專利名稱：:含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體及其應用的制作方法含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體及其應用
技術領域：
：[0001]本發(fā)明涉及一種葉綠體表達載體，尤其涉及一種含EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因玉米葉綠體表達載體及其構建方法，本發(fā)明還涉及該EPSP合酶基因玉米葉綠體表達載體在提高玉米草甘膦抗性中的應用，屬于玉米抗草甘膦轉基因工程領域。
背景技術：
：[0002]1988年Boynton等首次利用基因槍法將帶有atpB野生型基因的葉綠體DNA轟擊了atpB突變的衣藻，使其恢復了光合作用的能力，從而標志著葉綠體基因工程的開始。1900年首次利用基因槍法將rrnie基因在煙草葉綠體中得到表達，拉開了高等植物葉綠轉化的帷幕。水稻、玉米及小麥等禾本科植物是重要的糧食作物，但是葉綠體轉化技術在禾本科植物的應用進展卻很緩慢。2006年，Lee等首次將GFP和aadA基因成功重組到水稻(Oryzasativa)葉綠體基因組中，為葉綠體轉化技術在禾本科植物中的應用奠定了基礎(Lee,S.Μ.，etal.，Plastidtransformationinthemonocotyledonouscerealcrop,rice(Oryzasativa)andtransnmissionoftransgenestotheirprogeny.MolCells，2006.21(3):401-410.)。李軼女等(李軼女等.水稻葉綠體表達體系的建立及抗PPT葉綠體轉化植株的獲得.中國農(nóng)業(yè)科學，2007.40(9):1849-1855.)選擇ndhF與trnL的基因間序列作為除草劑PPT抗性基因bar定點整合的位點，將bar基因重組到水稻葉綠體基因中，bar基因在水稻基因組中正常的表達，既提高了水稻抗PPT的能力，又可以作為轉化的篩選標記。Cui等利用基因槍法將GFP和nptII基因轉化小麥未成熟盾片和花序，培養(yǎng)獲得了轉化植株，為葉綠體轉化技術成功的應用到禾本科植物培育新的品種奠定了基礎(Cui，C.,etal.，Stablechloroplasttransformationofimmaturescutellaandinflorescencesinwheat(TriticumaestivumL.).ActaBiochimBiophysSin(Shanghai).43(4)p.284-91.)。[0003]葉綠體轉化的表達效率高且外源基因可以定點整合，顯花植物每個葉肉細胞含有約100個葉綠體，每個葉綠體含有約100個葉綠體基因組拷貝，如果完全同質化并有強啟動子存在，外源基因可以得到高效的表達，同時葉綠體對外源基因的表達有很強的承受能力。葉綠體可以直接表達來自原核的基因；葉綠體基因組具有原核性，葉綠體基因組多順反子轉錄、基因排列、調(diào)控方式、密碼子的偏愛性等與原核性很相似。葉綠體的原核性利于原核來源基因的表達。但是真核基因在葉綠體基因中也能很好的表達。多基因可以同時轉化，提高轉化效率；葉綠體基因組具有重疊基因，是以多順反子為轉錄單位，產(chǎn)生多順反子mRNA來合成蛋白質，所以由一個啟動子引導下的多個外源基因可以同時在葉綠體中表達，可實現(xiàn)多個基因的同時表達，多個外源基因可以同時進行表達，而不相互影響，避免因多個相同的啟動子調(diào)控多個基因在表達時產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。葉綠體轉化沒有載體序列，位置效應和多效應；屬于母性遺傳，后代材料穩(wěn)定；安全性高。葉綠體是母系遺傳，外源基因不會隨花粉傳播，造成基因漂移。[0004]草甘膦是一種高效、廣譜、低殘留、低毒、易被微生物分解和內(nèi)吸傳導的非選擇性的除草劑，被廣泛的應用于農(nóng)業(yè)，其對大多數(shù)植物具有滅生性。由于草甘膦使用容易、高效、價格便宜，各國不斷增加草甘膦的生產(chǎn)量滿足日益增加的需求。轉基因的抗草甘膦作物大面積推廣給農(nóng)民提供了草甘膦使用的新領域。1996年孟山都公司開發(fā)的抗草甘膦大豆GTS40-3-2首次銷售，到目前為止已經(jīng)有超過1000個商業(yè)化的抗草甘膦大豆品種。[0005]迄今為止，抗草甘膦的大豆、棉花、玉米、花生、煙草、甜菜等作物得到了推廣。2003年全世界抗草甘膦大豆種植面積大于0.41億hm2，其它抗除草劑的作物也大量的推廣，主要是抗草甘膦品種。從已經(jīng)推廣的抗草甘膦作物來看，主要是美國的孟山都公司開發(fā)，轉入的基因是CP4EPSPS基因。孟山都將抗草甘膦作物種子與農(nóng)達除草劑捆綁式銷售，已經(jīng)形成了獨霸的局面。雖然從微生物、植物等克隆出了一些抗除草劑的EPSPS基因，也獲得了相應的轉基因植物，但是很少能達到推廣的水平。[0006]目前中國國內(nèi)還沒有出現(xiàn)廣泛推廣的抗草甘膦的新品種。[0007]葉綠體轉化體系具有表達效率高且外源基因可以定點整合，無論是真核還是原核的外源基因都可以在葉綠體中高效的表達，尤其是葉綠體屬于母系遺傳，后代材料穩(wěn)定，安全性高，外源基因不會隨花粉傳播，造成基因漂移等優(yōu)勢，所以受到愈來愈多的重視。
