人造的蕓苔屬衍生的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的制作方法
【專利摘要】本公開涉及用于將肽、多肽和蛋白質(zhì)導(dǎo)向到含質(zhì)體細(xì)胞的質(zhì)體上的組合物和方法。在一些實施方案中，本公開涉及可以將多肽導(dǎo)向到質(zhì)體上的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（chloroplasttransitpeptide)，及編碼它的核酸分子。在一些實施方案中，本公開涉及用于產(chǎn)生含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的轉(zhuǎn)基因植物材料（例如轉(zhuǎn)基因植物）的方法，以及通過這種方法產(chǎn)生的植物材料，和從其產(chǎn)生的植物商業(yè)產(chǎn)品。
【專利說明】人造的蕓苔屬衍生的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本申請要求獲得2012年2月1日提交的美國臨時專利申請系列號No. 61/593,555 的利益，還要求獲得2012年4月17日提交的美國臨時專利申請系列號No. 61/625,222的 利益。
[0003] 根據(jù)37C. F. R. § 1. 821 (c)或（e)_作為ASCII文本文件提交的序列表的聲明
[0004] 根據(jù)37C. F. R. § 1. 821 (C)或（e)，含有ASCII文本格式的序列表的文件已經(jīng)和本 專利申請一起提交。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本公開涉及用于遺傳編碼和表達(dá)被導(dǎo)向到含質(zhì)體細(xì)胞的質(zhì)體上的多肽的組合物 和方法。在某些實施方案中，本公開涉及將多肽導(dǎo)向到（例如高等植物的）葉綠體上的氨 基酸序列，和/或編碼所述氨基酸序列的核酸分子。在某些實施方案中，本公開涉及嵌合多 肽，其含有控制該嵌合多肽到質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸序列，和/或編碼該嵌合多肽的核酸分 子。
[0006] 背景
[0007] 植物細(xì)胞含有多種不同的亞細(xì)胞細(xì)胞器，它們被統(tǒng)稱為"質(zhì)體"，由特征性的膜系 統(tǒng)限定邊界并在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行專化的功能。某些質(zhì)體負(fù)責(zé)光合作用，以及特定化合物的合成 和儲存。所有質(zhì)體均來源于存在于植物的分生組織區(qū)內(nèi)的原質(zhì)體（proplastids)。原質(zhì)體 可能發(fā)育成，例如：葉綠體，黃化體（etioplasts)，有色體，老質(zhì)體（gerontoplasts)，白色 體（Ieucoplasts)，淀粉體，油質(zhì)體（elaioplasts)和蛋白質(zhì)體（proteinoplasts)。質(zhì)體以 一種半自主的方式存在于細(xì)胞內(nèi)，它們含有其自身的遺傳體系和蛋白質(zhì)合成機(jī)構(gòu)，但其發(fā) 育和生物合成活性依賴與細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)系統(tǒng)的密切合作。
[0008] 在1?等植物的光合作用葉細(xì)胞中，最讓人關(guān)注的質(zhì)體是葉綠體。葉綠體最基本的 功能是實施光驅(qū)動的光合作用反應(yīng)。但是，葉綠體還實施許多其它對于植物細(xì)胞重要的生 物合成過程。例如，細(xì)胞的所有脂肪酸均是由位于葉綠體基質(zhì)內(nèi)的酶使用在葉綠體基質(zhì)內(nèi) 容易獲得的ATP、NADPH和碳水化合物制造的。而且，在葉綠體中，光活化電子的還原力驅(qū)動 亞硝酸鹽（NO 2O還原成氨（NH3);這種氨為植物提供了合成氨基酸和核苷酸所需的氮。
[0009] 葉綠體還參與農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)中的特別重要的過程。例如，已知許多除草劑通過 阻斷在葉綠體內(nèi)運(yùn)作的功能來發(fā)揮作用。新近的研究已經(jīng)鑒定了多種除草劑的特定靶標(biāo)。 例如，三嗪衍生的除草劑通過將質(zhì)體醌分子從其在光系統(tǒng)II的32kD多肽中的結(jié)合位點上 取代下來而抑制光合作用。這個32kD多肽由葉綠體基因組編碼，并由細(xì)胞器機(jī)構(gòu)合成。已 經(jīng)獲得了對三嗪類除草劑有抗性的突變體植物。這些植物含有突變的32kD多肽，其上面的 質(zhì)體醌不再能夠被三嗪類除草劑取代?；酋ｋ孱愐种迫~綠體中的乙酰乳酸合酶。乙酰乳 酸合酶參與異亮氨酸和纈氨酸的合成。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS)，其是一種參與芳香族氨基酸人造的酶。所有這些酶都是由細(xì)胞核基因組編碼的， 但它們被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體內(nèi)，實際的氨基酸合成在葉綠體內(nèi)進(jìn)行。
[0010] 大多數(shù)葉綠體蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)編碼，在胞漿中合成為更大的前體蛋 白，并在翻譯后被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中?？缭酵鈱雍蛢?nèi)層包膜而轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入基質(zhì)是以基質(zhì)、類囊體 膜和類囊體腔為目的地的蛋白質(zhì)的主要進(jìn)入機(jī)制。被轉(zhuǎn)入的前體蛋白向類囊體膜和類囊體 腔的定位通過四種不同的機(jī)制完成，其中兩種與細(xì)菌蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)同源。因此，將蛋白定 位在葉綠體內(nèi)的機(jī)制在一定程度上是來源于原核共生菌。Cline and Henry (1996) ,Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26。
[0011] 運(yùn)往葉綠體表達(dá)的前體蛋白含有稱作葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（CTP)的N端延伸 (extension)。轉(zhuǎn)運(yùn)肽在葉綠體表面的特異性識別中起作用，并參與介導(dǎo)在翻譯后將前體 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通過葉綠體包膜，并從葉綠體包膜轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體的各個亞室（sub-compartment) (如基質(zhì)、類囊體和類囊體膜）。這些N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列包含將葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體內(nèi)所需 的全部信息；轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列對于質(zhì)體引入是必要而充分的。
[0012] 據(jù)報道在其N端具有天然編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的植物基因包括：核酮糖1，5二磷 酸羧化酶（RuBisCo)的葉綠體小亞基（de Castro Silva-Filho et al. (1996)，Plant Mol. Biol. 30:769-80 ;Schnell et al. (1991)，J. Biol. Chem. 266:3335-42) ;EPSPS(見， 例如，Archer et al. (1990)，J.Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 和美國專利 6,867,293,7,045,684，和 Re.36,449);色氨酸合酶（21^〇6七&1.(1995)，了.81〇1· Chem. 270:6081-7);質(zhì)體藍(lán)素 （Lawrence et al. (1997)，J. Biol. Chem. 272:20357-63);分 支酸合酶（Schmidt et al. (1993)，J. Biol. Chem. 268:27447-57);捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋 白（LHBP) (Lamppa et al. (1988)，J. Biol. Chem. 263:14996-14999)，和擬南芥的葉綠體蛋 白（Lee et al. (2008)，Plant Cell20:1603-22)。美國專利公開 No. US 2010/0071090 提供 了 一些來自衣藻的葉綠體導(dǎo)向性肽。
[0013] 然而，由于葉綠體導(dǎo)向肽的序列有高度多樣性且缺少共同或共有序列基序，雖然 有可能存在具有獨立結(jié)構(gòu)基序的葉綠體導(dǎo)向肽的獨特亞群，但是葉綠體導(dǎo)向肽所編碼信息 的結(jié)構(gòu)要求仍然難以把握。Lee等人.（2008)，同上。此外，并非所有這些序列均可用于在 高等植物中異源表達(dá)葉綠體導(dǎo)向的蛋白質(zhì)。
[0014] 發(fā)明公開
[0015] 本文描述了用于植物中多肽的質(zhì)體導(dǎo)向的組合物和方法。在一些實施方案中，組 合物包含核酸分子，核酸分子包含至少一個編碼與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的人 造蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（例如TraP12肽和TraP13肽）。在特定的實施方案中，這些核 酸分子可用于單子葉或雙子葉植物中由感興趣的核苷酸序列編碼的多肽的表達(dá)和導(dǎo)向。進(jìn) 一步描述了包含核酸分子的載體，所述核酸分子含有至少一個編碼與感興趣的核苷酸序列 可操作地連接的人造蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列。
[0016] 在一些實施方案中，編碼人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列可以是這樣的核苷 酸序列，該序列衍生自從蕓苔屬物種基因（歐洲油菜（B.napus)、蕪青（B.rapa)、芥菜 (B.Juncea)和埃塞俄比亞芥（B.carinata))獲得的參考核苷酸序列，或其功能性變體。在 一些實施方案中，編碼人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列可以是嵌合核苷酸序列，其包含 來自蕓苔屬物種基因的部分CTP編碼核苷酸序列，或其功能性變體。在特定的實施方案中， 編碼人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列可含有多個連續(xù)的核苷酸序列，這些核苷酸序列分 別獲自：參考蕓苔屬物種CTP，和來自該蕓苔屬物種的不同基因、不同蕓苔屬物種、或不同 生物體（例如植物、原核生物和低等光合真核生物）的CTP，或任何前述者的功能性變體。 在特定的實施方案中，某個連續(xù)的核苷酸序列可以從參考蕓苔屬CTP的直系同源核苷酸序 列獲得，所述直系同源核苷酸序列從所述參考蕓苔屬植物基因在不同生物體中的直系同源 物（例如不同的蕓苔屬植物基因組）獲得。在這些和進(jìn)一步的實施方案中，編碼人工蕓苔 屬來源的CTP的核苷酸序列可以是嵌合核苷酸序列，其包含多于一種編碼CTP的核苷酸序 列。
[0017] 在一些實例中，編碼人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列可以是嵌合核苷酸序列， 其包含來自蕓苔屬植物的部分CTP核苷酸序列，或其功能性變體。在具體的實例中，編碼 人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列含有多個連續(xù)的從歐洲油菜（B.napus)獲得的核苷酸 序列，或其功能性變體。在更進(jìn)一步的實例中，編碼人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列可含 有：從蕓苔屬獲得的連續(xù)的核苷酸序列或其功能性變體，和從擬南芥屬物種基因獲得的連 續(xù)的核苷酸序列或其功能性變體。
