一種脫細胞基質(zhì)修復凝膠及其制備新方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及組織基質(zhì)材料制備，尤其涉及一種脫細胞基質(zhì)修復凝膠及其制備的新方法，屬于生物材料領域。
【背景技術】
[0002]組織器官的修復與重建是指組織、器官損傷后由臨近健康細胞通過再生來修補恢復的過程，由于組織自發(fā)愈合過程固有的缺陷，一旦組織和器官出現(xiàn)缺損或功能障礙時，就會造成一定程度上的再生障礙或者是永久性缺損。因此組織器官的修復與重建一直是生物、醫(yī)學等相關領域的焦點。伴隨著對組織再生修復機制及組織工程學研究的開展和深入，尋找及研制各種有應用價值的可吸收并能促進再生的生物物質(zhì)，已經(jīng)成為該領域的一個熱點。
[0003]細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由動物細胞合成并分泌到細胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要成分包括膠原纖維、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖(透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素)等糖類，還有一些脂質(zhì)和生長因子。這些物質(zhì)構成復雜的網(wǎng)架結構，支持并連接組織結構，調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動，在細胞遷移、分化和增殖方面有著重要的作用。由于細胞外基質(zhì)可以來源于不同的組織器官，因此不同組織器官的脫細胞基質(zhì)在成分和三維超微結構上也存在差異，研究證實，源自相同組織器官的細胞外基質(zhì)在修復相同組織器官的損傷時效果更好，Wang等比較了人脂肪脫細胞基質(zhì)和脫細胞小腸黏膜上皮微粒的體內(nèi)成脂能力，結果表明人脂肪脫細胞基質(zhì)更能有效誘導脂肪組織的形成。
[0004]異種或異體細胞抗原由于被宿主認為是外來體，因此引發(fā)了宿主的炎性反應和免疫介導的排斥反應。然而細胞外基質(zhì)是結構蛋白和功能蛋白的復合物，該組分常常在不同物種間保守，并能被異種受體耐受。許多動物組織器官和人體具有相似的細胞外基質(zhì)成分和結構，通過脫細胞技術獲得的ECM生物支架已被廣泛應用與人體組織重建，如心臟膜瓣、皮膚、肌腱和硬腦膜等，其三維結構與體內(nèi)細胞生長的天然環(huán)境接近，不僅可以起著支架材料的作用，而且包含多種生長因子，在組織修復和重建中有重要促進作用。
[0005]目前制備細胞外基質(zhì)的脫細胞方法有很多，主要包括物理法、化學法和生物處理法，但是每種脫細胞方法均會改變ECM成分，引起不同程度超微結構的損害，這些改變會影響人體對植入基質(zhì)材料的反應。因此研究通過溫和的脫細胞方法得到細胞外基質(zhì)，最大限度的保留組織ECM的成分和天然結構，是非常有必要的。
[0006]目前國內(nèi)外研究大多是將細胞外基質(zhì)用于組織工程支架，通過植入人體代替受損組織器官，為組織器官細胞再生提供支架，并隨著自體組織的修復逐漸降解吸收。然而這種傳統(tǒng)的細胞外基質(zhì)支架對于損傷較小、受損區(qū)域不規(guī)則或無需替代的受損組織則不適用，因此國內(nèi)外學者已開始嘗試改變脫細胞基質(zhì)的使用形態(tài)以滿足多種組織或器官修復的需要，申請?zhí)枮?00910191251.1的專利公開了一種用于組織修復的顆粒狀生物材料及制備方法，通過將脫細胞基質(zhì)和膠原、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、殼聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、藻酸鹽中任一種或至少兩種組合而制備的膜片狀生物材料凍干，再在設定參數(shù)下常溫切割成長條，最后切割成粒徑范圍在60 μ m-6000 μ m的顆粒狀，采用注射、噴灑、播撒、填塞方法直接用于組織或器官修復，但是顆粒狀材料黏附性差，粒徑不均造成吸收不平衡，修復效果不理想；申請?zhí)枮?00980135089.X的專利公開了一種制造脫細胞基質(zhì)膠的方法，通過將脫細胞基質(zhì)加入水、生理緩沖液或鹽水中在70?100°C下溫育10分鐘至48小時，形成脫細胞基質(zhì)膠，用于制備包括組織工程和疝修復在內(nèi)的醫(yī)學應用的強化脫細胞基質(zhì)，但是該方法由于溫育溫度高，使得脫細胞基質(zhì)的活性成分如生長因子等被嚴重破壞，使用效果大大降低。
[0007]理想的組織器官修復材料應盡可能模擬人體組織所處的生理環(huán)境，為組織再生提供細胞生長空間，能夠誘導組織細胞再生分化，促進損傷組織的再生修復，并且能滿足不同部位不規(guī)則形狀的修復需要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有脫細胞基質(zhì)修復材料的局限性，提供了一種脫細胞基質(zhì)修復凝膠及其制備方法，通過脫細胞處理和凝膠化處理，將取自哺乳動物的組織器官制備成脫細胞基質(zhì)修復凝膠，消除了異種(體)組織的免疫原性，最大限度的保留了組織細胞外基質(zhì)成分的活性，能夠特異性修復人體受損組織器官，誘導組織再生，并且適用性強，能滿足不同組織各種不規(guī)則形狀修復區(qū)域的需要。
[0009]本發(fā)明制備脫細胞基質(zhì)修復凝膠的策略為:首先對動物組織器官進行預處理，清除血跡和污垢，經(jīng)病毒滅活后剪成碎塊，以利于細胞脫除，然后用去垢劑除去細胞膜脂質(zhì)成分，增加細胞的通透性，再用胰蛋白酶處理，脫除細胞，再經(jīng)核酸酶降解細胞中各類DNA和RNA成分，經(jīng)清洗除掉各種去垢劑后得到脫細胞基質(zhì)，脫細胞基質(zhì)再經(jīng)消化和恒溫孵育得到脫細胞基質(zhì)修復凝膠。
[0010]進一步的，本發(fā)明制備脫細胞基質(zhì)修復凝膠的具體步驟如下:
[0011]I)預處理:用PBS緩沖液清洗除去新鮮動物組織器官上的血跡和污垢；
[0012]2)病毒滅活:將前一步驟預處理后的動物組織器官用病毒滅活試劑浸泡進行病毒滅活，所述病毒滅活試劑為過氧乙酸水溶液；
[0013]3)剪碎:將前一步驟病毒滅活處理后的動物組織器官剪碎；
[0014]4)脫除細胞膜脂質(zhì)成分:用含去垢劑的PBS緩沖溶液脫除細胞膜脂質(zhì)成分，脫除處理后采用PBS緩沖液清洗；
[0015]5)脫細胞:用含胰蛋白酶和EDTA的PBS緩沖溶液脫除細胞，脫除處理后采用PBS緩沖液清洗；
[0016]6)核酸酶處理:用含核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的PBS混合溶液脫除殘留的細胞核成分，酶脫除反應結束后采用PBS緩沖液清洗，得到組織脫細胞基質(zhì)；
[0017]7)消化:將前一步驟的組織脫細胞基質(zhì)置于消化液中振蕩進行消化處理，所述消化液為蛋白酶溶液；
[0018]8)恒溫孵育:消化反應結束后加入PBS緩沖液進行恒溫孵育，即可得到脫細胞基質(zhì)凝膠。
[0019]本發(fā)明所提供的由細胞外基質(zhì)制備凝膠的方法簡單，條件溫和，對細胞外基質(zhì)中的營養(yǎng)因子和生長因子破壞小，修復效果好；同時本發(fā)明還提供了一種溫和的組織脫細胞方法，能夠快速有效的脫除細胞，并且最大限度的保留細胞外基質(zhì)成分的活性。
[0020]在上述技術方案的基礎上，本發(fā)明還可以做如下改進:
[0021]進一步的，步驟I)所述動物組織器官來源于哺乳動物的組織器官。
[0022]所述哺乳動物選自人、豬、牛、羊和兔；所述組織器官選自皮膚、腦膜、膈膜、羊膜、心包膜、心臟瓣膜、小腸粘膜下層、肌肉、血管、肌腱、韌帶、軟骨、食道、胃、神經(jīng)和膀胱。
[0023]進一步，步驟2)所述病毒滅活試劑為質(zhì)量濃度0.1%?1%的過氧乙酸水溶液。
[0024]進一步，步驟2)所述病毒滅活試劑浸泡的時間為0.5?2h。
[0025]進一步，步驟3)動物組織器官剪碎后獲得的碎片或碎塊的粒徑范圍為0.1?1cm。
[0026]進一步，步驟4)所述的含去垢劑的PBS緩沖溶液，去垢劑的濃度為0.1?2wt% ；去垢劑的種類選自曲拉通X-100、脫氧膽酸鈉、平平加，以及十二烷基磺酸鈉中的任一種。
[0027]更進一步，步驟4)所述細胞膜脂質(zhì)成分的脫除方法為:室溫下振蕩處理0.5?2h。
[0028]進一步，步驟5)所述的含胰蛋白酶和EDTA的PBS緩沖溶液，胰蛋白酶的濃度為0.1 ?lwt%，EDTA 的濃度為 0.1 ?lwt%。
[0029]更進一步，步驟5)所述脫除細胞處理的條件為:室溫振蕩處理I?4h。
[0030]進一步，步驟6)所述的含核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的PBS混合溶液，核糖核酸酶的濃度為5?50 μ g/ml,脫氧核糖核酸酶的濃度為50?500 μ g/ml。
[0031]更進一步，步驟6)所述脫除細胞核成分處理的反應條件為室溫振蕩l_2h。
[0032]進一步,步驟7)所述消化液為0.1?0.5wt%的蛋白酶溶液,所述蛋白酶的種類選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及組織蛋白酶中的任一種。
[0033]消化液的pH值為上述蛋白酶的最適pH值，可通過市售商品酶的說明書獲知。通過調(diào)節(jié)PH的方法終止消化反應，之后將pH值調(diào)至人體體液pH值(pH值7.35?7.45)，再進行后續(xù)孵育步驟。
[0034]更進一步，步驟7)消化處理的時間為24?48h。
[0035]進一步，步驟8)所述恒溫孵育的時間為24?48h，孵育溫度為37±1°C。
[0036]本發(fā)明第二方面公開了一種脫細胞基質(zhì)修復凝膠，采用上述方法制備獲得。
[0037]本發(fā)明提供的脫細胞基質(zhì)修復凝膠由哺乳動物的組織器官經(jīng)脫細胞和凝膠化處理得到，用于人體受損組織器官的特異性修復。
[0038]本發(fā)明第三方面公開了前述脫細胞基質(zhì)修復凝膠的制備方法，以及脫細胞基質(zhì)修復凝膠在特異性修復人體受損組織器官中的應用。
[0039]本發(fā)明所述特異性修復，指用源自相同組織器官的脫細胞基質(zhì)凝膠修復相同的受損組織。
[0040]本發(fā)明第四方面公開了前述脫細胞基質(zhì)修復凝膠的制備方法，以及脫細胞基質(zhì)修復凝膠在制備組織損傷修復制劑中的應用。
[0041]本發(fā)明的有益效果如下:
[0042]1.本發(fā)明提供的脫細胞基質(zhì)修復凝膠及其制備方法最大限度的