發(fā)明內(nèi)容[0008]本發(fā)明的目的之一是提供一種含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體；[0009]本發(fā)明的目的之二是提供一種構建所述含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體的方法；[0010]本發(fā)明的目的之三是將所構建的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體應用于提高玉米的草甘膦抗性。[0011]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，該含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體包括EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)編碼基因的表達盒，玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶編碼基因的表達盒位于同源重組片段atpB和rbcL之間。[0012]所述的EPSP合酶基因是公開號為CN1014^499A(發(fā)明名稱高耐受草甘膦的EPSP合酶及其編碼序列)中所述的編碼EPSP合酶的編碼基因，該基因序列已在該專利文獻(CN101429499A)中全部公開(注EPSP合酶基因為CN101^9499A序列表中的SEQIDN02或SEQIDNO3所示的核苷酸序列)。[0013]所述的EPSP合酶基因的表達盒由啟動子、EPSP合酶基因和終止子組成；將EPSP合酶基因置于所述玉米葉綠體特異啟動子和終止子的調(diào)控之下，即得到本發(fā)明所述的EPSP合酶基因的表達盒。其中，所述的啟動子是玉米葉綠體特異啟動子，例如，可以是prrn、atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL等啟動子，優(yōu)選的，所述的啟動子為prrn啟動子，本發(fā)明進一步地將prrn啟動子序列進行了優(yōu)化，將一段含有SD序列的序列(GGGAGG)引入prrn啟動子的3’端，提高prrn啟動子與核糖體的結合能力，從而提高下游基因的翻譯水平，所得到的啟動子的核苷酸序列為SEQIDNo.1所示；所述的終止子優(yōu)選為psbA終止子，其核苷酸序列為SEQIDNO:2所示。[0014]所述的同源重組片段atpB的核苷酸序列為SEQIDNo.3所示；[0015]所述的同源重組片段rbcL的核苷酸序列為SEQIDNo.4所示。[0016]為了達到更好的效果，所述的EPSP合酶基因玉米葉綠體表達載體中還可含有顯性選擇標記基因的葉綠體基因表達盒；該顯性選擇標記基因優(yōu)選為細菌來源的抗菌素抗性基因，更優(yōu)選為抗潮霉素基因(HPT)，其核酸序列為SEQIDNo.5所示；作為本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案，可以將抗潮霉素基因插入到玉米葉綠體基因組的16srRNA啟動子和psbA終止子之間構建得到抗潮霉素的葉綠體基因表達盒。[0017]本發(fā)明另一方面是提供了一種構建所述EPSP合酶基因玉米葉綠體表達載體的方法，該方法包括以下步驟[0018](1)、將EPSP合酶編碼基因可操作的與玉米葉綠體特異啟動子和終止子相連接，使EPSP合酶編碼基因置于玉米葉綠體特異啟動子和終止子的調(diào)控之下，得到EPSP合酶編碼基因的表達盒；[0019](2)、將玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL分別連接在EPSP合酶編碼基因的表達盒的兩側，即得。[0020]本發(fā)明EPSP合酶基因玉米葉綠體表達載體構建的一個優(yōu)選實施方案，包括將EPSP合酶編碼基因克隆到pSK-prrn-T載體的EindIII和)(bal之間，使EPSP合酶基因片段置于玉米葉綠體基因特異啟動子ftrn和I^sbA終止子調(diào)控之下得到質粒pSK-prrn-A15N-T；將抗潮霉素基因表達盒插入質粒pSK-prrn-A15N_T的Mil和KpnI之間構建pSK-prrn-A15N-T-hpt。再將兩個表達盒克隆入含有同源重組片段atpB_rbcL的pBR質粒BamHI位點，構建得到EPSPSA15N玉米葉綠體表達載體pBR_PTN_hpt；將pBR-PTN_hpt用基因槍法轉化玉米愈傷組織，篩選得到轉化有EPSPSA15N基因的玉米抗性愈傷組織，誘導玉米抗性愈傷組織再生獲得轉基因玉米植株。