一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠及其制備方法和應(yīng)用。其由以下方法制備：a）剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，于TritonX-100溶液中脫細(xì)胞處理，再冷凍干燥，打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾，得到脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉，b）將脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.09-0.11%的胃蛋白酶的鹽酸溶液中消化66-78小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，再加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37℃培養(yǎng)箱中成膠。該脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠具有良好的塑形能力和力學(xué)性能，內(nèi)部疏松，具有一定的孔隙率，膠原纖維直徑合適，穩(wěn)定性好，可滿足制備治療缺血性疾病的藥物、作為組織工程的支架材料和/或細(xì)胞培養(yǎng)的要求。
【專利說明】一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程化凝膠【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維蛋白凝膠是一種良好的支架材料，一直是組織工程研究的重點之一。纖維蛋白凝膠主要由天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分構(gòu)成，具有良好的生物相容性、有效的生物活性以及生物可降解性，同時還具有三維多孔結(jié)構(gòu)和良好的可塑性。近年來，纖維蛋白凝膠作為支架材料日益廣泛地應(yīng)用到組織工程研究中，其對肌組織、骨及軟骨組織、上皮組織等的形成具有重要作用，但同時卻不能為骨及軟骨組織工程提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度。
[0003]脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠是一種組織工程化凝膠，其可應(yīng)用于以下領(lǐng)域:1)用于注射直接治療缺血性疾病:比如下肢缺血、心肌缺血等；2)作為細(xì)胞治療的載體，凝膠混合細(xì)胞后局部注射治療，起到局部限制細(xì)胞流動和流失的作用；3)作為內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中鋪層用，從而起到幫助細(xì)胞粘附、維持細(xì)胞形態(tài)和功能、促進(jìn)增殖等作用；4)可作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的載體，誘導(dǎo)細(xì)胞分化等。
[0004]中國期刊《中華醫(yī)學(xué)雜志》，2004年09期，刊出的論文“以液態(tài)膠原為支架構(gòu)建組織工程化心肌組織的實驗研究”，將添加了基質(zhì)因子的液態(tài)I型膠原與分離并培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞混合，在環(huán)形槽中鑄成了環(huán)形心肌細(xì)胞/膠原條帶。中國期刊《中國組織工程研究與臨床康復(fù)》，2008年49期，刊出的論文“細(xì)胞外基質(zhì)凝膠支架混合人臍靜脈來源內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程化的內(nèi)皮細(xì)胞片層”，其首先取新生SD大鼠鼠尾制備I型液態(tài)膠原溶液，然后將其與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞混合，觀察內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)凝膠中的生長過程及發(fā)育情況。中國專利文獻(xiàn)CN200310118986.4，
【公開日】2004年11月17日，發(fā)明名稱為“一種用骨基質(zhì)凝膠構(gòu)建組織工程軟骨的方法”，其首先用軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)或基質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞即獲取種子細(xì)胞，然后取新西蘭兔或人胚胎長骨或干骺端松質(zhì)骨構(gòu)建骨基質(zhì)凝膠BMG，最后將種子細(xì)胞接種于皮質(zhì)骨或松質(zhì)骨BMG上進(jìn)行體外培養(yǎng)構(gòu)建組織工程軟骨。還有一些報道是將自體來源的血漿通過凍存、離心、沉淀、離子交換、透析等步驟分別獲得纖維蛋白原及凝血酶，并將纖維蛋白原與凝血酶混合，使其在凝血酶作用下產(chǎn)生聚合反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，交聯(lián)成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成纖維蛋白凝膠。
[0005]但是目前關(guān)于脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠及其制備方法還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠。
[0007]本發(fā)明的再一的目的是，提供一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備方法。
[0008]本 發(fā)明的另一的目的是，提供上述脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的用途。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，它是由以下方法制備得到的:a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于
0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換0.9-1.1% TritonX-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾；
b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.09-0.11%的胃蛋白酶的
0.009-0.011mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化66-78小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為1: (850-950)mol/mL。
[0010]優(yōu)選地，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠是由以下方法制備得到的:
a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換1% Triton X-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾；
b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化72小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為l:900mol/mL。
[0011]優(yōu)選地，所述的震蕩脫細(xì)胞處理具體是在37°C搖床，200rpm的條件下處理6_7天。
