一株擬微綠球藻突變株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬微綠球藻(Nannochloropsis?sp)及其應(yīng)用，本發(fā)明的擬微綠球藻具有環(huán)境適應(yīng)能力強，高溫耐受能力強，油脂尤其是二十碳五烯酸含量高，對CO2的處理能力強的更加適于工業(yè)應(yīng)用等優(yōu)點，可用于生物柴油生產(chǎn)，食品、保健品、飼料、水產(chǎn)品餌料、藥物的生產(chǎn)并可用于高溫養(yǎng)殖。
【專利說明】一株擬微綠球藻突變株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種擬微綠球藻突變株ENNl 1-3 (Nannochloropsis sp)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著世界化石燃料儲備量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不斷增加以及全球氣候的日益趨暖，人類的生存和發(fā)展?fàn)顩r已經(jīng)面臨前所未有的挑戰(zhàn)。因此，因此，世界各國都在積極尋找能夠替代石油產(chǎn)品的可再生能源，其中，生物柴油就是一種重要的生物能源，然而，常見的油料作物例如玉米和大豆等培育周期較長，占用農(nóng)田較多，會產(chǎn)生“與人爭糧，與糧爭地”問題，從而導(dǎo)致“解決了能源危機，卻出現(xiàn)糧食危機”的尷尬結(jié)果。
[0003]微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營養(yǎng)豐富，生長周期短，光合利用度高的以光合自養(yǎng)產(chǎn)生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最大的生物質(zhì)資源。在一定條件下許多微藻能夠在細胞中大量積累儲藏性三酰甘油(微藻油)(類似于植物油)，其最高含量可達到細胞干重的50%以上。與高等陸生油料作物相比，微藻的單位面積油產(chǎn)量是油料植物油產(chǎn)量的數(shù)十倍，經(jīng)過生物冶煉可以生產(chǎn)生物柴油等多種生物燃料，被認為是最有可能最有潛力成為石油替代品的生物質(zhì)資源。
[0004]除了油產(chǎn)量非常高之外，微藻還富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、各種氨基酸、維生素、抗生素、高不飽和脂肪酸以及其它多種生物活性物質(zhì)，因此，在保健食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域也同樣具有很好的開發(fā)前景，例如，用于食料和醫(yī)藥業(yè)(人和動物的營養(yǎng)補充物:維生素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖等)；提取化工產(chǎn)業(yè)如化妝品、精細化工產(chǎn)品等；作為能源產(chǎn)生沼氣、燃料；用于餌料和飼料業(yè)(魚蝦、甲殼動物等水產(chǎn)動物的餌料(CN1742570)、家禽飼料等)；農(nóng)業(yè)上作為土壤調(diào)節(jié)劑、肥料等。
[0005]擬微綠球藻(Nannochloropsis sp.)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟微藻，其生長速度快，抗逆性強，脂肪酸組成簡單，富含EPA，是一種非常有潛力的藻種。擬微綠球藻的最適生長溫度為25°C~30°C，當(dāng)溫度超過35°C時，其生長完全被抑制，藻細胞會逐漸死亡。我國大部分地區(qū)夏季炎熱高溫，擬微綠球藻難以在夏季進行大規(guī)模養(yǎng)殖。如果能通過誘變獲得耐受高溫的藻株，將擴大該藻的應(yīng)用范圍，對我國擬微綠球藻養(yǎng)殖具有重要意義。
[0006]目前擬微綠球藻的研究和篩選工作已經(jīng)展開，Ratnesh Chaturvedi和Yuj iFujita (A Isolation of enhanced eicosapentaenoic acid producing mutants ofNannochloropsis oculata ST_6using ethyl methane sulfonate induced mutagenesistechniques and their characterization at mRNA transcript level, PhycologicalResearch54:208 - 219，2006.)針對擬微綠球藻藻株的脂肪酸含量進行了篩選，但所篩選出來的藻株的高溫耐受能力并沒有顯著提高，而且這一藻株是否能推廣至室外培養(yǎng)也有待驗證。楊官品等人(溫度逆境處理提高擬微球藻(Nannochloropsis oculata)研究了溫度逆境處理條件下擬微綠球藻藻株的脂肪酸含量變化，并沒有得到高溫耐受能力提升的藻株。
[0007]因此，在本領(lǐng)域中需要具有高溫耐受能力的擬微綠球藻藻株。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種對環(huán)境適應(yīng)能力強，高溫耐受能力強，油脂含量高，對CO2的處理能力強的更加適于工業(yè)應(yīng)用的擬微綠球藻。
[0009]為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]在第一方面,本發(fā)明提供了一種擬微綠球藻ENN11-3 (Nannochloropsis sp.),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年9月5日，保藏編號為CGMCC N0.6446。
[0011]本發(fā)明提供的擬微綠球藻ENN11-3的生長耐受最高溫度為42°C。。
[0012]本發(fā)明提供的擬微綠球藻ENN11-3 可以在 25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°〇、321:、331:、341:、351:、361:、371:、381:、391:、401:、411:或421:下生長。
[0013]在第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3的培養(yǎng)方法，包括將擬微綠球藻藻株ENN11-3綠色細胞接種在海水培養(yǎng)基中，其中光照強度 50-500 μ mol/m2.s,優(yōu)選 100-450 μ mol/m2.s,更優(yōu)選 150-400 μ mol/m2.s,還更優(yōu)選200-350 μ mol/m2.s,最優(yōu)選 250-300 μ mol/m2.s ；ρΗ 值 7-9,優(yōu)選 7.5-8.5，更優(yōu)選 8 ;溫度25-42°C，優(yōu)選30-38°C ;且在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為1.5-2%的空氣。