更進一步的，本發(fā)明將所構建的EPSP合酶基因玉米葉綠體表達載體轉化玉米愈傷組織、細胞或原生質體，以提高玉米的草甘膦抗性。[0021]為達上述目的，可以將構建的EPSP合酶編碼基因玉米葉綠體表達載體轉化玉米，篩選得到玉米抗性愈傷組織、細胞或原生質體；誘導抗性愈傷或細胞分化，再生獲得抗性植株，即得。[0022]所述“轉化”是將EPSP合酶編碼基因導入到玉米愈傷組織或細胞，再采用本領域熟知的細胞或組織培養(yǎng)方法，誘導轉化的玉米愈傷組織或細胞再生得到完整植株。所述的“轉化”方法包括顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導的轉化、基因槍法以及高速彈道轟擊等，優(yōu)選為基因槍法。[0023]采用常規(guī)方法可使已轉化的玉米愈傷組織、細胞再生獲得穩(wěn)定的轉化植株(McCormicketal.PlantCellReports.1986.5:81-84)。[0024]所述的玉米品系優(yōu)選為綜31或綜3。[0025]本發(fā)明采用基因同源重組技術，將來源于斯氏假單胞菌的EPSP合酶編碼基因構建到由玉米葉綠體特異啟動子prrn和psbA終止子組合所驅動的表達盒，利用玉米葉綠體基因組中的atpB-rbcL作為同源片段，發(fā)生同源重組，通過基因槍轉化法導入玉米葉綠體中，通過PCR分子生物學手段檢測，最終獲得轉基因玉米，EPSP合酶編碼基因在玉米葉綠體中得到成功表達，試驗證實，所獲得的轉基因玉米植株具有較強的草甘膦抗性。[0026]本發(fā)明利用玉米葉綠體表達系統(tǒng)獲得抗草甘膦轉基因水稻，具有以下優(yōu)點第一，玉米葉綠體能夠高效的表達外源基因，植株可以獲得良好的抗性；第二，生物安全性高，由于葉綠體是母系遺傳，發(fā)生基因漂移的可能性極低；第三，外源基因能定點整合在玉米葉綠體基因組上；第四，外源基因在后代中可穩(wěn)定表達；第五，玉米葉綠體基因組具有分子量小、結構簡單、不結合組蛋白等特點有利于實現(xiàn)分子操作。[0027]本發(fā)明采用玉米葉綠體表達系統(tǒng)獲得抗草甘膦轉基因玉米，獲得的轉基因玉米具有優(yōu)異的草甘膦抗性。本發(fā)明獲得的轉基因玉米與原核轉化相比外源基因定點插入到玉米葉綠體基因組中，無性狀分離，易于檢測，省時高效；外源基因在葉綠體中高效的表達，獲得轉基因植株具有良好的抗性；生物安全性極高，外源基因發(fā)生漂移的可能性極低。[0028]總體而言，本發(fā)明可以顯著提高轉基因玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省時高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點。[0029]圖1轉基因玉米A15N的PCR檢測結果；M:DL2000；1,2,3,4為轉基因樣品；5野生型對照。[0030]圖2葉綠體轉基因玉米同質化程度的PCR檢測結果；M:DL2000；1,2,3轉基因樣品；4野生型對照。具體實施方式[0031]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。[0032]實驗材料[0033]1.E.coliT0P10購自Promega公司；玉米綜31、綜3春夏種植于中國農(nóng)科院廊坊實驗基地，冬季種植于中國農(nóng)科院海南島實驗基地。[0034]2.酶與試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶及其配套緩沖液購自Promega公司；檢測所用的所有二抗抗體均購自Sigma公司；[0035]3.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)；植物培養(yǎng)基為N6和MS培養(yǎng)基；[0036]實施例1、EPSP合酶基因的獲得、表達載體的構建和轉化、轉基因玉米的鑒定。[0037]1、玉米葉綠體基因組的提取[0038](1)將5-10g玉米葉片去除葉脈，將葉片剪碎，液氮研磨；[0039](2)加入5倍體積4°C預冰冷的bufferA(bufferA:50mMTris-HCl,20mMEDTA,0.5M蔗糖，0.25MVc，pH3.5)，勻漿用8層醫(yī)用紗布過濾濾液至預冷的50mL離心管中，棄殘渣；[0040](3)濾液1500g/min，15min離心，棄上清，留沉淀；[0041](4)向沉淀中加入3mLbufferA，充分懸浮，轉入IOmL離心管中；[0042](5)2000g/min,15min離心，棄上清，收集沉淀；[0043](6)加入2mLbufferB，充分懸浮(bufferB:50mMTris-HCl,20mMEDTA，0.5M蔗糖，1%BSA，7mMβ-