[0012]優(yōu)選地，所述的將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠具體是將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中至少I小時。
[0013]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備方法，它包括以下步驟:
a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于
0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換0.9-1.1% TritonX-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾；
b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.09-0.11%的胃蛋白酶的
0.009-0.011mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化66-78小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為1: (850-950)mol/mL。
[0014]優(yōu)選地，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備方法包括以下步驟:
a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換1% Triton X-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾；
b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化72小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為l:900mol/mL。
[0015]優(yōu)選地，所述的震蕩脫細(xì)胞處理具體是在37°C搖床,200rpm的條件下處理6_7天。
[0016]優(yōu)選地，所述的將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠具體是將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中至少I小時。
[0017]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的用途，所述的用途選自:
a)制備治療缺血性疾病的藥物，
b)作為組織工程的支架材料，和/或
c)制備細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。
[0018]所述的缺血性疾病是指器官或組織缺血方面的疾病，如下肢缺血、心肌缺血等；所述的作為組織工程的支架材料是指作為細(xì)胞治療的載體，將其混合細(xì)胞后用于局部注射治療；所述的制備細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可以是作為內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中鋪層用，從而起到幫助細(xì)胞粘附、維持細(xì)胞形態(tài)和功能、促進(jìn)增殖等作用，還可以是作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的載體，誘導(dǎo)細(xì) 胞分化等，但不僅限于此。
[0019]需要說明的是，上述“直至血管片變干燥堅硬”，其方法優(yōu)選將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后，再置于真空冷凍干燥箱在溫度一 50°C左右下冷凍干燥46-50小時左右。上述胃蛋白酶消化過程，優(yōu)選在37°C，340-360轉(zhuǎn)/分鐘條件下進(jìn)行磁力攪拌。
[0020]本發(fā)明優(yōu)點在于:
本發(fā)明成功制備得到脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，該制備方法使用Triton X-100溶液進(jìn)行脫細(xì)胞，脫除效果徹底，可獲得純的基質(zhì)成份，胃蛋白酶濃度、處理時間合理，可保證脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉中的蛋白成分充分被消化，保證凝膠的均一性，平衡離子濃度得當(dāng)，可保證I小時后即可快速形成凝膠。所制備得到的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠具有良好的塑形能力，保持了一定的力學(xué)性能，又保證了內(nèi)部疏松，具有一定的孔隙率，膠原纖維直徑合適，成膠穩(wěn)定性好，可滿足制備治療缺血性疾病的藥物、作為組織工程的支架材料和/或細(xì)胞培養(yǎng)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]附圖1是脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備模式圖。
[0022]附圖2是脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠制備過程中脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉的狀態(tài)。
[0023]附圖3是脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠(5mg/ml)的鑒定。
[0024]附圖4是脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠(10mg/ml)的鑒定。
[0025]附圖5是脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠(15mg/ml)的鑒定。
[0026]附圖6是脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的膠原纖維直徑分析結(jié)果。
[0027]附圖7是凝膠60分鐘內(nèi)的OD值變化情況。
【具體實施方式】[0028]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0029]本文中，所述的PBS緩沖液其pH為7.2~7.4，包含以下物質(zhì)組成:NaCl 137mmol/L、KC1 2.7mmol/L、Na2HPO4 10mmol/L、ΚΗ2Ρ04 2mmol/L。IOXPBS 緩沖液就是 0.1M 的 PBS。
[0030]實施例1脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備及檢測(一)
一、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備
1、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉
從屠宰場購買成年豬(約120kg)主動脈，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不規(guī)則的血管小片，放置于1% Triton X-100溶液中，37°C搖床，200rpm震蕩脫細(xì)胞處理6.5天，期間隔天水洗并更換1% Triton X-100溶液直至血管片發(fā)白為止。將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美國)冷凍干燥，溫度一 50°C左右，時間48小時左右，直至血管片變干燥堅硬。然后用小型粉碎機(jī)將其打碎成粉，經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾。