[0014]在本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3的培養(yǎng)方法中，光照強度可以為50ymol/m2.S、80 μ mol/m2.S、100 μ mol/m2.S、120 μ mol/m2.S、150 μ mol/m2.S、180 μ mol/m2.S、200 μ mo I/m2.s、220 μ mol/m2.s、250 μ mol/m2.s、280 μ mol/m2.s、300 μ mol/m2.s、320 μ mol/m2.s、350 μ mol/m2.s、380 μ mol/m2.s、400 μ mol/m2.s、420 μ mol/m2.s、450 μ mol/m2.s、480 μ mol/m2.s 或 500ymol/m2.s ;pH 值可以為 7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8 或9 ;溫度可以為 25°C、26 °C >27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41°C或 42°C。
[0015]在第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在脂肪酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸，優(yōu)選為二十碳五烯酸。
[0016]在第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在生物燃料生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
[0017]在第五方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在環(huán)境保護中的應(yīng)用，優(yōu)選地所述環(huán)境保護為CO2減排。
[0018]在第六方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在擬微綠球藻高溫養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其中所述高溫為35-42°C。
[0019]在第七方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的藥物的制備中的用途，優(yōu)選地在制備包含二十碳五烯酸的藥物中的應(yīng)用。
[0020]在第八方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的擬微綠球藻ENN11-3在包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的食品、保健品、飼料和/或水產(chǎn)品餌料生產(chǎn)中的用途。
[0021 ] 在本發(fā)明中，海水培養(yǎng)基為本領(lǐng)域中最常用的藻類培養(yǎng)基，其具體組分見下文。 [0022]本發(fā)明的有益技術(shù)效果為:
[0023]1、本藻種性能穩(wěn)定、環(huán)境適應(yīng)性強，高溫耐受能力強，適合產(chǎn)業(yè)化推廣
[0024]2、本藻種油脂積累快，含油量高，適合用來生產(chǎn)生物柴油
[0025]3、本藻種二十碳五烯酸含量較高，適合用來生產(chǎn)相關(guān)藥物、食品、保健品、飼料、水產(chǎn)品餌料等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是在室內(nèi)柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3的溫度曲線圖。
[0027]圖2是在室內(nèi)柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3的干重變化曲線。
[0028]圖3是在室內(nèi)柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的擬微綠球藻ENNl 1-3的脂肪酸含量(占藻粉)變化圖。
[0029]圖4是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進行室外管式高溫養(yǎng)殖的溫度變化曲線。
[0030]圖5是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進行室外管式高溫養(yǎng)殖的干重變化曲線。
[0031]圖6是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進行室內(nèi)板式高溫養(yǎng)殖的溫度變化曲線。
[0032]圖7是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進行室內(nèi)板式高溫養(yǎng)殖的干重變化曲線。
[0033]圖8是本發(fā)明的擬微綠球藻ENNl 1-3進行室外板式高溫養(yǎng)殖的脂肪酸含量(占藻粉)圖。
[0034]圖9是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進行室外板式廢氣養(yǎng)殖的溫度變化曲線。
[0035]圖10是本發(fā)明的擬微綠球藻ENNl 1-3進行室外板式廢氣養(yǎng)殖的0D750變化曲線。
[0036]圖11是本發(fā)明的擬微綠球藻ENN11-3進行室外板式廢氣養(yǎng)殖的脂肪酸含量(占藻粉)圖。
[0037]發(fā)明詳述
[0038]發(fā)明人已將所述藻株ENN11-3于2012年9月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCC N0.6446。
[0039]下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0040]實施例1ENN11-3藻株的誘變篩選、室內(nèi)養(yǎng)殖及油脂積累
[0041]取對數(shù)期的擬微綠球藻的新鮮無菌藻液進行單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)誘變處理和室外高溫壓力處理，鋪設(shè)平板，挑取個體較大的單藻落共30株進入高溫初篩和高溫復(fù)篩，獲得ENNl 1-3藻株。
[0042]將處在對數(shù)生長期的ENN11-3綠色游動細胞接種在配制好的海水培養(yǎng)基(配方見表1)中，使細胞密度達到0D750為0.8-1.2之間，以野生型ENNll為對照。培養(yǎng)過程光照強度控制在50-500umol/m2.s，在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入1.5-2%的二氧化碳和空氣的混合氣體，將培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)在7-9之間。培養(yǎng)所使用的反應(yīng)器為40mm內(nèi)徑、長度600mm的柱式反應(yīng)器。冷暖水機控溫，室溫25°C培養(yǎng)4天后，第五天溫度升至白天38°C 8小時，夜間30°C ;從第6天起溫度升至白天42°C6小時，其余時間30°C (溫度變化如圖1所示)。培養(yǎng)過程中，定時取樣測定干重，結(jié)果見圖2。培養(yǎng)進行到第15天，將藻液收集，通過離心或自然沉降的方法獲得藻泥，將藻泥再進行真空冷凍干燥。
