性差異(P<0.05)。這表明:p21 siRNA能改善L02細胞的脂變。
[0037]2、甘油三酯測定
按照甘油三酯測定試劑盒說明書進行操作。具體如下:將6孔板細胞用冷PBS洗滌2次，每孔加入試劑盒裂解液200 u 1，振蕩裂解細胞30min，取50 裂解液采用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白含量測定，其余50iU裂解液轉移到600 ill離心管，70°C加熱30min，室溫2000g離心5min，上層清液用于酶學測定。96孔酶標版中將標準品和待測樣品與工作液按說明書中列表所示體積混勻，37°C反應10min后用酶標儀在490nm波長下檢測，用Excel作圖分析數(shù)據(jù),結合蛋白濃度以每mg蛋白濃度校正甘油三酯含量。
[0038]甘油三酯是脂變細胞中脂滴的主要成分，測定甘油三酯能夠將細胞的脂變情況進一步量化。結果如圖4所示，高脂實驗組的甘油三酯低于高脂對照組，有顯著性差異(7X0.05)。這表明:p21 siRNA能降低L02細胞甘油三酯的沉積，與油紅0染色結果相符。
[0039]以上兩個結果共同說明在體外L02細胞中，p21 siRNA可降低脂滴和抑制甘油三酯的沉積。由此可見， P21在體外促進L02細胞脂肪變中的關鍵地位。
【權利要求】
1.一種特異抑制p21基因表達的siRNA，其特征在于，它是由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA。
2.一種對權利要求1所述siRNA進行修飾得到的修飾后RNA，其特征在于，所述修飾具體為:用甲氧基修飾所述siRNA中的嘧啶核苷酸的核糖的2'羥基。
3.一種權利要求1所述特異抑制p21基因表達的siRNA或權利要求2所述修飾后RNA在抑制p21基因表達中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述p21基因序列如SEQID N0.5所示。
5.一種權利要求1所述特異抑制p21基因表達的siRNA或權利要求2所述修飾后RNA在非酒精性脂肪肝潛在治療的應用。
6.一種權利要求1所述特異抑制p21基因表達的siRNA或權利要求2所述修飾后RNA在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制研究中的應用。
7.一種研究降低被誘導成NAFLD體外模型的人肝L02細胞的脂變方法，其特征在于，是將權利要求1或2所述小干擾RNA導入目的`細胞，得到脂滴下降。
【文檔編號】A61K48/00GK103695421SQ201310651258
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權日:2013年12月9日
【發(fā)明者】虞朝輝, 萬星勇, 余偉來, 厲有名 申請人:浙江大學