[0031]2、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠
分別稱取50、100、150mg上述步驟I中制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于IOml含質(zhì)量體積濃度為0.1%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.01mol/L鹽酸溶液中，37°C，350轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌消化72小時后加入1/10體積(即Iml)的0.lmol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入1/9體積(即1.1llml)的10XPBS平衡離子濃度。吸取500μ1凝膠溶液放入削掉頭部的2ml注射器中，放入37°C培養(yǎng)箱I小時后即可形成脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠。
[0032]二、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的檢測` UHE染色
將脫細(xì)胞后的血管小片和上述2ml注射器中形成的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠于4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片脫蠟水化后蘇木素染色5分鐘，沖洗后鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗返藍(lán)30分鐘，伊紅染色過夜后乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0033]2、掃描電鏡
將上述2ml注射器中形成的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠用冷的2.5%戊二醛固定24小時，然后I XPBS漂洗三次，每次30分鐘。再經(jīng)過梯度乙醇脫水(30，50，70，90，100)，每次30分鐘，最后放置于100%乙醇中4°C過夜，第二天重新用100%乙醇漂洗3次，每次30分鐘。之后用真空干燥箱干燥后離子噴射儀噴金，然后進(jìn)行掃描電鏡(FEI QUANTA 250)觀察并拍照。
[0034]3、凝膠膠原纖維直徑分析
計算脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠中的膠原纖維直徑時，在脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的掃描電鏡圖上隨機(jī)挑選100根纖維，通過Image軟件測量其直徑，最后求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并做統(tǒng)計分析。
[0035]4、凝膠吸光度測試
將放在冰上的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠樣本(包括上述步驟制備的三種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液比例分別為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml)各吸取10μ1放入96孔板，每個樣本重復(fù)6個孔，放入預(yù)熱到37°C的多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(SYNERGY/2MICROPLATE READER, BioTek)，檢測405nm吸光度下的數(shù)據(jù)，每2分鐘讀取一次，持續(xù)60分鐘。
[0036]三、實驗結(jié)果1、脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉的制備
根據(jù)脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備模式圖(圖1)中的方法制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉，新鮮豬主動脈剪碎后呈紅色(圖2A)，脫除細(xì)胞后外觀呈白色(圖2B)，HE染色顯示細(xì)胞脫除干凈，剩下基質(zhì)成份(圖2C)，真空冷凍干燥后血管變得硬而干燥(圖2D)，用小型粉碎機(jī)打碎后呈均勻的白色粉末(圖2E)。
[0037]2、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的形成
將上述打碎的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化72小時候后呈乳白色粘稠狀(圖2F)，氫氧化鈉中和，調(diào)節(jié)好離子濃度放入37°C培養(yǎng)箱I小時后可見半透明膠凍狀半固體形成，具有良好的塑形能力(圖3A、3B、4A、4B、5A、5B)。
[0038]3、凝膠HE染色
HE染色可見脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠內(nèi)部形成了細(xì)胞外基質(zhì)為主要成份的網(wǎng)絡(luò)狀連接，這樣的結(jié)構(gòu)既保持了一定的力學(xué)性能，又保證了內(nèi)部疏松，具有一定的孔隙率(圖3C、4C、5C)。
[0039]4、凝膠掃描電鏡
掃描電鏡結(jié)果顯示脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠表面具有良好的膠原纖維結(jié)構(gòu)，呈無序的網(wǎng)格狀交叉排布，除膠原的其余基質(zhì)成份分布其中或者附著在膠原纖維表面(圖3D、4D、)。
[0040]5、凝膠膠原纖維直徑分析
通過統(tǒng)計，5mg/ml的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠膠原纖維直徑為5.82037nm±l.39185nm，10mg/ml凝膠膠原纖維直徑為5.89368nm±l.25852nm，這兩者之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P = 0.3532)，而15mg/ml凝膠的膠原纖維直徑為96.27796nm±19.78365nm，與前兩者具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P=4.15593E-68 和 1.48086E-68)(圖 6)。
[0041 ] 6、凝膠405nm吸光值檢測
37°C下，脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠在405nm處的吸光值結(jié)果來看，脫細(xì)胞基質(zhì)逐漸變混濁并呈膠狀，20-30分鐘左右變得穩(wěn)定，至60分鐘其OD值保持不便(圖7)，說明成膠穩(wěn)定性好。
[0042]實施例2脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備及檢測(二)
一、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備
1、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉
從屠宰場購買成年豬(約120kg)主動脈，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不規(guī)則的血管小片，放置于0.9% Triton X-100溶液中，37°C搖床，200rpm震蕩脫細(xì)胞處理7天，期間隔天水洗并更換0.9% Triton X-100溶液直至血管片發(fā)白為止。將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美國)冷凍干燥，溫度一 50°C左右，時間46小時左右，直至血管片變干燥堅硬。然后用小型粉碎機(jī)將其打碎成粉，經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾。
