一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及酪氨酸酶抑制劑的提取方法，旨在提供一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法。該方法包括以下步驟：向干燥后粉碎的茶果皮中加入乙醇水溶液提取，離心過濾得到濾渣和提取液；向濾渣中加入緩沖液浸提，超聲提取、離心過濾得到提取液；再將之前的提取液真空濃縮，然后加入氯仿萃取得到萃余液；最后得到的提取液和萃余液混合，濃縮后冷凍干燥得到酪氨酸酶抑制劑。本發(fā)明通過極性區(qū)別提取有效提高了目標物的萃取精度，并通過酶法結(jié)合超聲提取大大提高了提取的效率，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；制備的酪氨酸酶抑制劑是一種天然高效的酪氨酸酶抑制劑，且對酪氨酸酶的抑制效果顯著；本發(fā)明技術(shù)可以有效提高茶果皮資源的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于酪氨酸酶抑制劑的提取方法，特別涉及一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酪氨酸酶是一類廣泛存在于微生物、動物、植物和人體的銅結(jié)合酶，它具有單酚酶活性和二酚酶活性，能將酪氨酸羥化，產(chǎn)生L-3，4- 二羥基苯丙氨酸(L-D0PA)，然后再將L-DOPA進一步氧化成多巴醌，進一步形成黑色素，是人體各類色斑形成的關(guān)鍵酶。同時，酪氨酸酶也是果蔬褐變的關(guān)鍵酶。大部分水果蔬菜在保存和運輸過程中容易發(fā)生褐變，從而影響其外觀和價值。因此，酪氨酸酶抑制劑能有效阻滯人體各類色斑的形成，同時能有效防止果蔬褐變，在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域均有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]近年來，從植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制劑備受關(guān)注。茶果皮是茶葉籽油加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。隨著2009年茶葉籽油被衛(wèi)生部列入新資源食品后，茶葉籽油大規(guī)模生產(chǎn)，造成大量的茶果皮產(chǎn)生。目前，對于如何有效利用茶果皮資源還鮮見報道。更未見從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的報道或?qū)＠?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能有效利用茶果皮資源，且能提取出天然酪氨酸酶抑制劑的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0005]提供一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，包括干燥和粉碎茶果皮，包括以下具體步驟:
[0006]步驟A:稱取干燥后粉碎的茶果皮，以茶果皮和乙醇水溶液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向茶果皮中加入乙醇水溶液，在50~60°C下提取3~4小時后，離心過濾得到濾渣和提取液；
[0007]步驟B:以步驟A中得到的濾洛和緩沖液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入緩沖液，在40~60°C下浸提2~3小時，然后超聲提取10~20min后離心過濾，得到提取液；所述緩沖液為PH是4~5，含占茶果皮干重2~4%纖維素酶的緩沖液；
[0008]步驟C:將步驟A中得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/15，然后以提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，加入氯仿進行萃取，得到萃余液；
[0009]步驟D:將步驟B中得到的提取液和步驟C中得到的萃余液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制劑。
[0010]作為進一步的改進，所述步驟A中的乙醇水溶液是指體積濃度為95%的乙醇水溶液。
[0011]作為進一步的改進，所述步驟A中離心過濾的條件是5500~6500rpm,離心時間25 ~35min。[0012]作為進一步的改進，所述步驟B中緩沖液的纖維素酶的活力不小于25000U/g。
[0013]作為進一步的改進，所述步驟B中的緩沖液是指磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
[0014]作為進一步的改進，所述步驟B中超聲提取的頻率是200~300W。
[0015]作為進一步的改進，所述步驟B中離心過濾的條件是3000~4000rpm,離心時間25 ~35min。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0017]本發(fā)明通過極性區(qū)別提取有效提高了目標物的萃取精度，并通過酶法結(jié)合超聲提取大大提高了提取的效率，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。同時，本發(fā)明中制備的酪氨酸酶抑制劑是一種天然高效的酪氨酸酶抑制劑，且對酪氨酸酶的抑制效果顯著。此外，本發(fā)明技術(shù)可以有效提高茶果皮資源的經(jīng)濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例中提取的酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶活性的抑制作用對比圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細描述:
[0020]本發(fā)明從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法具體步驟包括:
[0021]步驟A:稱取干燥后粉碎的茶果皮，以茶果皮和體積濃度是95%的乙醇水溶液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向茶果皮中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液,在50~60°C下提取3~4小時后，以5500~6500rpm離心過濾25~35min,得到濾禮:和提取液。
[0022]步驟B:以步驟A中得到的濾洛和緩沖液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入緩沖液，在40~60°C下浸提2~3小時，然后以200~300W的頻率超聲提取10~20min后，以3000~4000rpm離心過濾25~35min,得到提取液。所述緩沖液是磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，PH是4~5，含占茶果皮干重2~4%纖維素酶的緩沖液，纖維素酶的活力不小于25000U/g。
[0023]步驟C:將步驟A中得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/15，然后以提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，加入氯仿進行萃取，得到萃余液。
[0024]步驟D:將步驟B中得到的提取液和步驟C中得到的萃余液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制劑。
[0025]下面的實施例可以使本專業(yè)的專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0026]實施例1
[0027]步驟A:稱取干燥后粉碎的茶果皮20g，以茶果皮和體積濃度為95%的乙醇水溶液為Ig:20ml的比例，向茶果皮中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液，在50°C下提取4小時后，離心過濾得到濾洛和提取液，其中離心過濾的條件是5500rpm,離心時間35min ；