[0018] 在一些實施方案中，組合物包括一種核酸分子，其包含至少一個蕓苔屬來源的用 于將多肽導(dǎo)向到葉綠體上的手段（means)。進(jìn)一步描述了多個核酸分子，其包含如下的核酸 分子，該核酸分子包含至少一個與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的、用于將多肽導(dǎo)向 到葉綠體的蕓苔屬來源的手段。在特定的實施方案中，這種核酸分子可用于在單子葉植物 或雙子葉植物中表達(dá)和導(dǎo)向由感興趣的核苷酸序列編碼的多肽。為本公開的目的，用于將 多肽導(dǎo)向到葉綠體上的蕓苔屬來源的手段是指特定的人造核苷酸序列。在特定的實施方案 中，用于將多肽導(dǎo)向到葉綠體上的蕓苔屬來源的手段選自下組：在本文中被稱作TraP12和 TraP13的核苷酸序列。
[0019] 本文還描述了植物材料（例如但不限于：植物、植物組織和植物細(xì)胞），其包含核 酸分子，該核酸分子包含至少一個與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的、編碼人造的蕓 苔屬來源的CTP的核苷酸序列。在一些實施方案中，植物材料可以具有這種穩(wěn)定整合到其 基因組中的核酸分子。在一些實施方案中，植物材料可以瞬時表達(dá)如下所述的核酸分子的 產(chǎn)物，該核酸分子含有至少一個與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的、編碼人造的蕓苔 屬來源的CTP的核苷酸序列。
[0020] 還描述了用于在含質(zhì)體細(xì)胞（例如植物）中的質(zhì)體（例如葉綠體）內(nèi)表達(dá)核苷酸 序列的方法。在特定的實施方案中，可以使用含有至少一個與感興趣的核苷酸序列可操作 地連接的、編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從而在 植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生包含與感興趣的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物融合的人造的蕓苔屬來 源的CTP的前體融合多肽，然后該融合多肽被體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到該植物細(xì)胞的葉綠體中。
[0021] 進(jìn)一步描述了用于產(chǎn)生包含核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中該核酸分子包含 至少一個與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的、編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸 序列。還描述了從這種轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的植物商業(yè)產(chǎn)品（例如種子）。
[0022] 通過下文參考附圖對多個實施方案的詳細(xì)說明，前述和其它的特征將不言自明。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1示出的mRNA分子，它們代表了與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的、編碼 人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列（例如TraP12和TraP13)。在一些實施方案中， mRNA分子（如所示的這些）可以從DNA分子轉(zhuǎn)錄而來，DNA分子其含有開放閱讀框，開放閱 讀框包含與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的、編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸 序列。在一些實施方案中，感興趣的核苷酸序列可以是編碼感興趣的肽的序列，例如但不限 于，要被導(dǎo)向到質(zhì)體上的標(biāo)記基因產(chǎn)物或肽。
[0025] 圖2包括了來自歐洲油菜（SEQ ID NO: 2)和擬南芥（SEQ ID NO:4)的EPSPS蛋白 的預(yù)測的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的比對結(jié)果。星號指示了序列被切割（spit)并重組形成TraP12和 Trapl3的位置。
[0026] 圖3示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB101981。
[0027] 圖4示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB 101989。
[0028] 圖5示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB 101908。
[0029] 圖6的顯微鏡圖片顯示了浸潤到煙草葉組織中的TraP12_YFP被轉(zhuǎn)位到煙草葉組 織的葉綠體內(nèi)。
[0030] 圖7的顯微鏡圖片顯示了浸潤到煙草葉組織中的TraP13-YFP被轉(zhuǎn)位到煙草葉組 織的葉綠體內(nèi)。
[0031] 圖8包含顯微鏡圖片，其顯示了浸潤到煙草葉組織中的無導(dǎo)向YFP對照沒有被納 入到煙草葉組織的葉綠體內(nèi)。
[0032] 圖9包含顯微鏡圖片，其顯示了轉(zhuǎn)化到玉米原生質(zhì)體中的TraP12_YFP被轉(zhuǎn)位到玉 米原生質(zhì)體的葉綠體內(nèi)。
[0033] 圖10示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB105528。
[0034] 圖11示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB105529。
[0035] 圖12示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB107686。
[0036] 圖13示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB107687。
[0037] 圖14示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB112711。
[0038] 圖15示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB11479。
[0039] 圖16示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB112712。
[0040] 圖17示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB112710。
[0041] 圖18示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB017540。
[0042] 圖19示出的是質(zhì)粒圖譜pDAB107617。
[0043] 實施本發(fā)明的模式
[0044] 1.多個實施方案概覽
[0045] 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（CTP)(或質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽）以共翻譯（co-translationally)或翻譯后 方式發(fā)揮功能，將包含CTP的多肽引導(dǎo)到質(zhì)體（例如葉綠體）上。在本發(fā)明的一些實施方 案中，內(nèi)源性葉綠體蛋白質(zhì)或是異源蛋白質(zhì)均可通過將該蛋白表達(dá)為含有CTP的較大前體 多肽而被導(dǎo)向到葉綠體中。在特定的實施方案中，CTP可以衍生自從蕓苔屬物種基因獲得 的核苷酸序列，通過例如，但不限于，納入至少一個來自從不同生物體獲得的直系同源基因 的連續(xù)序列，或其功能性變體衍生而來。
[0046] 在一個示例實施方案中，從獲自歐洲油菜的EPSPS基因序列（NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號 No. P17688)中分離多個核酸序列，每一個核酸序列均編碼CTP。CTP編碼核酸序列是通過 用ChloroP預(yù)測服務(wù)器分析EPSPS基因序列分離的。Emanuelsson et al. (1999)，Protein Science 8:978-84 (可以在 cbs. dtu. dk/services/ChloroP 訪問）。分離的 CTP 編碼序列 的預(yù)測蛋白產(chǎn)物是大約60-70個氨基酸長的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。從獲自擬南芥的直系同源EPSPS基因 (NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NP_182055)中分離了 CTP編碼核酸序列。在該實例中，使用天然歐洲 油菜CTP作為參考序列來設(shè)計示例性的人造的蕓苔屬來源的CTP，方法是在歐洲油菜CTP中 的特定位置處融合來自擬南芥CTP的連續(xù)序列。該設(shè)計過程例示了根據(jù)某些方面從蕓苔屬 物種和擬南芥屬物種的核酸序列開發(fā)新型人工CTP的過程。這些示例性的人造的蕓苔屬來 源的CTP在本公開全文中被稱作TraP12和Trapl3。測試這些示例的人造 TraP的質(zhì)體導(dǎo)向 功能，發(fā)現(xiàn)它們顯示的質(zhì)體導(dǎo)向至少不遜于對單獨的天然蕓苔屬序列觀察到的質(zhì)體導(dǎo)向。
[0047] 在進(jìn)一步的示例實施方案中，獨立地合成多個核酸序列，每一個均編碼本發(fā)明的 人造 TraP肽，并將它們與編碼黃色熒光蛋白（YFP)的核酸序列可操作地連接，從而產(chǎn)生多 個人造的核酸分子，每一個均編碼嵌合TraP:YFP融合多肽。將這些核酸分子，它們每一個 均編碼嵌合TraP: YFP多肽，分別倒入到雙元載體中，使得每一個TraP: YFP編碼核酸序列與 AtUbi 10啟動子可操作地連接。
[0048] 在更進(jìn)一步的示例實施方案中，將多個包含與AtUbi 10啟動子可操作地連接的 TraP:YFP編碼核酸序列的雙元載體通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化分別獨立地瞬時轉(zhuǎn)化到煙草 (本氏煙草（Nicotiana benthamiana))中。共聚焦顯微術(shù)和Western印跡分析證實，每一 個TraP均成功地將YFP導(dǎo)向到了煙草葉綠體上。
[0049] 在進(jìn)一步的示例實施方案中，獨立地合成了多個核酸序列，每一個均編碼本發(fā)明 的人造 TraP肽，并將它們與編碼農(nóng)藝學(xué)上重要的基因序列的核酸序列可操作地連接。將 TraP序列與除草劑耐受性性狀（例如dgt-28和dgt-14)融合，從而產(chǎn)生多個人造的核酸 分子，每一個均編碼嵌合的TraP:DGT-28或TraP:DGT-14融合多肽。將這些核酸分子，它們 中每一個均編碼嵌合的TraP: DGT-28或TraP: DGT-14多肽，分別引入雙元載體中，從而使每 一個TraP: dgt-28或TraP: dgt-14編碼核酸序列均與啟動子或其它基因調(diào)節(jié)元件可操作地 連接。用這些含有TraP:dgt-28或TraP:dgt-14編碼核酸序列的雙元載體轉(zhuǎn)化各種植物物 種。對轉(zhuǎn)基因植物測定由于DGT-28或DGT-14酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)位到葉綠體導(dǎo)致的除草劑耐受 性。
[0050] 在進(jìn)一步的示例實施方案中，獨立地合成多個核酸序列，每一個均編碼本發(fā)明的 人造 TraP肽，并與編碼農(nóng)藝學(xué)上重要的基因序列的核酸序列可操作地連接。將TraP序列 與昆蟲耐受性性狀（例如(^7243，￥1口3&131，(^7]^，(^7]^(3和(^71〇3)融合，從而產(chǎn)生多個 人造的核酸分子，其每一個均編碼嵌合的TraP:Cry2Aa, TraP: Vip3Abl, TraP:CrylF, TraP:C rylAc或TraP:CrylCa融合多肽。將這些核酸分子，其中每一個均編碼嵌合的TraP:cry2A a, TraP: vip3abl, TraP: crylF, TraP: crylAc 或 TraP: crylCa 多膚，分別引入雙兀載體中，使 得每一個 TraP: cry2Aa, TraP: vip3abl, TraP: crylF, TraP: cryIAc 或 TraP: crylCa 編碼核酸 序列均與啟動子或其它基因調(diào)節(jié)元件可操作地連接。用含有TraP:cry2Aa, TraP: vip3abl, T raP: cry IF, TraP: cry IAc或TraP: cry ICa編碼核酸序列的雙元載體轉(zhuǎn)化各種植物物種。對 轉(zhuǎn)基因植物測定由于Cry2Aa, Vip3Abl, CrylF, CrylAc或CrylCa酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)位到葉綠體 導(dǎo)致的除草劑耐受性。
[0051] 鑒于前述的詳細(xì)工作實施例，本發(fā)明的人造的蕓苔屬來源的CTP序列和編碼它們 的核酸，可用于在廣大范圍的含質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)將任何多肽引導(dǎo)到質(zhì)體上。例如，通過通過本公 開提供給本領(lǐng)域技術(shù)人員的方法，可以將包含人造的蕓苔屬來源的CTP序列、且該序列與 任意的第二個肽序列的N端融合的嵌合多肽引入到含質(zhì)體的宿主細(xì)胞內(nèi)（或在其中表達(dá)）， 以便將所述第二個肽序列導(dǎo)向到質(zhì)體上。因此，在特定的實施方案中，本發(fā)明的TraP肽，與 天然CTP相比，可以提供期望在質(zhì)體上表達(dá)的肽的更高的引入和加工效率。
[0052] II.縮寫
[0053] CTP 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽
[0054] Bt 蘇云金芽孢桿菌
[0055] EPSPS 3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合酶
[0056] YFP 黃色熒光蛋白
[0057] Ti 腫瘤誘導(dǎo)型（來源于根癌土壤桿菌的質(zhì)粒）
[0058] T-DNA 轉(zhuǎn)運(yùn) DNA
[0059] III.術(shù)語
[0060] 為了便于審閱本公開的各個實施方案，提供了特定術(shù)語的如下解釋：
[0061] 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽：如本文所使用的，術(shù)語"葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽"（CTP)(或"質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽"） 可以指如下的氨基酸序列，當(dāng)其存在于多肽的N端時，會指導(dǎo)該多肽進(jìn)入含質(zhì)體細(xì)胞（例如 植物細(xì)胞，例如在全植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中）的質(zhì)體內(nèi)。CTP對于指導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入 宿主細(xì)胞的質(zhì)體（例如，初級、二級或三級質(zhì)體，例如葉綠體）而言一般是必要而且充分的。 通過多種可用的算法中的任一種（例如PS0RT，和ChloroP (可以在cbs. dtu. dk/services/ ChloroP獲得））可以鑒定推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。ChloroP可以提供特別好的CTP預(yù)測。 Emanuelsson et al. (1999) ,Protein Science 8:978-84。然而，任何現(xiàn)有算法均不能以 100%的效率實現(xiàn)功能性CTP的預(yù)測。因此，確認(rèn)所鑒定出的假定CTP是否確實如預(yù)期的那 樣發(fā)揮功能（例如，在體外或體內(nèi)方法中）是重要的。
[0062] 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以位于被轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體內(nèi)的多肽的N端。CTP可以幫助含有CTP的多 肽的共翻譯或翻譯后的向質(zhì)體中的轉(zhuǎn)運(yùn)。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽通常含有大約40-大約100個氨基 酸，這些CTP已經(jīng)被觀察到含有某些共同的特征。例如：CTP所含的帶負(fù)電荷氨基酸（例如 天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺）非常少（即使有的話）；CTP的N端區(qū)缺少帶電氨 基酸、甘氨酸和脯氨酸；CTP的中心區(qū)還很可能含有非常高比例的堿性或羥基化氨基酸（例 如絲氨酸和蘇氨酸）；并且CTP的C端很可能富含精氨酸，并具有構(gòu)成兩親性β折疊片結(jié) 構(gòu)的能力。在包含CTP的多肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體內(nèi)之后，質(zhì)體蛋白酶可以將CTP與包含CTP的 多肽的其余部分切離。
[0063] 接觸：如本文關(guān)于核酸分子所使用的，術(shù)語與細(xì)胞、組織或生物體（例如植物細(xì) 胞；植物組織；和植物）"接觸"，或被細(xì)胞、組織或生物體"攝取"，包括核酸分子被內(nèi)化到生 物體中，例如但不限于：使生物體與包含該核酸分子的組合物接觸；和用含有該核酸分子 的溶液浸泡生物體。
[0064] 內(nèi)源的：如本文所使用的，術(shù)語"內(nèi)源的"是指源自于特定生物體、組織或細(xì)胞的物 質(zhì)（例如，核酸分子和多肽）。例如，植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的"內(nèi)源"多肽可以指通常在來自相同 物種的非遺傳工程化植物的相同類型的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多肽。在一些實例中，可以利用來自 蕓苔屬物種的內(nèi)源基因（例如EPSPS基因）來獲得參考蕓苔屬CTP基因。
[0065] 表達(dá)：如本文所使用的，編碼序列（例如基因或轉(zhuǎn)基因）的"表達(dá)"是指核酸轉(zhuǎn)錄 單元（包括例如基因組DNA或cDNA)的編碼信息轉(zhuǎn)變成細(xì)胞的運(yùn)作性（operational)、非運(yùn) 作性或結(jié)構(gòu)性部分的過程，往往包括蛋白質(zhì)的合成。基因表達(dá)可能受到外部信號（例如，細(xì) 胞、組織或生物體暴露于可以增加或降低基因表達(dá)的作用劑）的影響?；虻谋磉_(dá)還可以 在從DNA到RNA到蛋白的通路中的任何地方被調(diào)節(jié)。基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可以通過例如下述方 式發(fā)生：對轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和加工、中間分子如mRNA的降解等的控制，或者通過在特定 蛋白分子產(chǎn)生后使其活化、失活、區(qū)室化（compartmentalization)或降解，或者通過前述 的任何組合?；虮磉_(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的方法在RNA水平或蛋白水平進(jìn)行測量，這些 方法包括但不限于Northern印跡、RT-PCR、Western印跡，和體外、原位或體內(nèi)蛋白活性測 定。
[0066] 遺傳材料：如本文所使用的，術(shù)語"遺傳材料"包括全部基因，和核酸分子，例如 DNA 和 RNA。
[0067] 異源的：如本文所使用的，術(shù)語"異源的"是指并非源自于特定生物體、組織或細(xì)胞 的內(nèi)部的物質(zhì)（例如核酸分子和多肽）。例如，在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的"異源"多肽可以指通 常不在來自相同物種的非遺傳工程化植物的相同類型細(xì)胞中表達(dá)的多肽（例如，在相同生 物體的不同細(xì)胞中，或者在不同生物體的細(xì)胞中表達(dá)的多肽）。
[0068] 分離的：如本文所使用的，術(shù)語"分離的"是指如下的分子（例如，核酸分子或多 肽），該分子已與天然存在該分子的生物體細(xì)胞內(nèi)通常與該分子伴隨的其它同類分子（例 如其它核酸分子和其它多肽）實質(zhì)上分離或提純脫離。例如，分離的核酸分子可以與天然 存在該核酸分子的生物體細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA或染色體外DNA實質(zhì)性分離或提純脫離。因 此，該術(shù)語包括經(jīng)過生化純化從而除去其它的核酸分子、多肽和細(xì)胞組分的重組核酸分子 和多肽。該術(shù)語還包括重組核酸分子、化學(xué)合成的核酸分子、和重組產(chǎn)生的多肽。
[0069] 如本文所使用的，術(shù)語"基本上純化的"是指這樣的分子，其與通常在天然狀態(tài)下 與之伴隨的其它分子是分離的。基本上純化的分子可以是組合物中存在的主導(dǎo)種類?；?上純化的分子可以是，例如，除了天然混合物中存在的溶劑之外，其它分子有至少60%、至 少75 %、或至少90 %不存在。術(shù)語"基本上純化的"不是指以天然狀態(tài)存在的分子。
[0070] 核酸分子：如本文所使用的，術(shù)語"核酸分子"可以指聚合物形式的核苷酸，其可以 包括RNA、cDNA、基因組DNA、和合成形式的上述混合聚合物的有義和反義鏈。核苷酸可以指 核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸，或兩者任一類型核苷酸的修飾形式。如本文所使用的，"核酸 分子"與"核酸"和"多核苷酸"同義。除非另有說明，核酸分子的長度通常為至少10個堿 基。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。核酸分子包括二聚體（所謂的串聯(lián)）形式，和核酸 分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。核酸分子可包括天然存在的和/或經(jīng)過修飾的核苷酸，其中核苷酸通過 天然存在的和/或非天然存在的核苷酸連接鍵連接在一起。
[0071] 核酸分子可以被化學(xué)或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸 堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所容易理解的。這些修飾包括，例如，標(biāo)記物、甲基化、用類似物取 代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾（例如，不帶電的連接鍵：例如，甲基膦酸 酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電荷的連接鍵：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等；側(cè)基部分：例如，肽；嵌入劑：例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等；螯合劑；烷化劑；和經(jīng)過修 飾的連接鍵：例如，α異頭核酸等）。術(shù)語"核酸分子"也包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙 鏈、部分雙鏈體化（duplexed)、三鏈體化（triplexed)、發(fā)夾（hairpinned)、環(huán)形、和掛鎖構(gòu) 象。
[0072] 如本文關(guān)于DNA所使用的，術(shù)語"編碼序列"、"結(jié)構(gòu)核苷酸序列"或"結(jié)構(gòu)核酸分子" 是指這樣的核苷酸序列，當(dāng)其置于合適調(diào)節(jié)序列的控制之下時，可以通過轉(zhuǎn)錄和mRNA最終 被翻譯成多肽。關(guān)于RNA，術(shù)語"編碼序列"是指被翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。 編碼序列的邊界可以由5'端的翻譯起始密碼子和3'端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列 包括，但不限于：基因組DNA ;cDNA ;EST ;和重組核苷酸序列。
[0073] 在一些實施方案中，本發(fā)明包括可以用分離方法分離、純化或部分純化的核苷酸 序列，分離方法例如離子交換色譜、基于分子量或親和性的排除、基于在不同溶劑中的溶解 性的分級技術(shù)、和遺傳工程化方法如擴(kuò)增、克隆和亞克隆。
[0074] 序列同一性：術(shù)語"序列同一性"或"同一性"，如本文在兩個核酸或多肽序列的語 境中所使用的，可以指當(dāng)在特定比較窗口上對齊以實現(xiàn)最大對應(yīng)性時，兩個序列中相同的 殘基數(shù)。
[0075] 如本文所使用的，術(shù)語"百分比序列同一性"可以指通過比較兩個在比較窗口上最 佳對齊的序列（例如，核酸序列和氨基酸序列）確定的數(shù)值，其中為了實現(xiàn)兩個序列的最 佳對齊，比較窗口中的序列部分與參考序列（其不含添加或缺失）相比可以包括添加或缺 失（即缺口）。百分比的計算是通過確定在兩個序列中均出現(xiàn)的相同核苷酸或氨基酸的位 置的數(shù)目，從而產(chǎn)生匹配位置數(shù)，并用匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以 1〇〇,得到百分比序列同一性。
[0076] 用于對齊序列以供比較的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在例如下列文獻(xiàn)中描述了 各種程序和對齊算法：Smith and Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2:482 ;Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 ； Pear son and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:2444 ；Higgins and Sharp(1988)Gene73:237-44 ；Higgins and Sharp(1989) CABIOS 5:151-3 ；Corpet et al. (1988)Nucleic Acids Res. 16:10881-90 ；Huang et al. (1992)Comp. Appl.Biosci.8:155-65 ；Pearson et al. (1994)Methods Mol. Biol. 24:307-31 Jatiana et al.(1999)FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50。在例如 Altschul et al. (1990)J.Mol.Biol. 215:403-10中可以找到一種序列對齊方法和同一性 計算的詳細(xì)論述。
[0077] 美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information)(NCBI)基礎(chǔ)本地比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool) (BLASTTM;Altschul等（1990))可從幾個來源獲得，包括美國國家生物技術(shù)信息中心 (Bethesda，MD)和在因特網(wǎng)上，與幾個序列分析程序聯(lián)合使用。關(guān)于如何使用該程序來測定 序列同一性的描述可在因特網(wǎng)上BLAST?的"幫助"部分獲得。對于核酸序列的比較，可使 用缺省參數(shù)來采用BLAST?(Blastn)程序的"Blast 2 sequences"函數(shù)。在通過此方法評 估時，與參照序列具有越大的相似性的核酸序列將顯示越高的序列同一性。
[0078] 能夠特異性雜交/能夠特異性互補(bǔ)：如本文所使用的，術(shù)語"能夠特異性雜交"和 "能夠特異性互補(bǔ)"是表明互補(bǔ)性的程度充分，使得在核酸分子和靶核酸分子之間產(chǎn)生穩(wěn)定 而特異的結(jié)合的術(shù)語。兩個核酸分子之間的雜交涉及在兩個核酸分子的核酸序列之間形成 反平行對齊。兩個分子隨后能夠與相對鏈的相應(yīng)堿基形成氫鍵，從而形成一個二聚體分子， 如果它足夠穩(wěn)定，則可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行檢測。核酸分子不需要與靶分子 100%互補(bǔ)才能特異性雜交。然而，發(fā)生特異性雜交必須存在的序列互補(bǔ)性的量因雜交條件 而變化。
[0079] 產(chǎn)生特定程度的嚴(yán)格性的雜交條件會隨著所選雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸 序列的組成和長度的不同而改變。一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度（尤其 是Na +和/或Mg++濃度）將決定雜交的嚴(yán)格性，雖然清洗時間也會影響嚴(yán)格性。關(guān)于 為獲得特定程度嚴(yán)格性所需的雜交條件的計算是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的， 并且在例如Sambrook等人（編輯），分子克?。簩嶒炇沂謨裕∕olecular Cloning:A Laboratory Manual), 2nd Ed. , vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9and 11 ;和 Hames 和 Higgins(編輯）Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985中有討論。有關(guān)核酸雜交的更詳 細(xì)的說明和指導(dǎo)可以參見，例如，《Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes》，第一部分，第 2 章， Elsevier, NY, 1993 中的 Ti jssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，'一文，以及Ausubel 等編輯，Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章 ，Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995。
[0080] 如本文所使用的，"嚴(yán)格條件"包括在其中只有當(dāng)雜交分子與靶核酸分子內(nèi)的同源 序列之間的錯配小于20%時才發(fā)生雜交的條件。"嚴(yán)格條件"包括進(jìn)一步特定水平的嚴(yán)格 性。因此，如本文所使用的，"中等嚴(yán)格"條件是指在其中序列錯配超過20%的分子將不會雜 交的條件；"高嚴(yán)格"條件是指在其中序列錯配超過10%的分子將不會雜交的條件；和"高 嚴(yán)格"條件是指在其中序列錯配超過5%的分子將不會雜交的條件。"極高嚴(yán)格"條件是指 在其中序列錯配超過6%的分子將不會雜交的條件。
[0081] 下面是代表性的、非限制的雜交條件：
[0082] 高嚴(yán)格條件（檢測具有至少90 %序列同一性的序列）：在65°C的5x SSC緩沖液 中雜交16小時；在室溫下用2x SSC緩沖液清洗2次，每次15分鐘；和在65°C的0. 5x SSC 緩沖液中清洗2次，每次20分鐘。
[0083] 中等嚴(yán)格條件（檢測具有至少80%序列同一性的序列）：在65_70°C的5x_6x SSC緩沖液中雜交16-20小時；在室溫下用2x SSC緩沖液清洗2次，每次5-20分鐘；和在 55-70°C的lx SSC緩沖液中清洗2次，每次30分鐘。
[0084] 非嚴(yán)格對照條件（檢測具有至少50%序列同一性的序列）：在551：的6以5(：緩沖 液中雜交16-20小時；在室溫至55°C下用2x-3x SSC緩沖液清洗至少2次，每次20-30分 鐘。
[0085] 如本文關(guān)于連續(xù)核酸序列所使用的，術(shù)語"基本上同源的"或"基本上同源"是指 如下的連續(xù)核苷酸序列，其在嚴(yán)格條件下與參考核酸序列雜交。例如，與參考核酸序列基本 上同源的核酸序列是如下的核酸序列，其在嚴(yán)格條件下（例如，上文示明的中等嚴(yán)格條件） 與參考核酸序列雜交。基本上同源的序列可具有至少80%序列同一性。例如，基本上同源 的序列可具有大約80% -100%的序列同一性，例如大約81% ;大約82% ;大約83% ;大約 84% ;大約85% ;大約86% ;大約87% ;大約88% ;大約89% ;大約90% ;大約91% ;大約 92% ;大約93% ;大約94% ;大約95% ;大約96% ;大約97% ;大約98% ;大約98. 5% ;大 約99% ;大約99. 5% ;和大約100%。基本上同源的性質(zhì)與特異性雜交密切相關(guān)。例如，當(dāng) 具有充分程度的互補(bǔ)性，從而在期望特異性結(jié)合的條件下（例如嚴(yán)格雜交條件下）避免核 酸與非靶序列的非特異性結(jié)合時，核酸分子是能夠特異性雜交的。
[0086] 如本文所使用的，術(shù)語"直系同源物"或"直向同源物"是指兩個或多個物種中的 基因，其從一個共同的祖先核苷酸序列進(jìn)化而來，并可以在兩個或多個物種中保留相同的 功能。
[0087] 如本文所使用的，對于兩個核酸分子而言，當(dāng)沿著5'_3'方向閱讀的序列的每一個 核苷酸均與沿著3' -5'方向閱讀的另一個序列的每一個核苷酸互補(bǔ)時，則稱這兩個核酸分 子顯示"完全互補(bǔ)性"。與參考核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將顯示與參考核苷酸序列的反 向互補(bǔ)序列相同的序列。這些術(shù)語和描述在本領(lǐng)域中有確切的定義，且本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員容易理解。
[0088] 在確定氨基酸序列之間的百分比序列同一性時，本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，在不 影響包含該對齊序列的多肽的期望性質(zhì)的情況下，某個對齊所提供的給定位置上的氨基酸 的身份可以不同。在這些情況下，可以調(diào)整百分比序列同一性以解釋被保守取代的氨基酸 之間的相似性。這些調(diào)整是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知并且普遍使用的。見，例如Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7。
[0089] 本發(fā)明的實施方案包括示例性的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序列的功能性變體，和編碼它 們的核酸序列。示例性的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的功能性變體可以是，例如，示例轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序列的 片段（例如N端或C端片段），或全長示例性轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序列或示例性轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序 列的片段的修飾序列。在一些實施方案中，示例性的轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序列可以被修飾而引入 一個或多個保守的氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是指如下的氨基酸取代，其中氨基酸殘 基被另一個具有相似功能側(cè)鏈、相似大小、和/或相似疏水性的氨基酸殘基代替?？捎糜诖?替相同家族中的另一個氨基酸以便引入保守取代的氨基酸家族是本領(lǐng)域已知的。例如，這 些氨基酸家族包括：堿性氨基酸（例如，賴氨酸，精氨酸和組氨酸）；酸性氨基酸（例如，天 冬氨酸和谷氨酸）；不帶電的（在生理PH下）的極性氨基酸（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷 氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，和半胱氨酸）；非極性氨基酸（例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨 酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，和色氨酸）支鏈氨基酸（例如，蘇氨酸，纈 氨酸，和異亮氨酸）；和芳香族氨基酸（例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和組氨酸）。見，例 如，Sambrook et al. (Eds·),同上；和 Innis et al·，PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications， 1990,Academic Press，NY，USA。
[0090] 可操作地連接：當(dāng)?shù)谝缓塑账嵝蛄信c第二核苷酸序列存在功能關(guān)系時，則該第一 核苷酸序列與第二核苷酸序列"可操作地連接"。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或 表達(dá)，則啟動子與該編碼序列可操作地連接。如果可操作地連接的核苷酸序列是重組產(chǎn)生 的，則這些核苷酸序列通常是連續(xù)的，并且在需要連接兩個蛋白編碼區(qū)時，這些核苷酸序列 將共閱讀框。然而，可操作地連接的核苷酸序列不一定連續(xù)的。
[0091] 術(shù)語"可操作地連接的"，在用來指基因調(diào)節(jié)序列和編碼序列時，其意思是調(diào)節(jié)序 列影響所連接的編碼序列的表達(dá)。"調(diào)節(jié)序列"或"控制元件"是指影響轉(zhuǎn)錄的時機(jī)和水平 /量，RNA加工或穩(wěn)定性，或相關(guān)編碼序列的翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子； 翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；增強(qiáng)子；莖環(huán)結(jié)構(gòu)；阻遏物結(jié)合序列；終止序列；多聚腺苷酸化識 別序列；等。特定的調(diào)節(jié)序列可位于與之可操作地連接的編碼序列的上游和/或下游。此 夕卜，與編碼序列可操作地連接的特定調(diào)控序列可位于雙鏈核酸分子的相關(guān)互補(bǔ)鏈上。
[0092] 當(dāng)用于指示兩個或多個氨基酸序列時，術(shù)語"可操作地連接"是指第一個氨基酸序 列與至少一個額外的氨基酸序列存在功能關(guān)系。例如，在包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽和第二氨基酸序列的 多肽內(nèi)，如果該轉(zhuǎn)運(yùn)肽影響該多肽或該第二氨基酸序列的表達(dá)或運(yùn)輸，則該轉(zhuǎn)運(yùn)肽（例如 CTP)與該第二氨基酸序列可操作地連接。
[0093] 啟動子：如本文所使用的，術(shù)語"啟動子"是指一段DNA區(qū)域，其可以位于轉(zhuǎn)錄起點 的上游，并參與RNA聚合酶和其它蛋白的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄。啟動子可以與用于在細(xì) 胞內(nèi)表達(dá)的編碼序列可操作地連接，或者啟動子可以與編碼信號序列的核苷酸序列可操作 地連接，而該信號序列與用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的編碼序列可操作地連接。"植物啟動子"可以 是能夠在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。處于發(fā)育控制之下的啟動子的實例包括：優(yōu)先在 某些組織（例如但不限于，葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織）中起始轉(zhuǎn)錄的 啟動子。這些啟動子被稱為"組織優(yōu)選的"。僅在特定組織中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子被稱為"組 織特異的"。"細(xì)胞類型特異的"啟動子主要在一個或多個器官的特定細(xì)胞類型中的驅(qū)動轉(zhuǎn) 錄，例如根或葉中的導(dǎo)管細(xì)胞。"可誘導(dǎo)的"啟動子可以是可受環(huán)境控制的啟動子。可能通 過可誘導(dǎo)的啟動子觸發(fā)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實施例包括，例如但不限于，缺氧條件和光的存 在。組織特異的、組織優(yōu)選的、細(xì)胞類型特異的、和可誘導(dǎo)的啟動子構(gòu)成了"非組成型"啟動 子類型。"組成型"啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下可以有活性的啟動子。
[0094] 任何可誘導(dǎo)的啟動子均可用于本發(fā)明的一些實施方案。見Ward et al. (1993)，Plant Mol. Biol. 22:361-366。使用可誘導(dǎo)的啟動子，轉(zhuǎn)錄速度可響應(yīng)誘導(dǎo)劑而 增加?？烧T導(dǎo)的啟動子的實例包括，但不限于：來自ACEI系統(tǒng)的對銅響應(yīng)的啟動子；來自玉 米的對苯磺酰胺除草劑安全劑響應(yīng)的In2基因；來自TnlO的Tet阻遏物；和來自類固醇激 素基因的可誘導(dǎo)啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性可以被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)（Schena et al. (1991)Pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA88:0421)。
[0095] 組成型啟動子的實例包括，但不限于：來自植物病毒的啟動子，如來自CaMV的35S 啟動子；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pPEMU;MAS ;玉米H3組蛋白啟動 子；和ALS啟動子，歐洲油菜ALS3結(jié)構(gòu)基因5'端的Xbal/Ncol片段（或與所述Xbal/Ncol 片段相似的核苷酸序列）（國際PCT公開No. WO 96/30530)。
[0096] 另外，任何組織特異的或組織優(yōu)選的啟動子均可用于本發(fā)明的一些實施方案。用 包含與組織特異的啟動子可操作地連接的編碼序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物，可以在特定組 織中排他地或優(yōu)先地產(chǎn)生該編碼序列的產(chǎn)物。組織特異的或組織優(yōu)選的啟動子包括，但不 限于：根優(yōu)選的啟動子，例如來自菜豆蛋白基因的啟動子；葉特異的和光誘導(dǎo)的啟動子，例 如來自cab或rubisco的啟動子；花藥特異性啟動子，例如來自LAT52的啟動子；花粉特異 的啟動子，例如來自Zml3的啟動子；和小孢子優(yōu)選的啟動子，例如如來自apg的啟動子。 [0097] 轉(zhuǎn)化：如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"是指將一個或多個核酸分子轉(zhuǎn)移到 細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的核酸分子被細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制時（無論是通過該核酸分子整合 到細(xì)胞基因組中，還是通過附加體型復(fù)制），則稱細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的核酸分子"轉(zhuǎn)化"。 如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括所有可以將核酸分子引入到這種細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。實例 包括但不限于：用病毒載體轉(zhuǎn)染；用脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)化；電穿孔（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3);脂質(zhì)轉(zhuǎn)染（Feigner et al. (1987)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 84:7413-7); 顯微注射（Mueller et al. (1978)Cell 15:579-85) ;土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移（Fraley et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7) ;DNA 直接攝?。缓臀⒘＾Z擊（Klein et al. (1987)Nature 327:70)〇
[0098] 轉(zhuǎn)基因：一種外源核酸序列。在一些實例中，轉(zhuǎn)基因可以是編碼包含至少一個人造 的蕓苔屬來源的CTP的多肽的序列。在特定實例中，轉(zhuǎn)基因可以編碼這樣的多肽，其包含至 少一個人造的蕓苔屬來源的CTP和至少一個期望質(zhì)體表達(dá)的額外的肽序列（例如，賦予除 草劑抗性的肽序列）。在這些和其它的實例中，轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因的編碼序列可操作 地連接的調(diào)節(jié)序列（例如啟動子）。為本公開的目的，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因（的）"在用于指示生 物體（例如植物）時，是指包含外源核酸序列的生物體。在一些實例中，包含外源核酸序列 的生物體可以是其中通過分子轉(zhuǎn)化技術(shù)引入了該核酸分子的生物體。在其它實例中，包含 外源核酸序列的生物體可以是通過例如基因滲入或植物異花授粉而引入了該核酸序列的 生物體。
[0099] 轉(zhuǎn)運(yùn)：如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)運(yùn)"、"導(dǎo)向"和"轉(zhuǎn)移"是指本發(fā)明的某些氨基酸序 列幫助包含該氨基酸序列的多肽從宿主細(xì)胞的細(xì)胞核移動進(jìn)入宿主細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)的性質(zhì)。 在特定的實施方案中，這種氨基酸序列（例如人造的蕓苔屬來源的CTP序列）可能能夠?qū)?包含該氨基酸序列的多肽的大約100%、至少大約95%、至少大約90%、至少大約85%、至 少大約80%、至少大約70%、至少大約60%、和/或至少大約50%轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞的質(zhì)體 內(nèi)。
[0100] 載體：一種被引入到細(xì)胞內(nèi)，例如為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞而被引入到細(xì)胞內(nèi)的核酸分 子。載體可以包括允許它在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點。載體的實例包括， 但不限于：質(zhì)粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的病毒。載體還可以包括一個或 多個基因、反義分子、和/或選擇標(biāo)志物基因，以及其它本領(lǐng)域已知的遺傳元件。載體可以 轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，借此導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)由該載體編碼的核酸分子和/或蛋白質(zhì)。載體任 選地包括可幫助核酸分子實現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)入的材料（例如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)包殼等）。
[0101] 除非特別說明或暗示，如本文所用的，術(shù)語"一種"、"一個"和"該"意味著"至少一 個"。
[0102] 除非另有具體說明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所 屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義可 見，例如 Lewin B·，Genes V，Oxford University Press, 1994(ISBN0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. ,1994(ISBN 0-632-02182-9);和 Meyers R. A.(編輯），Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. , 1995(ISBN 1-56081-569-8)。除非另有具體說明，否則所有的百分比均為重量百分比，所有溶劑混合比 例均為體積比。所有溫度均為攝氏度。
[0103] IV.包含人造的蕓苔屬來源的CTP編碼序列的核酸分子
[0104] 在一些實施方案中，本公開提供了一種核酸分子，其包含與感興趣的核苷酸序列 可操作地連接的至少一個編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列。在特定的實施方案 中，感興趣的核苷酸序列可以是編碼感興趣的多肽的核苷酸序列。在特定的實例中，提供 了單個核酸分子，其編碼多肽，該多肽中TraP12或TraP13序列被融合到感興趣的多肽的N 端。
[0105] 人造的蕓苔屬來源的CTP可以來自于蕓苔屬EPSPS基因。在這些實施方案的特定 實例中，蕓苔屬EPSPS基因可以包括如SEQ ID NO: 1所示的核酸序列，來自另一不同EPSPS 基因的同源核酸序列，或包含如SEQ ID NO: 1所示的核酸序列的蕓苔屬EPSPS基因的直系 同源物。
[0106] 在一些實施方案中，人造的蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是嵌合的蕓苔屬來源 CTP。人造的嵌合蕓苔屬來源CTP可以從參考蕓苔屬CTP序列獲得，方法是通過將參考蕓苔 屬CTP序列內(nèi)包含的第一連續(xù)氨基酸序列與包含于另一不同CTP序列（例如從擬南芥屬物 種獲得的CTP序列）內(nèi)的第二連續(xù)氨基酸序列相連。在特定的實施方案中，包含所述第二 連續(xù)氨基酸序列的另一不同CTP序列可以由來自基因組的同源基因編碼，該基因組不是從 其獲得所述參考序列的蕓苔屬物種的基因組（例如另一不同的蕓苔屬物種，蕓苔屬物種之 外的植物；低等光合真核生物，例如綠藻；和原核生物，例如藍(lán)藻或土壤桿菌）。因此，編碼 人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列可以通過下屬方式從參考蕓苔屬物種CTP編碼基因 序列獲得：將編碼參考蕓苔屬CTP序列的連續(xù)氨基酸序列的核苷酸序列與編碼來自另一不 同CTP序列的、與參考蕓苔屬CTP序列的其余部分同源的連續(xù)氨基酸序列的核苷酸序列融 合。在這些和其它的實例中，參考蕓苔屬CTP序列的連續(xù)氨基酸序列可以位于人造的蕓苔 屬來源的CTP的5'端或3'端。
[0107] 在一些實施方案中，人造的嵌合蕓苔屬來源CTP可以衍生自多個蕓苔屬CTP序列 (包括參考蕓苔屬CTP序列），其方式是將一個蕓苔屬CTP序列內(nèi)包含的連續(xù)氨基酸序列與 另一不同蕓苔屬物種CTP序列內(nèi)包含的連續(xù)氨基酸序列連接在一起。在特定的實施方案 中，所述多個蕓苔屬CTP序列可以由不同蕓苔屬物種中的直系同源基因序列編碼。在一些 實施方案中，所述多個蕓苔屬CTP序列可以正好是兩個蕓苔屬CTP序列。因此，編碼人造的 嵌合蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列可以衍生自兩個同源的（例如基本上同源的）蕓苔屬 CTP編碼基因序列（例如直系同源基因序列），其方式是將編碼來自其中一個蕓苔屬CTP序 列的連續(xù)氨基酸序列的核苷酸序列與編碼來自另一個蕓苔屬CTP序列的、與前述第一個蕓 苔屬CTP序列的其余部分同源的連續(xù)氨基酸序列的核苷酸序列融合。TraP12和TraP13是 這種人造的嵌合蕓苔屬來源CTP的示例。
[0108] 在一些實施方案中，人造的嵌合蕓苔屬來源CTP可以通過這樣的方式衍生自參考 蕓苔屬CTP序列：將參考蕓苔屬CTP序列內(nèi)包含的連續(xù)氨基酸序列與從不同生物體獲得的 第二CTP序列內(nèi)含有的連續(xù)氨基酸序列連接在一起。在特定的實施方案中，所述第二CTP 序列可以由該不同生物體內(nèi)的直系同源基因序列編碼。編碼人造的嵌合蕓苔屬來源CTP的 核苷酸序列可以通過這樣的方式衍生自參考蕓苔屬CTP序列：將編碼參考蕓苔屬CTP序列 的連續(xù)氨基酸序列的核苷酸序列，與來自不同生物體的同源（例如基本上同源）CTP編碼基 因序列（例如直向同源基因序列）的、編碼該不同生物體的CTP序列中與所述參考蕓苔屬 CTP序列的其余部分同源的連續(xù)氨基酸序列的核苷酸序列融合。TraP12和TraP13是這種 人造的嵌合CTP的實例，其包含來自蕓苔屬和擬南芥的CTP序列。
[0109] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會理解，在選定參考蕓苔屬CTP序列內(nèi)的第一連續(xù)氨基酸 序列之后，根據(jù)前述衍生過程從同源CTP序列的其余部分鑒定和選擇連續(xù)氨基酸序列是明 確且自動的。在一些實例中，第一連續(xù)氨基酸序列的長度可以為大約25至大約40個氨基 酸（例如長度為 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 和 42 個氨 基酸）。在一些實施方案中，參考蕓苔屬CTP序列內(nèi)的第一連續(xù)氨基酸序列由一些蕓苔屬 EPSPS基因內(nèi)保守的"SVSL"（SEQ ID NO:9)基序的3'端位置界定。
[0110] 根據(jù)前述過程人造的嵌合蕓苔屬來源CTP序列的實例是SEQ ID N0s:6和8。鑒于 遺傳密碼子的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能馬上想到編碼這些肽的核苷酸序列的類群。 這些特定的實例從來自歐洲油菜ESPSP基因的幾種ESPSP直系同源物之一的同源CTP納入 了連續(xù)序列，從而例示了人造嵌合蕓苔屬來源CTP的結(jié)構(gòu)特征。
[0111] 一些實施方案包括所述人造蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的功能性變體，和/或編 碼它們的核酸。這些功能性變體包括，例如但不限于：人造的蕓苔屬來源的CTP編碼序 列，其衍生自如SEQ ID N0:1所示的蕓苔屬CTP編碼序列的同源物和/或直系同源物， 和/或由該核酸編碼的CTP ;編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核酸，所述人造的蕓苔屬來 源的CTP包含SEQ ID N0:2內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列，和/或由該核酸編碼的CTP ;編碼截短 的人造的蕓苔屬來源的CTP的序列，其包含SEQ ID N0:5, 7, 11，12, 13, 15, 17和19其中 之一內(nèi)的連續(xù)核酸序列；編碼截短的人造的蕓苔屬來源的CTP的序列，其包含與SEQ ID N0s:5, 7, 11，12, 13, 15, 17和19其中之一基本上同源的連續(xù)核酸序列；截短的人造的蕓苔 屬來源的CTP，其包含SEQ ID N0s:6和8之一內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列；核酸序列，其編碼包含 SEQ ID N0s:6和8之一內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列的截短的人造的蕓苔屬來源的CTP，和/或其 編碼的CTP ;編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核酸，該CTP包含SEQ ID N0:6和8之一內(nèi)的 連續(xù)氨基酸序列，所述連續(xù)氨基酸序列具有一個或多個保守氨基酸取代，和/或由該核酸 編碼的CTP ;以及編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核酸，該CTP包含SEQ ID N0s:6和8其 中之一內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列，并具有一個或多個非保守的氨基酸取代，并被證明可以指導(dǎo) 可操作地連接的肽進(jìn)入含質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)體內(nèi)，和/或由該核酸編碼的CTP。
[0112] 因此，本發(fā)明的一些實施方案包括含有如下核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序 列編碼人造的嵌合蕓苔屬來源CTP，其包含一個或多個保守的氨基酸取代。這種核酸分子可 用于，例如，在分子生物學(xué)技術(shù)中幫助本發(fā)明CTP編碼序列的操作。例如，在一些實施方案 中，可將本發(fā)明的CTP編碼序列引入到合適的用于將序列亞克隆到表達(dá)載體內(nèi)的載體中， 或者可以將本發(fā)明的CTP編碼序列可以引入到這樣的核酸分子中，該核酸分子可以幫助產(chǎn) 生其他包含與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的CTP編碼序列的核酸分子。在這些和進(jìn) 一步的實施方案中，人造的嵌合蕓苔屬來源CTP序列中的一個或多個氨基酸位置可以被刪 除。例如，人造的嵌合蕓苔屬來源CTP的序列可以被修飾，使得該序列中的1，2, 3, 4, 5, 6, 7 ，8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19或20個位置上的氨基酸被刪除。對同源CTP序列 的比對可以提供哪些氨基酸可以被刪除而不會影響人造 CTP的功能的指導(dǎo)。
[0113] 在特定的實施方案中，人造的蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的長度小于80個氨基酸。 例如，人造的蕓苔屬來源的CTP的長度可以是79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71，70, 69, 68, 67 ，66, 65, 64, 63, 62, 61，60或者更少的氨基酸。在某些實例中，人造的蕓苔屬來源的CTP的 長度可以為大約65,大約68,大約72或大約74個氨基酸。在這些和進(jìn)一步的實例中，人造 的蕓苔屬來源的CTP可以包含SEQ ID N0s:6和8中其中一個所示的氨基酸序列，或任何 前述的功能性變異體。因此，人造的蕓苔屬來源的CTP可以包含SEQ ID N0s:6和8中其中 一個的氨基酸序列，或其功能性變體，其中人造的蕓苔屬來源的CTP的長度小于80個氨基 酸。在某些實例中，人造的蕓苔屬來源的CTP可以包含與SEQ ID N0:6和8中的一個例如 至少80%，至少85%，至少90%，至少92%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至 少98%，至少99 %或100 %相同的氨基酸序列。
[0114] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒于本公開能識別編碼某一具體的人造蕓苔屬來源的CTP的 所有核苷酸序列，例如SEQ ID N0:6的TraP12肽，SEQ ID N0:8的TraP13肽，或任意前述 者的功能性變體，包括任何特定缺失和/或保守氨基酸取代。遺傳密碼的簡并性為特定氨 基酸序列提供了有限數(shù)目的編碼序列。選擇特定的序列編碼人造的蕓苔屬來源的CTP屬 于從業(yè)者的自由裁量。在不同的應(yīng)用中可能期望使用不同的編碼序列。例如，為了提高人 造的蕓苔屬來源的CTP在特定宿主內(nèi)的表達(dá)，可以選擇反映宿主密碼子使用偏好的編碼序 列。作為舉例，人造的蕓苔屬來源的CTP可以由如SEQ ID N0s:5, 7, 11，12, 13, 15, 17和19 其中之一中所示的核苷酸序列編碼。
[0115] 在本發(fā)明的一些實施方案中提供的核酸分子中，編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的 核苷酸序列的最后一個密碼子和感興趣的核苷酸序列的第一個密碼子可以由任意數(shù)量的 核苷酸三聯(lián)體所分隔，例如不編碼內(nèi)含子或"終止（STOP)"。在一些實例中，編碼在天然前 體多肽中通常與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽相伴隨的成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸的序列可以存在于編 碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列的最后一個密碼子與感興趣的核苷酸序列的第 一個密碼子之間。將編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列和感興趣的核苷酸序列第 一個密碼子隔開的序列可以例如由任何序列構(gòu)成，使得所編碼的氨基酸序列很可能不會顯 著改變嵌合多肽的翻譯及其向質(zhì)體的轉(zhuǎn)位。在這些和進(jìn)一步的實施方案中，編碼人造蕓苔 屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列的最后一個密碼子可以與直接與該序列毗鄰、或者僅以 短肽序列與之相隔的感興趣的核苷酸序列的第一個密碼子相位對準(zhǔn)（phase-register)地 融合，所述短肽序列例如是由人造核苷酸接頭（例如，可能已經(jīng)被用于實現(xiàn)該融合的核苷 酸接頭）編碼的短肽序列。
[0116] 在一些實施方案中，可能期望修飾感興趣的核苷酸序列的核苷酸和/或與之融 合在一個編碼序列中的、人造的蕓苔屬來源的CTP編碼序列的核苷酸，以便例如增強(qiáng)該編 碼序列在特定宿主中的表達(dá)。遺傳密碼是冗余的，具有64個可能的密碼子，但是大多數(shù)生 物優(yōu)先使用這些密碼子中的一個子集。在某個物種中最經(jīng)常使用的密碼子被稱為最優(yōu)密 碼子，而那些不經(jīng)常使用的被歸類為稀有或低使用率密碼子。Zhang et al. (1991)Gene 105:61-72?？筛鼡Q密碼子以反映特定宿主的優(yōu)先密碼子使用率，這個過程有時被稱作"密 碼子優(yōu)化"?？梢灾苽浜刑囟ㄔ嘶蛘婧怂拗鲀?yōu)選的密碼子的優(yōu)化密碼子序列，以便，例 如，增加翻譯速度或者產(chǎn)生具有期望性質(zhì)（例如，與從非優(yōu)化序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本相比具有 更長的半衰期）的重組RNA轉(zhuǎn)錄本。
[0117] 任何多肽均可以通過納入人造的蕓苔屬來源的CTP序列而被導(dǎo)向到含質(zhì)體細(xì)胞 的質(zhì)體上。例如，在一些實施方案中，可以將多肽與人造的蕓苔屬來源的CTP序列連接，從 而將多肽引導(dǎo)到的細(xì)胞的質(zhì)體上，在質(zhì)體中該多肽-CTP連接分子被表達(dá)。在特定的實施 方案中，通過納入人造的蕓苔屬來源的CTP序列而被導(dǎo)向到質(zhì)體上的多肽可以是在天然表 達(dá)該多肽的細(xì)胞內(nèi)通常在質(zhì)體中表達(dá)的多肽。例如但不限于，通過納入人造的蕓苔屬來源 的CTP序列被導(dǎo)向到質(zhì)體上的多肽可以是參與除草劑抗性，病毒抗性，細(xì)菌性病原體抗性， 昆蟲抗性，線蟲抗性，或抗真菌多肽的多肽。參見，例如，美國專利5, 569, 823 ;5, 304, 730 ; 5, 495, 071 ;6, 329, 504和6, 337, 431。通過納入人造的蕓苔屬來源的CTP序列被導(dǎo)向到質(zhì)體 上的多肽抑或可以是，例如但不限于，參與植物活力和產(chǎn)量的多肽（包括參與對極端溫度、 土壤條件、光照水平、水的水平、和化學(xué)環(huán)境的耐受性的多肽），或者可以用作鑒定含有感興 趣的性狀的植物的標(biāo)志物的多肽（例如，選擇標(biāo)志物基因產(chǎn)物、參與種子顏色的多肽，等）。
[0118] 在本發(fā)明的一些實施方案中，可以和人造的蕓苔屬來源的CTP序列連接的、參與 除草劑抗性的多肽的非限制性實例包括：乙酰乳酸合酶（ALS)、突變的ALS和ALS的前體 (例如，見美國專利5, 013, 659) ;EPSPS (見，例如，美國專利4, 971，908和6, 225, 114)，例如 CP4 EPSPS或III類EPSPS ;可修飾質(zhì)體中發(fā)生的生理過程的酶，這些生理過程包括但不限 于，光合作用和脂肪酸、氨基酸、油、類胡蘿卜素（carotenoids)、萜類和淀粉的合成。在特 定實施方案中，可以和人造的蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽連接的多肽的其它非限制性實例包 括：玉米黃素環(huán)氧酶，膽堿單加氧酶，亞鐵螯合酶，ω-3脂肪酸去飽和酶，谷氨酰胺合成酶， 淀粉修飾酶，參與必需氨基酸、維生素 Α、激素、Bt毒素蛋白的人造的多肽，等等。編碼上述 多肽的核苷酸序列在本領(lǐng)域中是已知的，可以將這些核苷酸序列和編碼人造的蕓苔屬來源 的CTP的核苷酸序列可操作地連接，其中該CTP將被表達(dá)進(jìn)入如下的多肽，其包含與該人造 的蕓苔屬來源的CTP連接的感興趣的多肽。此外，編碼任何上述多肽的額外核苷酸序列可 以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒定（例如，通過克隆與編碼該特定多肽的其它基因高度同源的基 因）。一旦鑒定了這樣的核苷酸序列，設(shè)計包括與所鑒定核苷酸序列可操作地連接的人造的 蕓苔屬來源的CTP編碼序列，或編碼等價多肽的序列，都會是直截了當(dāng)?shù)倪^程。
[0119] V.包含人造蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多肽的表達(dá)
[0120] 在一些實施方案中，可以將至少一種核酸分子引入細(xì)胞、組織或生物體中，這些核 酸分子包含編碼包含至少一種人造的蕓苔屬來源的CTP或其功能等價物的多肽的核苷酸 序列，以在所述細(xì)胞、組織或生物體中中表達(dá)該多肽。在特定的實施方案中，核酸分子可以 包含與所述編碼人造的蕓苔屬來源的CTP的核苷酸序列可操作地連接的感興趣的核苷酸 序列。例如，核酸分子可以包括編碼如下多肽的編碼序列，該多肽包含至少一個人造的蕓苔 屬來源的CTP和至少一個由感興趣的核苷酸序列編碼的其他肽序列。在一些實施方案中， 可以將本發(fā)明的核酸分子引入含質(zhì)體的細(xì)胞、組織或生物體（例如，植物細(xì)胞，植物組織和 植物）中，使得在該含質(zhì)體宿主細(xì)胞、組織或生物體中從所述核酸分子表達(dá)多肽，其中該表 達(dá)的多肽包含至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP和至少一個由感興趣的核苷酸序列編碼 的其他肽序列。在某些實例中，被表達(dá)的多肽的人造的蕓苔屬來源的CTP可以幫助將該多 肽的至少含有所述其他肽序列的一部分導(dǎo)向到宿主細(xì)胞、組織或生物體的質(zhì)體上。
[0121] 在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 引入到含質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)。在特定的實施方案中，可以使宿主細(xì)胞、組織或生物體和本發(fā)明的 核酸分子接觸，以便將該核酸分子引入到細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)。在特定的實施方案中，可 用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而將該核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并且將核酸分子穩(wěn)定整合 到細(xì)胞的基因組中。在一些實施方案中，可以使用包含至少一個與感興趣的核苷酸序列可 操作地連接的人造蕓苔屬來源CTP的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞，例如含質(zhì)體的細(xì)胞 (例如植物細(xì)胞）。為了引發(fā)或增強(qiáng)表達(dá)，核酸分子可以包含一個或多個調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié) 序列可以和編碼包含至少一個人造蕓苔屬來源CTP的多肽的核苷酸序列可操作地連接。
[0122] 核酸分子可以是，例如，載體系統(tǒng)，其包括例如線性質(zhì)粒和閉合環(huán)狀質(zhì)粒。在特定 的實施方案中，該載體可以是表達(dá)載體。本發(fā)明的核酸序列可以，例如，插入到載體中，使 該核酸序列與一個或多個調(diào)節(jié)序列可操作地連接。有許多載體可用于該目的，并且特定載 體的選擇可以取決于，例如，待插入到載體內(nèi)的核酸的大小，和要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì) 胞。載體通常含有多種組分，這些組分的身份取決于載體的功能（例如，DNA擴(kuò)增和DNA表 達(dá)），以及與載體相容的特定宿主細(xì)胞。
[0123] 一些實施方案可以包括植物轉(zhuǎn)化載體，其包括含有至少一個上述的調(diào)節(jié)序列的核 苷酸序列，其中該調(diào)節(jié)序列與一個或多個編碼含有至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多 肽的核苷酸序列可操作地連接。該一個或多個核苷酸序列可以在該調(diào)節(jié)序列的控制下在植 物細(xì)胞、組織或生物體中表達(dá)，從而產(chǎn)生包含人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽，該CTP將多 肽的至少一部分導(dǎo)向到植物細(xì)胞、組織或生物體的質(zhì)體上。
[0124] 在一些實施方案中，與編碼含有至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核 苷酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列可以是啟動子序列，其可以在宿主細(xì)胞中，例如要在 其中擴(kuò)增該核酸分子的細(xì)菌細(xì)胞，或者要在其中表達(dá)該核酸分子的植物細(xì)胞中發(fā)揮功 能。適用于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的啟動子，包括誘導(dǎo)型啟動子、病毒啟動子、人造啟動 子、或組成型啟動子，所有這些都是本領(lǐng)域中眾所周知的?？捎糜诒景l(fā)明實施方案的啟 動子的非限制性實例在下列文獻(xiàn)中提供：美國專利Nos. 6, 437, 217 (玉米RS81啟動子）； 5, 641，876 (水稻肌動蛋白啟動子）；6, 426, 446 (玉米RS324啟動子）；6, 429, 362 (玉 米PR-I啟動子）；6, 232, 526 (玉米A3啟動子）；6, 177, 611 (組成型玉米啟動子）； 5, 322, 938, 5, 352, 605, 5, 359, 142 和 5, 530, 196 (35S 啟動子）；6, 433, 252 (玉米 L3 的油質(zhì) 蛋白啟動子）；6, 429, 357 (水稻肌動蛋白2啟動子和稻肌動蛋白內(nèi)含子2) ;6, 294, 714 (光 誘導(dǎo)型啟動子）；6，140,078(鹽誘導(dǎo)型啟動子）；6,252，138(病原體誘導(dǎo)型啟動子）； 6, 175, 060 (磷缺乏誘導(dǎo)的啟動子）；6, 388, 170 (雙向啟動子）；6, 635, 806 ( γ -coixin啟動 子）；和美國專利申請序列No. 09/757, 089 (玉米葉綠體醛縮酶啟動子）。
[0125] 其它示例性啟動子包括，胭脂堿合酶（NOS)啟動子（Ebert et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9);章魚堿合酶（OCS)啟動子（其被攜帶于根瘤土壤 桿菌的腫瘤誘導(dǎo)型質(zhì)粒上）；花椰菜花葉病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒（CaMV) 19S啟 動子（Lawton et al. (1987)Plant Mol. Biol. 9:315-24) ;CaMV 35S啟動子（Odell et al. (1985)Nature 313:810-2);玄參花葉病毒 35S 啟動子（此11?^6七31.(1987)?1'〇?！?Natl.Acad. Sci. USA 84(19):6624_8)，鹿糖合酶啟動子（Yang and Russell(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:4144-8) ;R基因復(fù)合體啟動子（Chandler et al. (1989)Plant Cell 1:1175-83);葉綠素 a/b結(jié)合蛋白基因啟動子；CaMV35S(美國專利Nos. 5, 322, 938, 5, 352， 605, 5, 359, 142,和 5, 530, 196) ;FMV35S (美國專利 Nos. 6, 051，753,和 5, 378, 619) ;PC1SV 啟動子（美國專利No. 5, 850, 019) ;SCP1啟動子（美國專利No. 6, 677, 503)，以及AGRtu. nos 啟動子（GenBank 登錄號 V00087;D印icker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983)Nature304:184-7)。
[0126] 在特定的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含組織特異性啟動子。組織特異 性啟動子是一種核苷酸序列，其在該啟動子特異針對的組織中導(dǎo)致可操作地連接的核苷酸 序列發(fā)生與該生物體的其它組織相比更高水平的轉(zhuǎn)錄。組織特異性啟動子的實例包括但不 限于：絨氈層特異性啟動子；花藥特異性啟動子；花粉特異性啟動子（參見，例如，美國專利 No. 7, 141，424,和國際PCT公開No. WO 99/042587);胚珠特異性啟動子；（參見，例如，美國 專利申請Να 2001/047525A1);果實特異性啟動子（參見，例如，美國專利Nos. 4, 943, 674， 和5, 753, 475);和種子特異性啟動子（參見，例如，美國專利Nos. 5, 420, 034,和 5, 608, 152)。在一些實施方案中，發(fā)育階段特異性啟動子（例如，在發(fā)育晚期活躍的啟動 子）可以在本發(fā)明的組合物或方法中使用。
[0127] 其他可在一些實施方案中與核酸分子可操作地連接的調(diào)節(jié)序列包括位于啟動子 序列和充當(dāng)翻譯前導(dǎo)序列的編碼序列之間的5'UTR。翻譯前導(dǎo)序列存在于完全加工的mRNA 中，并且它可能影響初級轉(zhuǎn)錄物的加工，和/或RNA穩(wěn)定性。翻譯前導(dǎo)序列的實例包括玉米 和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)序列（美國專利No. 5, 362, 865)，植物病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列，植 物rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）前導(dǎo)序列，及其他。參見，例如，Turner and Foster(1995)Molecular Biotech. 3(3) :225_36。下列文獻(xiàn)中提供了 5'UTR 的非限 制性實例：GmHsp(美國專利 No. 5, 659, 122) ;PhDnaK(美國專利 No. 5, 362, 865) ;AtAntl ; TEV (Carrington and Freed (1990)J. Virol. 64:1590-7);和 AGRtunos(GenBank 登錄號 V00087;和 Bevan et al. (1983) ,Nature 304:184-7)。