[0043]2、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠
分別稱取50、100、150mg上述步驟I中制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于IOml含質(zhì)量體積濃度為0.09%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.009mol/L鹽酸溶液中，37°C，360轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌消化78小時后加入1/10體積(即Iml)的0.09mol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入1/8.5體積(即1.176ml)的10XPBS平衡離子濃度。吸取500μ1凝膠溶液放入削掉頭部的2ml注射器中，放入37°C培養(yǎng)箱I小時后即可形成脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠。[0044]二、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的檢測 檢測方法同實施例1。
[0045]三、實驗結(jié)果 1、脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉的制備
新鮮豬主動脈剪碎后呈紅色，脫除細(xì)胞后外觀呈白色，HE染色顯示細(xì)胞脫除干凈，剩下基質(zhì)成份，真空冷凍干燥后血管變得硬而干燥，用小型粉碎機(jī)打碎后呈均勻的白色粉末。
[0046]2、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的形成
將上述打碎的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化78小時候后呈乳白色粘稠狀，氫氧化鈉中和，調(diào)節(jié)好離子濃度放入37°C培養(yǎng)箱I小時后可見半透明膠凍狀半固體形成，具有良好的塑形能力。
[0047]3、凝膠HE染色
HE染色可見脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠內(nèi)部形成了細(xì)胞外基質(zhì)為主要成份的網(wǎng)絡(luò)狀連接，具有一定的孔隙率。
[0048]4、凝膠掃描電鏡
掃描電鏡結(jié)果顯示脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠表面具有良好的膠原纖維結(jié)構(gòu)，呈無序的網(wǎng)格狀交叉排布，除膠原的其余基質(zhì)成份分布其中或者附著在膠原纖維表面。
[0049]5、凝膠膠原纖維直徑分析
通過統(tǒng)計，5mg/ml的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠膠原纖維直徑為5.85068nm±l.27134nm，10mg/ml凝膠膠原纖維直徑為5.91672nm±l.30861nm,這兩者之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而15mg/ml凝膠的膠原纖維直徑為95.87289nm±20.34718nm,與前兩者具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差
巳
[0050]6、凝膠405nm吸光值檢測
37°C下，脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠在405nm處的吸光值結(jié)果來看，脫細(xì)胞基質(zhì)逐漸變混濁并呈膠狀，20-30分鐘左右變得穩(wěn)定，至60分鐘其OD值保持不便，說明成膠穩(wěn)定性好。
[0051]實施例3脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備及檢測(三)
一、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備
1、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉
從屠宰場購買成年豬(約120kg)主動脈，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不規(guī)則的血管小片，放置于1.1% Triton X-100溶液中，37°C搖床，200rpm震蕩脫細(xì)胞處理6天，期間隔天水洗并更換1.1% Triton X-100溶液直至血管片發(fā)白為止。將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美國)冷凍干燥，溫度一 50°C左右，時間50小時左右，直至血管片變干燥堅硬。然后用小型粉碎機(jī)將其打碎成粉，經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾。
[0052]2、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠
分別稱取50、100、150mg上述步驟I中制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于IOml含質(zhì)量體積濃度為0.11%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.01 lmol/L鹽酸溶液中，37°C，340轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌消化66小時后加入1/10體積(即Iml)的0.1 lmol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入1/9.5體積(即1.053ml)的10XPBS平衡離子濃度。吸取500μ1凝膠溶液放入削掉頭部的2ml注射器中，放入37°C培養(yǎng)箱1.1小時后即可形成脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠。[0053]二、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的檢測 檢測方法同實施例1。
[0054]三、實驗結(jié)果
1、脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉的制備
新鮮豬主動脈剪碎后呈紅色，脫除細(xì)胞后外觀呈白色，HE染色顯示細(xì)胞脫除干凈，剩下基質(zhì)成份，真空冷凍干燥后血管變得硬而干燥，用小型粉碎機(jī)打碎后呈均勻的白色粉末。
[0055]2、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的形成
將上述打碎的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化66小時候后呈乳白色粘稠狀，氫氧化鈉中和，調(diào)節(jié)好離子濃度放入37°C培養(yǎng)箱1.1小時后可見半透明膠凍狀半固體形成，具有良好的塑形能力。
[0056]3、凝膠HE染色
HE染色可見脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠內(nèi)部形成了細(xì)胞外基質(zhì)為主要成份的網(wǎng)絡(luò)狀連接，具有一定的孔隙率。
[0057]4、凝膠掃描電鏡