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加)；[0044](7)1500g/min,離心lOmin，棄上清，收集沉淀，再用bufferB洗一次；(8)同上離心，棄上清，再加bufferC，洗一次，離心，沉淀大部分為葉綠體(bufferC:50mMTris-HClpH8.0,20mMEDTA，0.5M蔗糖)；(9)葉綠體沉淀懸浮于3mLbufferD(50mMTris-HCl，20mMEDTA)中，加入2mL裂解液(50mMTris-HCl,20mMEDTA,10%N-lauroylsarcosine)，37保溫15min后，加蛋白酶K至100μg/mL繼續(xù)37°C，保溫4h；淀過夜(10)用等體積酚，氯仿抽提。加入3MNaAC至0.3M，兩倍體積的無水乙醇，-20沉(11)離心，沉淀涼至半干，溶于50μLTER(加有RNase的TE)中；2EPSP合酶編碼基因的克隆和葉綠體表達載體的構建2.1目的基因的獲得根據(jù)已知的EPSP合酶編碼基因序列，分別設計引物，并且分別引入HindIII位點和)(bal位點，兩對引物如下A15FP1GAAGCTTATGCATTCCAATGACCTCGA15RP1GTCTAGATCATGAGGCGCCCTC在0.5mLeppendorf管中カロ入ddH2010XPCRbufferIOmMdNTP上游引物A15NFP下游引物A15NRPLATaqDNA聚合酶摸板HindIIIXbaI忍計40μL5μL1μL1μL1μL1μL1μL50μL反應程序95°C95°C56°C72°C30cycles72°C10min2.2抗潮霉素基因(HPT)的克隆根據(jù)已知的質粒pSELECT-hygro-mcsanvivoGen，貨號pseth_mcs)中HPT基因序列設計引物，并且分別引入HindIII位點和^CbaI位點，兩對引物如下HPTFPCAAGCTTATGCAAAAGCCTGAACTCACCGHindIIIHPTRPCTCTAGACTACTCTATTCCTTTGCCCTCXbaI[0063]PCR程序同上述2.1步驟中的PCR程序。2.3PCR產(chǎn)物的回收用普通凝膠進行電泳，切下所需DNA條帶，稱重后放入Eppendorf管中，加入3倍體積(v/w)的6mol/LNaI溶液，37°C下使凝膠充分溶解，再加入10μL玻璃奶吸附DNA，室溫下放置5min，稍離心k，去上清，沉淀用NewWash洗液洗滌一次，重復離心、洗滌三次，晾干后用30yL0.IXTEBuffer溶解DNA，離心后取上清，將DNA保存于_20°C備用。2.4T載體的連接反應回收的PCR產(chǎn)物2.5μL、pMD18_T0.5μL禾ロsoulI3μL混勻后，16°C反應2h。2.5質粒DNA或連接產(chǎn)物的轉化取-70°C凍存的感受態(tài)細胞，用雙手搓至大部分融化后迅速置冰上。感受態(tài)細胞完全融化后加入質粒DNA20IOOng或連接混合物5μL，輕輕混勻，冰浴30min。42°C熱激90sec，迅速置冰上12min。加入ImLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩(く150rpm)培養(yǎng)lh。4，OOOg離心5min，去部分上清后(留150200μL)涂布于含適當抗生素的LB平板上。37°C倒置培養(yǎng)過夜。2.6堿裂解法提取質粒DNA2.7重組子的鑒定酶切鑒定首先小量抽提質粒DNA，然后利用HindIII和xbal進行酶切反應，電泳后出現(xiàn)約1.3kb的DNA條帶的質粒為重組質粒T-A15N。將重組質粒T-A15N進行測序。測序結果與預期結果一致。3.玉米葉綠體表達載體的構建3.1玉米葉綠體同源載體pBR的構建3.1.1同源片段的獲得根據(jù)已知的玉米葉綠體基因組序列分別設計引物如下MAtpBFPCAAGCTTCTTGGAAGCTAATCCTCTGGHindIIIMAtpBRP:CGGATCCGAATCTAAATACCTAAATACTAAGBamHIMRbcLFPCGGATCCGATTAGGGTTTGGGTTGCGCBamHIMRbcLRP:GTCTAGAGTTACGAGCTTGTACACAGGXbaI在0.5mLeppendorf管中カロ入ddH2040μ10XPCRbuffer5μLIOmMdNTPIuL上游引物IuL下游引物IuLLATaqDNA聚合酶IuL玉米葉綠體總DNAIuL總計50μ反應程序權利要求1.一種含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，其特征在于，包括5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達盒，玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL；其中，5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達盒位于同源重組片段atpB和rbcL之間。