[0028]步驟B:以步驟A中得到的濾渣和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為Ig:20ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在40°C下浸提3小時，然后用200W的頻率超聲提取20min,再用3000rpm的條件離心過濾35min,得到提取液；所述緩沖液為PH是4，含占茶果皮干重2%纖維素酶的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，且纖維素酶的活力不小于 25000U/g ；
[0029]步驟C:將步驟A中得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5，然后以步驟A中得到的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，加入氯仿進行萃取，得到萃余液；
[0030]步驟D:將步驟B中得到的提取液和步驟C中得到的萃余液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制劑1.Sg，得率為9% (占茶果皮干重)。
[0031]實施例2
[0032]步驟A:稱取干燥后粉碎的茶果皮20g，以茶果皮和體積濃度為95%的乙醇水溶液為Ig:25ml的比例，向茶果皮中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液，在55°C下提取3.5小時后,離心過濾得到濾渣和提取液,其中離心過濾的條件是6000rpm，離心時間30min ；[0033]步驟B:以步驟A中得到的濾渣和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為Ig:25ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在50°C下浸提2.5小時，然后用250W的頻率超聲提取15min,再用3500rpm的條件離心過濾30min,得到提取液；所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為PH是4.5，含占茶果皮干重3%纖維素酶的緩沖液，且纖維素酶的活力不小于25000U/g ；
[0034]步驟C:將步驟A中得到的提取液真空濃縮到原體積的1/10，然后以步驟A中得到的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，加入氯仿進行萃取，得到萃余液；
[0035]步驟D:將步驟B中得到的提取液和步驟C中得到的萃余液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制劑2.3g，得率為11.5% (占茶果皮干重)。
[0036]實施例3
[0037]步驟A:稱取干燥后粉碎的茶果皮20g，以茶果皮和體積濃度為95%的乙醇水溶液為Ig:30ml的比例，向茶果皮中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液，在60°C下提取3小時后，離心過濾得到濾渣和提取液，其中離心過濾的條件是6500rpm，離心時間25min ；
[0038]步驟B:以步驟A中得到的濾渣和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在60°C下浸提2小時，然后用300W的頻率超聲提取IOmin,再用4000rpm的條件離心過濾25min,得到提取液；所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為PH是5，含占茶果皮干重4%纖維素酶的緩沖液，且纖維素酶的活力不小于 25000U/g ；
[0039]步驟C:將步驟A中得到的提取液真空濃縮到原體積的1/15，然后以步驟A中得到的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，加入氯仿進行萃取，得到萃余液；
[0040]步驟D:將步驟B中得到的提取液和步驟C中得到的萃余液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制劑3.lg，得率為15.5% (占茶果皮干重)。
[0041]將上述3個實施例的酪氨酸酶抑制劑進行酪氨酸酶抑制效果驗證:將從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑溶解于蒸餾水中，取100 μ I上述溶液，加入PH為6.8的磷酸鹽緩沖液56 μ I與2.0mmoI/L的酪氨酸溶液94 μ I,待混合均勻后,在冰浴中迅速加入酪氨酸酶溶液50μ 1(50U)，在37°C中溫育lOmin，于490nm處測定吸光度。
[0042]酪氨酸酶抑制率計算如下:
[0043]酪氨酸酶抑制率(%)= [ (a-b) - (c-d) ] / [a-b] X 100 %
[0044]a:未加提取物而加酶的混合液所測的吸光度；[0045]b:未加提取物也未加酶的混合液所測的吸光度；
[0046]c:加提取物和酶的混合液所測的吸光度；
[0047]d:加提取物而未加酶的混合液所測的吸光度。 [0048]如圖1所示，從實驗數(shù)據(jù)可以看出，應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)制備的酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，可以應(yīng)用于美容祛斑等藥物和保健品開發(fā)，以及果蔬護色保鮮等領(lǐng)域。
【權(quán)利要求】
1.一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，包括干燥和粉碎茶果皮，其特征在于，包括以下具體步驟: 步驟A:稱取干燥后粉碎的茶果皮，以茶果皮和乙醇水溶液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向茶果皮中加入乙醇水溶液，在50~60°C下提取3~4小時后，離心過濾得到濾渣和提取液； 步驟B:以步驟A中得到的濾渣和緩沖液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入緩沖液，在40~60°C下浸提2~3小時，然后超聲提取10~20min后離心過濾，得到提取液；所述緩沖液為PH是4~5，含占茶果皮干重2~4%纖維素酶的緩沖液； 步驟C:將步驟A中得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/15，然后以提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，加入氯仿進行萃取，得到萃余液； 步驟D:將步驟B中得到的提取液和步驟C中得到的萃余液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟A中的乙醇水溶液是指體積濃度為95%的乙醇水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟A中離心過濾的條件是5500~6500rpm,離心時間25~35min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中緩沖液的纖維素酶的活力不小于25000U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中的緩沖液是指磷酸氫`二鈉-檸檬酸緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中超聲提取的頻率是200~300W。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶果皮中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中離心過濾的條件是3000~4000rpm,離心時間25~35min。
【文檔編號】A61K36/82GK103520373SQ201310433247
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】徐平, 吳婧, 王岳飛 申請人:浙江大學(xué)