掃描電鏡結(jié)果顯示脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠表面具有良好的膠原纖維結(jié)構(gòu)，呈無序的網(wǎng)格狀交叉排布，除膠原的其余基質(zhì)成份分布其中或者附著在膠原纖維表面。
[0058]5、凝膠膠原纖維·直徑分析
通過統(tǒng)計，5mg/ml的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠膠原纖維直徑為5.97253nm±l.28240nm,10mg/ml凝膠膠原纖維直徑為5.86259nm±l.29851nm,這兩者之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而15mg/ml凝膠的膠原纖維直徑為94.99804nm±21.01755nm,與前兩者具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差
巳
[0059]6、凝膠405nm吸光值檢測
37°C下，脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠在405nm處的吸光值結(jié)果來看，脫細(xì)胞基質(zhì)逐漸變混濁并呈膠狀，20-30分鐘左右變得穩(wěn)定，至60分鐘其OD值保持不便，說明成膠穩(wěn)定性好。
[0060]對比例I
一、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備
1、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉
從屠宰場購買成年豬(約120kg)主動脈，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不規(guī)則的血管小片，放置于0.85% Triton X-100溶液中，37°C搖床，200rpm震蕩脫細(xì)胞處理7天，期間隔天水洗并更換0.85% Triton X-100溶液直至血管片發(fā)白為止。將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱(Labconco Triad 2.5L,美國)冷凍干燥，溫度一 50°C左右，時間46小時左右，直至血管片變干燥堅硬。然后用小型粉碎機(jī)將其打碎成粉，經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾。
[0061]2、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠
分別稱取50、100、150mg上述步驟I中制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于IOml含質(zhì)量體積濃度為0.09%的胃蛋白酶(P7012-lG，Sigma)的0.0009mol/L鹽酸溶液中，37°C，360轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌消化78小時后加入1/10體積(即Iml)的0.009mol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入1/8.5體積(B卩1.176ml)的10XPBS平衡離子濃度。吸取500μ1凝膠溶液放入削掉頭部的2ml注射器中，放入37°C培養(yǎng)箱I小時后即可形成脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠。[0062]二、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的檢測 檢測方法同實施例1。
[0063]三、實驗結(jié)果
1、脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉的制備
HE染色顯示細(xì)胞脫除不徹底，基質(zhì)成份中夾雜細(xì)胞。
[0064]對比例2
一、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備
1、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉
從屠宰場購買成年豬(約120kg)主動脈，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不規(guī)則的血管小片，放置于1% Triton X-100溶液中，37°C搖床，200rpm震蕩脫細(xì)胞處理6.5天，期間隔天水洗并更換1% Triton X-100溶液直至血管片發(fā)白為止。將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美國)冷凍干燥，溫度一 50°C左右，時間48小時左右，直至血管片變干燥堅硬。然后用小型粉碎機(jī)將其打碎成粉，經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾。
[0065]2、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠
分別稱取45mg、155mg上述步驟I中制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于IOml含質(zhì)量體積濃度為0.1%的胃蛋白酶(P7012-lG，Sigma)的0.001mol/L鹽酸溶液中，37°C，350轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌消化72小時后加入 1/10體積(即Iml)的0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入1/9體積(B卩1.1llml)的10XPBS平衡離子濃度。吸取500μ1凝膠溶液放入削掉頭部的2ml注射器中，放入37 °C培養(yǎng)箱成膠。
[0066]二、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的檢測 檢測方法同實施例1。
[0067]三、實驗結(jié)果
1、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的形成
將上述打碎的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化72小時候后呈乳白色粘稠狀，氫氧化鈉中和，調(diào)節(jié)好離子濃度放入37°C培養(yǎng)箱中成膠。5小時后濃度為
4.5mg/ml的處理仍不能形成膠凍狀半固體；1小時后15.5mg/ml的處理可見半透明膠凍狀半固體形成，具有良好的塑形能力。
[0068]2、凝膠HE染色
HE染色可見15.5mg/ml的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠內(nèi)部分散有大量顆粒，表明脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉未能完全消化。
[0069]對比例3
一、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備
1、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉
從屠宰場購買成年豬(約120kg)主動脈，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不規(guī)則的血管小片，放置于1.1% Triton X-100溶液中，37°C搖床，200rpm震蕩脫細(xì)胞處理6天，期間隔天水洗并更換1.1% Triton X-100溶液直至血管片發(fā)白為止。將經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美國)冷凍干燥，溫度一 50°C左右，時間50小時左右，直至血管片變干燥堅硬。然后用小型粉碎機(jī)將其打碎成粉，經(jīng)過60目篩網(wǎng)過濾。