2.按照權利要求1所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，其特征在于所述的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達盒由玉米葉綠體啟動子、5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因和終止子組成。3.按照權利要求2所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，其特征在于所述的玉米葉綠體啟動子包括/7r_r/7、ai/^、^對、/^似、/ZS秘WLrbcL啟動子；所述的終止子為psbA終止子。4.按照權利要求3所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，其特征在于所述的/Trrz7啟動子的核苷酸序列為SEQIDNo.1所示；所述/zs似終止子的核苷酸序列為SEQIDNO:2所示。5.按照權利要求1所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，其特征在于所述的同源重組片段atpB的核苷酸序列為SEQIDNo.3所示；所述的同源重組片段rbcL的核苷酸序列為SEQIDNo.4所示。6.按照權利要求1所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體，其特征在于還含有顯性選擇標記基因的表達盒；所述的顯性選擇標記基因優(yōu)選為細菌來源的抗菌素抗性基因；更優(yōu)選為抗潮霉素基因，其核苷酸序列為SEQIDNo.5所示。7.含有權利要求1-6任何一項所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體的玉米組織、玉米細胞或玉米原生質體。8.—種構建權利要求1-6任何一項所述含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體的方法，該方法包括以下步驟(1)、將5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因可操作的與玉米葉綠體特異啟動子和終止子相連接，使5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因置于玉米葉綠體特異啟動子和終止子的調(diào)控之下，得到5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達盒；(2)、將玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL分別連接在5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達盒的兩側，即得。9.權利要求1所述含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體在提高玉米草甘膦抗性中的應用。10.按照權利要求8所述的應用，其特征在于，包括將所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體轉化玉米愈傷組織、玉米細胞或玉米原生質體，篩選得到玉米抗性愈傷組織或細胞；C3)誘導玉米抗性愈傷組織或細胞分化，再生獲得玉米抗除草劑植株。專利摘要本發(fā)明提供了含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體及其應用。所述轉基因表達載體包括5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因的表達盒，玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶基因的表達盒位于同源重組片段atpB和rbcL之間。本發(fā)明還提供了該葉綠體轉基因表達載體的構建方法。本發(fā)明進一步提供了該葉綠體轉基因表達載體在提高玉米草甘膦抗性中的應用，包括將所述的表達載體轉化玉米愈傷組織或細胞，篩選得到抗性愈傷組織或細胞；誘導抗性愈傷組織或細胞分化，再生獲得玉米抗性植株。本發(fā)明可顯著提高玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省時高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點。文檔編號A01H5/00GKCN102533844SQ201110433149公開日2012年7月4日申請日期2011年12月21日發(fā)明者倪丕沖,張志芳,李軼女,沈桂芳,王國增,王金輝,程奇申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan