專利名稱：一種多肽血管組織工程基質(zhì)材料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種合成作為血管組織工程基質(zhì)材料的 多肽，本發(fā)明還涉及此多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織工程中最具挑戰(zhàn)性的一個(gè)課題是移植物的血管生長(zhǎng)和血液供給，而在組織工程血 管的研究中，內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)是最困難的問(wèn)題。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于血管組織非常重要， 它完成對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持血液成份的穩(wěn)定，防止異常凝血，并對(duì)破壞的 內(nèi)皮進(jìn)行修復(fù)。
帶有內(nèi)皮細(xì)胞的組織工程化血管還有助于提高血液和組織相容性，是當(dāng)前組織工程研 究的重點(diǎn)。在血管移植物腔內(nèi)襯附單層血管內(nèi)皮細(xì)胞，就能夠?qū)⒀汉脱鼙诘纳锊牧?隔離開(kāi)，促進(jìn)血液動(dòng)力學(xué)，防止免疫反應(yīng)和血栓。然而，由于動(dòng)脈血管腔內(nèi)急速的血流運(yùn) 動(dòng)，內(nèi)皮細(xì)胞難以錨定在生物材料的表面，使得靜態(tài)培養(yǎng)下形成的內(nèi)皮細(xì)胞單層一旦移植 入體內(nèi)后很快被血流破壞。因此必須開(kāi)發(fā)新的生物材料，使組織工程血管襯附的內(nèi)皮細(xì)胞 有效黏附并較快生長(zhǎng)。
為了達(dá)到上述目的，不同的生物材料已被開(kāi)發(fā)和嘗試。膠原蛋白、纖維粘連蛋白、體 外粘連蛋白等都未達(dá)到預(yù)期效果。 一種經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的自組裝多肽基質(zhì)具備一定的細(xì)胞黏附功
能。這種多肽能夠通過(guò)e -片層結(jié)構(gòu)相互作用形成納米纖維，能夠用于生物材料的表面修飾。
它對(duì)骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等具有較高的黏附能力(Genove E. The effect of fimctionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function. Biomaterials 2005;26:3341-3351.)。然而，這種多肽的P-片層結(jié)合能力較低，導(dǎo)致基質(zhì)材料的強(qiáng)度不甚 滿意，經(jīng)過(guò)一定的功能基團(tuán)修飾后就失去了形成納米纖維的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前血管組織工程研究的難題，提供一種合成多肽，作為血管 組織工程基質(zhì)材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述多肽化合物用于生物材料的表面修飾。 朊蛋白是自然界中存在的、能夠形成較強(qiáng)e-片層結(jié)構(gòu)的多肽。其中酵母朊蛋白Sup35p
具有特定的自組裝序列，能夠攜帶其他結(jié)構(gòu)域共同形成e-片層結(jié)構(gòu)。這種高效組裝、能夠 攜帶其他功能基團(tuán)的特性非常符合組織工程基質(zhì)材料的需要。本發(fā)明設(shè)計(jì)了相互重疊的10氨基酸序列多肽覆蓋Sup35p全蛋白，并分別合成和測(cè)試每條多肽，以篩選Sup35p中的 自組裝多肽序列。實(shí)驗(yàn)篩選出式SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQ ID N0.3所示的多肽序 列，能夠高效組裝成多孔、富含水的組織工程基質(zhì)材料。由于酵母的Sup35p蛋白與哺乳 動(dòng)物(包括人類)并無(wú)同源性，因此這種蛋白對(duì)人類沒(méi)有感染性危害。
因此，本發(fā)明提供的合成多肽，其氨基酸序列如下SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQ IDN0.3，其中，SEQ ID N0.2為SEQIDNO.l前10個(gè)氨基酸組成的片段，SEQIDNO.3 為SEQ IDNO.l最后10個(gè)氨基酸組成的片斷。 這些多肽序列中
Tyr表示英文名稱為threonine,中文名稱為蘇氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Asn表示英文名稱為asparagine，中文名稱為天冬酰胺的氨基酸的相應(yīng)殘基； Leu表示英文名稱為leucine,中文名稱為蘇氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Gin表示英文名稱為Gliitamine，中文名稱為谷氨酰胺的氨基酸的相應(yīng)殘基； Gly表示英文名稱為glycine,中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Ala表示英文名稱為alanine,中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Phe表示英文名稱為phenylalanine,中文名稱為蘇氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。 本發(fā)明所述的多肽序列，還包括所述序列的其類似物和同族物以及他們的衍生序列， 如反向序列和反手鏈。還包括與這些序列具有至少有90%相同性的氨基酸序列。
本發(fā)明所涉及的多肽序列，源于酵母朊蛋白Sup35p的自組裝結(jié)構(gòu)域，能夠相互作用組 裝成為納米纖維及多孔富含水的基質(zhì)材料，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有較強(qiáng)的黏附作用，能夠促進(jìn) 其生長(zhǎng)并形成完全的單層結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的合成多肽可用于促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，對(duì)血 管組織工程研究有著重要的作用。這種多肽材料克服了現(xiàn)有血管組織工程支架材料的多種 問(wèn)題①脫細(xì)胞血管基質(zhì)來(lái)源有限、存在生物源污染和質(zhì)量控制問(wèn)題，可能引發(fā)醫(yī)源性污 染和感染；②高分子聚合材料降解后生物利用率低或?qū)ι矬w有害，如聚乳酸等分解后會(huì) 破壞酸堿平衡環(huán)境；③生物提取物如膠原和殼聚糖等對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附力低，難以形成 具備抗凝和分泌功能的組織工程血管。本發(fā)明多肽血管組織工程基質(zhì)材料具有以下優(yōu)勢(shì)-①純度高，適合工業(yè)生產(chǎn)，能夠避免生物源性污染和感染；②從儲(chǔ)存狀態(tài)達(dá)到功能狀態(tài)時(shí) 間短、操作簡(jiǎn)單。多肽由干粉溶解于磷酸鹽緩沖液后即開(kāi)始自組裝；③形成的基質(zhì)材料富 水、多孔、強(qiáng)韌性高，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附性能較好，能夠攜帶分子量較大的功能基團(tuán)； ④降解完全，生物利用度高。多肽降解后成為氨基酸，可被機(jī)體吸收利用；(D很少引起毒 性反應(yīng)和免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為電鏡下觀察到的多肽形成了多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，平均孔徑為7.5納米。其中，(a)多 肽溶解后24小時(shí)電鏡觀察；(b).多肽溶解后36小時(shí)電鏡觀察)。