[0070]2、制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠
分別稱取50、100、150mg上述步驟I中制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于IOml含質(zhì)量體積濃度為0.11%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.01 lmol/L鹽酸溶液中，37°C，340轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌消化66小時后加入1/10體積(即Iml)的0.1 lmol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后分別加入1/8.4體積(即1.190ml)、1/9.7體積(即1.031ml)的10XPBS平衡離子濃度。吸取500μ1凝膠溶液放入削掉頭部的2ml注射器中，放入37°C培養(yǎng)箱成膠。
[0071]二、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的檢測 檢測方法同實施例1。
[0072]三、實驗結(jié)果
1、脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的形成
上述處理放入37°C培養(yǎng)箱3小時后仍未見半透明膠凍狀半固體形成，可見其塑形能力較差。
[0073]2、凝膠掃描電鏡
掃描電鏡結(jié)果顯示脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠表面膠原纖維結(jié)構(gòu)呈交叉排布，但是有聚集現(xiàn)象，除膠原的其余基質(zhì)成份分布也出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。
[0074]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補充，這些改進(jìn)和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，其特征在于，它是由以下方法制備得到的: a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換0.9-1.1% TritonX-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾； b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.09-0.11%的胃蛋白酶的0.009-0.011mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化66-78小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為1: (850-950)mol/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，其特征在于，它是由以下方法制備得到的: a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換1% Triton X-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾； b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化72小時， 加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為l:900mol/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，其特征在于，所述的震蕩脫細(xì)胞處理具體是在37°C搖床,200rpm的條件下處理6_7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠，其特征在于，所述的將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠具體是將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中至少I小時。
5.一種脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟: a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換0.9-1.1% TritonX-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾； b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.09-0.11%的胃蛋白酶的0.009-0.011mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化66-78小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為1: (850-950)mol/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟: a)制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震蕩脫細(xì)胞處理，期間隔天水洗并更換1% Triton X-100溶液；再將脫細(xì)胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷凍過夜后置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥直至血管片變干燥堅硬；打碎成粉，60目篩網(wǎng)過濾； b)取步驟a)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉放置于含濃度為0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L鹽酸溶液中，磁力攪拌消化72小時，加入氫氧化鈉溶液中和鹽酸，然后加入PBS平衡離子濃度，最后將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠；其中，所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)粉與鹽酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉摩爾量與鹽酸溶液中鹽酸摩爾量相等，所述的PBS與鹽酸溶液的比例為l:900mol/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的的制備方法，其特征在于，所述的震蕩脫細(xì)胞處理具體是在37°C搖床，200rpm的條件下處理6-7天。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的的制備方法，其特征在于，所述的將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中成膠具體是將凝膠溶液放入37°C培養(yǎng)箱中至少I小時。
9.權(quán)利要求1或2所述的脫細(xì)胞血管基質(zhì)凝膠的用途，其特征在于，所述的用途選自: a)制備治療缺血性疾病的藥物， b)作為組織工程的支架材料，和/或 c)制備細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。
【文檔編號】A61L27/36GK103705542SQ201310642466
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】付煒, 馮蓓, 殷猛, 王偉 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心