一種向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源dna的方法及相關(guān)的葉綠體基因組序列的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的方法及相關(guān)的葉綠體基因組序列。基因序列包括SEQID?NO:1所示的序列、SEQ?ID?NO:2所示的序列以及插入兩者之間的外源基因。具體方法通過(guò)電穿孔法將包括SEQ?ID?NO:1所示的序列、SEQ?ID?NO:2所示的序列以及插入兩者之間的外源基因的葉綠體轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入微擬球藻細(xì)胞。本發(fā)明提供了根據(jù)七株微擬球藻葉綠體基因組之間的保守基因以及微擬球藻葉綠體和硅藻或褐藻葉綠體基因組的保守基因，可以用于設(shè)計(jì)構(gòu)建在微擬球藻中通用的葉綠體遺傳改造體系以及多個(gè)種屬單細(xì)胞微藻通用的葉綠體遺傳改造體系。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的方法及相關(guān)的葉綠體基因組序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的方法及相關(guān)的葉綠體基因組序列。
技術(shù)背景
[0002]能源和資源短缺已經(jīng)成為制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展、影響我國(guó)國(guó)家安全的重大戰(zhàn)略問(wèn)題?；谏锎呋瘎┣鍧?、高效、可再生等特點(diǎn)，生物制造可以大大減少工業(yè)發(fā)展對(duì)化石資源依賴(lài)，減少能耗、物耗、水耗和廢棄物排放，顯著提高經(jīng)濟(jì)效益，增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。與石化路線(xiàn)相比，生物制造可以平均節(jié)能30-50%，減少人類(lèi)對(duì)環(huán)境的影響達(dá)20-60%。太陽(yáng)光是地球上最充足的清潔能源。光合作用是唯一能捕捉太陽(yáng)能的生物途徑，還可以固定二氧化碳，因此是實(shí)現(xiàn)利用太陽(yáng)能與大幅減排CO2進(jìn)行清潔能源生產(chǎn)的有效途徑。
[0003]微藻是最有潛力實(shí)現(xiàn)現(xiàn)實(shí)意義上的光能整合生物制造的細(xì)胞工廠之一，其優(yōu)勢(shì)在于：第一、高效光能轉(zhuǎn)化生物質(zhì)：微藻(包括原核藍(lán)藻和真核藻類(lèi))，和綠色高等植物一樣，有比較完整的光合作用系統(tǒng)。微藻的理論光合作用效率最高可達(dá)10%。相比而言，陸生作物一般僅能將O. 1-0. 7% (C3作物）或I. 5^2. 5% (C4作物）的太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)?？梢?jiàn)，微藻作為光能整合生物加工細(xì)胞工廠的優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)大于陸生植物。此外，一些微藻具備出色的環(huán)境耐受能力，可以在淡水、海水、生活廢水、工業(yè)廢水中生長(zhǎng)；在通入煙道氣時(shí)強(qiáng)勁生長(zhǎng)，能夠室外規(guī)模培養(yǎng)。第二、高效CO2固定：微藻遍布于地球海洋、河流和湖泊等淡水和海洋水體中以及各種土壤(包括酷暑和寒冷的荒蕪環(huán)境）里，甚至人跡罕至的南北極等極端環(huán)境中。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球二氧化碳固定量的40%以上，在能量轉(zhuǎn)化和碳元素循環(huán)中起到重要的作用。大規(guī)模微藻培養(yǎng)有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化方式固定太陽(yáng)能和大幅度減排CO2，提供低碳的清潔能源。第三、高效積累高能量密度、高附加值產(chǎn)物：微藻代謝途徑豐富，以微擬球藻為例，它不僅可以在靜止?fàn)顟B(tài)下大量積累油脂(甘油三酯，即生物柴油)，還可以積累微藻蛋白（藻藍(lán)蛋白、飼料蛋白、必需氨基酸)、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（AA、EPA、DHA)、多種色素(蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素）等高附加值產(chǎn)物，可以用于開(kāi)發(fā)顏料、肥料、土壤調(diào)節(jié)劑、抗氧劑、食品添加劑、化妝品。
[0004]海洋微擬球藻（Nannochloropsis sp.),是一種海洋單細(xì)胞微藻,在分類(lèi)學(xué)上歸屬于褐藻門(mén)（Phaeophyta),大眼藻綱（Eustigmatophyceae),單珠藻科（Monodopsidaceae)。微擬球藻直徑2-5 μ m，無(wú)組織分化，生態(tài)分布廣泛；具有豐富的在藏藻株資源；進(jìn)化地位獨(dú)特，是單細(xì)胞微藻中獨(dú)立的一個(gè)屬。有研究比較了 31種微藻的生物量、脂質(zhì)含量及產(chǎn)量，其中海洋微藻Nannochloropsis的脂質(zhì)產(chǎn)量排在第一位(表1)。已發(fā)現(xiàn)許多株Nannochloropsis都具有I)生長(zhǎng)迅速；2)在高光強(qiáng)或營(yíng)養(yǎng)缺失條件下積累大量三脂酰甘油（TAG)等優(yōu)點(diǎn)。此外，在一些大型(如美國(guó)Solix公司）和半工業(yè)規(guī)模(亞利桑那州立大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所）室外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通入煙道氣時(shí)，Nannochloropsis (如 Nannochloropsissalina和 Nannochloropsis oculata 0Z—I)倉(cāng)泛強(qiáng)勁生長(zhǎng)，且能在生長(zhǎng)靜止期積累大量的油脂，具備大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)的潛力。此外，微擬球藻藻體微小，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸，已被作為優(yōu)良餌料大量應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖；微擬球藻還含有多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的色素，如玉米黃素、斑蝥黃素和蝦青素等?？梢?jiàn)，微擬球藻作為功能基因組學(xué)研究和商業(yè)化應(yīng)用具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0005]表1代表性藻種生物量積累、油脂含量和油脂產(chǎn)量
[0006]
【權(quán)利要求】
1.一種向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的序列，其特征在于：序列包括SEQ ID NO: I所示的序列、SEQ ID N0:2所示的序列以及插入兩者之間的外源基因。
2.按權(quán)利要求1所述的向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的序列，其特征在于：所述基因序列包括SEQ ID NO: I所示微擬球藻葉綠體基因組中的等效序列、SEQ ID N0:2所示微擬球藻葉綠體基因組中的等效序列以及插入兩者之間的外源基因。
3.按權(quán)利要求1或2所述的向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的序列，其特征在于：所述外源基因?yàn)橐粋€(gè)或多個(gè)基因。
4.按權(quán)利要求1或2所述的向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的序列，其特征在于：所述DNA序列具有葉綠體適用的啟動(dòng)子、終止子和選擇標(biāo)記的DNA片段。
5.一種權(quán)利要求1所述的利用向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的基因序列的導(dǎo)入外源DNA的方法，其特征在于：通過(guò)電穿孔法將包括SEQID NO: I所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入兩者之間的外源基因的葉綠體轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入微擬球藻細(xì)胞。
6.按權(quán)利要求5所述的利用向微擬球藻葉綠體中導(dǎo)入外源DNA的基因序列的導(dǎo)入外源DNA的方法，其特征在于：通過(guò)電穿孔法將包括SEQ IDNO: I所示微擬球藻葉綠體基因組中的等效序列、SEQ ID N0:2所示微擬球藻葉綠體基因組中的等效序列以及插入兩者之間的外源基因的葉綠體轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入微擬球藻細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103834640SQ201210494514
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月27日
【發(fā)明者】路延篤, 徐健, 辛一, 魏力 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所