[0043]表1
[0044]
組分/升
NaCl27.0g
MgSO4JH2O6.6g
MgCl2.6H205 6g
KNO31.45g
CaC12.2H20I 5g
KH2PO40.12g
NaHCO30.04g
Fe-EDTA 溶液I OmL
微量元素溶液I OmL
[0045]Fe-EDTA 溶液:將 2.76g FeCl3.6H20 溶于 IOOOmL0.05M Na2EDTA 溶液微量元素溶液
[0046]
組分/升
CuSO4-SH2OIOmg
ZnSO4JH222mg
[0047]
CoC12.6H20IOmg
MnCl2.4H20丨 80mg
Na2Mo04.2H206mg
[0048]干燥完成后，測定其油脂組分含量如下表2，分析方法如下:
[0049]I)脂肪酸提取 :
[0050]取50mg或IOOmg凍干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶蓋的體積為15_20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4mllO%DMSO-Methanol溶液，40°C砂浴(盛砂的燒杯放置恒溫加熱磁力攪拌器上)5分鐘；然后在4°C下磁力攪拌抽提30分鐘，3500轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1:1的乙醚、正己烷4-8ml4°C下磁力攪拌抽提I小時，3500轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)移上清液到上述一小瓶中?？芍貜?fù)上述過程直到藻渣變白。在上述合并抽提液中加入純水使四者(水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)體積比例為1: 1: 1: 1，震蕩分相，移取有機相轉(zhuǎn)移到另一小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮氣吹至成濃縮液，然后轉(zhuǎn)移到事先稱重過的1.5ml塑料離心管中，再用氮氣吹干至恒重。
[0051]2)脂肪酸分析:
[0052]照上面方法進行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent6820氣相色譜儀進行氣相色譜分析(色譜條件為載氣:氮氣流量lml/min、氫氣流量30ml/min、空氣流量300ml/min,進樣口溫度:280°C，檢測器溫度:280°C，檢測器類型:FID，色譜柱:DB_5毛細管色譜柱(30mX0.25mm, 0.25 μ m),分流比:4:1。分析方法:內(nèi)標(biāo)法(氣相色譜用氮氣作載氣,相當(dāng)于液相色譜的流動相)。
[0053]如圖2所示，加高溫后野生型對照株ENNll生長明顯變緩，培養(yǎng)至第10天野生型對照株ENNll變黃死亡，而突變株ENNl 1-3雖生長也受到影響，但還能緩慢生長，沒有死亡，表現(xiàn)出明顯的耐高溫優(yōu)勢。培養(yǎng)至第9天時，突變株ENN11-3的脂肪酸含量和EPA含量相比野生株都有一定程度的提高。之后野生對照株死亡，突變株ENN11-3的脂肪酸含量和EPA含量在高溫逆境下積累雖然受到一定影響，但還能有效積累。培養(yǎng)第13天時突變株ENNl 1-3的總脂肪酸含量和EPA含量達到最高，第15天有所下降(圖3)。
[0054]表2氣相色譜測 定的ENNl 1-3第13d收集樣品的總脂組分:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種擬微綠球藻ENN11-3 (Nannochloropsis sp.),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年9月5日，保藏編號為CGMCC N0.6446。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻ENN11-3，其特征在于，所述擬微綠球藻ENN11-3的生長耐受:最聞溫度為42°C。
3.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENN11-3的培養(yǎng)方法，所述方法包括將擬微綠球藻藻株ENN11-3綠色細胞接種在海水培養(yǎng)基中，其中光照強度50-500 μ mol/m2.s，優(yōu)選 100-450 μ mol/m2.s,更優(yōu)選 150-400 μ mol/m2.s,還更優(yōu)選 200-350 μ mol/m2.s,最優(yōu)選:250-300 μ mol/m2.s ；ρΗ 值 7-9，優(yōu)選 7.5-8.5，更優(yōu)選 8 ;溫度 25-42°C，優(yōu)選 30-38°C ;且在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為1.5-2%的空氣。
4.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在脂肪酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸，優(yōu)選為二十碳五烯酸。
5.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在生物燃料生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
6.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在環(huán)境保護中的應(yīng)用，優(yōu)選地所述環(huán)境保護為CO2減排。
7.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在擬微綠球藻高溫養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其中所述高溫為35-42 °C。
8.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在制備包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地在制備包含二十碳五烯酸的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1或2所述的擬微綠球藻ENNl1-3在包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y-亞麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的食品、保健品、飼料和/或水產(chǎn)品餌料生產(chǎn)中的用途。
【文檔編號】A61K36/05GK103468577SQ201310433259
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】李青, 羅少敬, 吳洪 申請人:新奧科技發(fā)展有限公司