圖2為多肽修飾的(a)培養(yǎng)皿與膠原蛋白修飾的(b)培養(yǎng)皿上血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng) 情況。
圖3用多肽修飾的膠原管狀支架與未修飾的支架形成細(xì)胞數(shù)(a)與一氧化氮分泌水 平(b)的對(duì)比。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1多孔富含水基質(zhì)的形成
將多肽(SEQ IDNO.l、 SEQ IDN0.2或SEQ IDN0.3)以0.75%的濃度溶解于磷酸鹽緩 沖液(pH=7.5)中，至于25'C下36小時(shí)，可見(jiàn)膠狀物質(zhì)形成。電鏡下觀察為多孔網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，平均孔徑為7.5納米(如圖1) 實(shí)施例2培養(yǎng)皿的表面修飾
經(jīng)合成和純化的多肽(SEQ ID NO.l 、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.3),以0.75%的濃度溶 解于磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)中，震蕩10秒鐘，均勻浸潤(rùn)培養(yǎng)皿(未進(jìn)行過(guò)表面修飾的) 內(nèi)表面。在室溫內(nèi)放置36小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次。以含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)密度。多肽修飾的培養(yǎng) 皿內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性達(dá)到95%，貼壁良好，呈多角形。對(duì)照組的膠原修飾的培養(yǎng)皿細(xì) 胞連續(xù)性為50%，細(xì)胞呈橢圓形(如圖2)。 實(shí)施例3管狀膠原支架的內(nèi)表面修飾
利用模具制作內(nèi)徑6mm，外徑9mm的管狀膠原支架。向腔內(nèi)注入溶解后6小時(shí)的多 肽，并以12周/小時(shí)的速率旋轉(zhuǎn)孵育24小時(shí)，形成內(nèi)修飾層。將血管內(nèi)皮細(xì)胞以 9xl0、ells/cr^的密度接種于管腔內(nèi)，6周/小時(shí)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)6小時(shí)，然后置入生物反應(yīng)器中， 使管壁形變5%，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞活力和一氧化氮分泌情況?？梢?jiàn)經(jīng)過(guò)多肽修 飾的膠原支架比未經(jīng)修飾的支架形成更高的細(xì)胞活力和一氧化氮分泌水平(見(jiàn)圖3)。圖3 顯示多肽基質(zhì)內(nèi)襯的細(xì)胞數(shù)約為141,300個(gè)/平方厘米，高于膠原內(nèi)襯的39,600個(gè)/平方厘 米；而多肽內(nèi)襯組的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌氧化氮水平約為61納摩爾/百萬(wàn)細(xì)胞，亦顯著高于 對(duì)照組的12納摩爾/百萬(wàn)細(xì)胞。序列表SEQIDNO.l:
NH2 - TyrlAsn - Asn - Asn - Leu - Gin - Gly - Tyr - Gin - Ala - Gly - : he - Gin —門(mén)OOH
SEQIDNP2:
NH2 - Tyr-Asn - Asn - Asn - Leu - Gin - Gly - Tyr - Gin - Ala— COOH
SEQ ID NO.3:
NH2 - Asn - Leu - Gin - Gly - Tyr - Gin - Ala - Gly - Phe - Gin - 80H
權(quán)利要求
1、 一種作為血管組織工程基質(zhì)材料的多肽，其特征在于具有SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，及其類似物和衍生序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于具有所述多肽、類似物或衍生物的氨 基酸序列至少有90%的相同性的氨基酸序列。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的多肽作為血管組織工程基質(zhì)材料在生物材料表面修飾 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種多肽血管組織工程基質(zhì)材料及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，以及它們的類似物和衍生物等。該多肽可以自組裝形成多孔基質(zhì)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附和增殖，因此可以作為血管組織工程基質(zhì)材料，可用于生物材料的表面修飾等。這種多肽材料克服了現(xiàn)有血管組織工程支架材料的多種問(wèn)題，具有①純度高，適合工業(yè)生產(chǎn)；②從儲(chǔ)存狀態(tài)達(dá)到功能狀態(tài)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單；③形成的基質(zhì)材料富水、多孔、強(qiáng)韌性比較高，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附性能較好；④降解完全，生物利用度高；⑤很少引起毒性反應(yīng)和免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/22GK101284149SQ200810038570
公開(kāi)日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日
發(fā)明者杰 許 申請(qǐng)人:上海市第十人民醫(yī)院