[0128] 其他可在一些實施方案中與核酸分子可操作地連接的調(diào)節(jié)序列還包括3'非翻譯 序列、3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或多聚腺苷酸區(qū)。這些都是位于核苷酸序列下游的遺傳元件，并包括提 供多聚腺苷酸化信號，和/或其它能夠影響轉(zhuǎn)錄或mRNA加工的調(diào)控信號的多核苷酸。多聚 腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能，導(dǎo)致在mRNA前體的3'端添加多聚腺苷酸核苷酸。多聚 腺苷酸序列可以來自于各種植物基因，或T-DNA基因。3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的一個非限制性實例 是胭脂喊合酶 3' 區(qū)（nos 3'；Fraley et al. (1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803_7)。 在 Ingelbrecht et al. (1989)Plant Cell 1:671-80 中提供了一個使用不同 3' 非翻譯 區(qū)的實例。多聚腺苷酸信號的非限制性實例包括來自豌豆RBCS2基因的多聚腺苷酸信號 (Ps. RbcS2-E9 ;Coruzzi et al. (1984)EMBO J. 3:1671-9)和 AGRtu. nos (GenBank 登錄號 No. E01312)。
[0129] 本發(fā)明的重組核酸分子或載體可包含選擇標(biāo)志物，其賦予被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（例如植 物細(xì)胞）可選擇的表型。選擇標(biāo)志物也可以用于選擇包含本發(fā)明核酸分子的植物或植物細(xì) 胞。該標(biāo)記可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性（例如，卡那霉素、遺傳霉素（G418)、博來 霉素，和潮霉素）或除草劑抗性（例如草甘膦）。選擇標(biāo)志物的實例包括，但不限于：neo基 因，其賦予卡那霉素抗性并可用例如卡那霉素和G418進(jìn)行篩選；bar基因，其賦予雙丙氨磷 抗性；突變的EPSP合酶基因，其賦予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予溴苯腈抗性；突變 的乙酰乳酸合酶基因（ALS)，其賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性；和氨甲喋呤抗性DHFR基因。存 在多種可賦予對氣節(jié)青霉素；博來霉素；氣霉素；慶大霉素；潮霉素；卡那霉素；林可霉素； 甲氨蝶呤；草銨膦；嘌呤霉素；大觀霉素；利福平；鏈霉素；和四環(huán)素等抗性的選擇標(biāo)志物。 這些選擇標(biāo)志物的實例在，例如，美國專利5, 550, 318 ;5, 633, 435 ;5, 780, 708和6, 118, 047 中有舉例。
[0130] 本發(fā)明的核酸分子或載體可額外地/作為替代地包含篩選標(biāo)志物。篩選標(biāo)志物 可用于監(jiān)視表達(dá)。篩選標(biāo)志物的實例包括β-葡糖醛酸糖苷酶或UidA基因（GUS)，其編碼 已知有多種發(fā)色底物的酶（Jefferson et al.(1987)Plant Mol. Biol. R印.5:387-405); R-座位基因，其編碼的產(chǎn)物可調(diào)節(jié)植物組織中花青素色素（紅色）的產(chǎn)生（Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac·，' 見 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels,編 輯，Plenum, NY(第 263-82 頁）；β-內(nèi)酰胺酶基因 （Sutcliffe et al. (1978) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41);編碼其各種發(fā)色底物已知的酶的基因（例如，PADAC，一種發(fā) 色頭孢菌素）；熒光素酶基因（〇w et al. (1986) Science 234:856-9) ;xylE基因，其編碼一 種兒茶酚雙加氧酶，轉(zhuǎn)換發(fā)色的兒茶酚（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 淀粉酶基因 （Ikatu et al.(1990)Bio/Technol. 8:241-2);酪氨酸酶基因，其編碼的 酶能夠氧化酪氨酸為DOPA多巴醌，進(jìn)一步縮合成黑色素 （Katz et al. (1983)J.Gen. Microbiol. 129:2703-14);和 α-半乳糖苷酶。
[0131] 適用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法包括任何能夠?qū)NA引入到細(xì)胞內(nèi)的方法，例如但 不限于：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見，例如，美國專利5, 508, 184);干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取 (desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)(參見，例如 Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8);電穿孔（參見，例如，美國專利5, 384, 253);用碳化硅纖維攪 拌（參見，例如，美國專利5, 302, 523和5, 464, 765) ;土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（參見，例如，美 國專利 5, 563, 055, 5, 591，616, 5, 693, 512, 5, 824, 877, 5, 981，840,和 6, 384, 301);和 DNA 涂覆顆粒的加速（acceleration of DNA-coated particles)(參見，例如，美國專利5,015， 580, 5, 550, 318, 5, 538, 880, 6, 160, 208, 6, 399, 861，和 6, 403, 865)等。通過諸如這些技術(shù) 的應(yīng)用，幾乎任何物種的細(xì)胞均可以被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化DNA被整合到 宿主細(xì)胞的基因組中。在多細(xì)胞物種的情況下，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以再生為轉(zhuǎn)基因生物。任何 這些技術(shù)均可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，例如，在轉(zhuǎn)基因植物的基因組中包含一個或多個本發(fā) 明的核酸序列。
[0132] 最廣泛使用的用于將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物中的方法是基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化 系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是可遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物致病性土壤細(xì)菌。根癌 土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因 。Ti (腫瘤誘 導(dǎo)）質(zhì)粒含有一個大區(qū)段，稱為T-DNA，其可以轉(zhuǎn)移到被轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一個片 段，vir區(qū)，負(fù)責(zé)T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域的邊界由重復(fù)序列構(gòu)成。在某些經(jīng)修飾的雙元載 體中，腫瘤誘導(dǎo)的基因已被刪除，并且vir區(qū)的功能被利用來轉(zhuǎn)移被T-DNA邊界序列包圍的 外源DNA。T-區(qū)還可以包括，例如，選擇標(biāo)志物，其用于高效回收轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞，和多克 隆位點，其用于插入供轉(zhuǎn)移的序列，例如人造的蕓苔屬來源的CTP編碼核酸。
[0133] 因此，在一些實施方案中，植物轉(zhuǎn)化載體可衍生自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒（參 見，例如，美國專利 Nos. 4, 536, 475, 4, 693, 977, 4, 886, 937 和 5, 501，967,以及歐洲專利 EP 0 122 791)或發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒。其他的植物轉(zhuǎn)化載體包括，例如但不限于，在 下列文獻(xiàn)中描述的那些：Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303:209-13 ;Bevan et al. (1983)，同上；Klee et al. (1985)Bio/Technol. 3:637-42;和歐洲專利 EP 0 120 516， 以及從前述任一種衍生的那些。其它天然與植物互作的細(xì)菌，例如中華根瘤菌、根瘤菌屬、 和慢生根瘤菌屬，也可以被修飾從而介導(dǎo)將基因轉(zhuǎn)移到多種不同的植物中。這些植物相關(guān) 的共生菌可以通過獲取卸甲（disarmed)的Ti質(zhì)粒和合適的雙元載體而擁有基因轉(zhuǎn)移能 力。
[0134] 在向受體細(xì)胞提供外源DNA之后，一般對被轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以用于進(jìn)一步的 培養(yǎng)和植株再生。為了提高鑒定被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力，可能期望采用與用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的 載體相伴的選擇或篩選標(biāo)志物基因，如先前所述。在使用選擇標(biāo)志物的情況下，通過使細(xì)胞 暴露于選擇試劑，在潛在的被轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體中鑒定被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在使用篩選標(biāo)志物的情 況下，可以通過期望的標(biāo)記基因性狀對細(xì)胞進(jìn)行篩選。
[0135] 對于暴露于選擇試劑時存活的細(xì)胞，或在篩選測定中具有陽性得分的細(xì)胞，可以 在支持植株再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實施方案中，對任何合適的植物組織培養(yǎng)基（例 如，MS和N6培養(yǎng)基）均可加以修飾使其包含更多的物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)劑。組織可以保持在 含有生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基中，直到獲得足夠的組織用于開始植物再生，或者進(jìn)行多輪 重復(fù)的人工選擇，直到組織的形態(tài)適合于再生（例如，至少2周），然后轉(zhuǎn)移到有利于芽形成 的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)被周期性轉(zhuǎn)移，直到形成足夠的芽。一旦芽形成，即將它們轉(zhuǎn)移到有利于 根形成的培養(yǎng)基中。一旦有足夠的根部形成，可以將植物轉(zhuǎn)移到土壤中進(jìn)一步生長和成熟。
[0136] 為了確認(rèn)再生植物中感興趣的核酸分子（例如編碼含有至少一個人造的蕓苔屬 來源的CTP的多肽的核苷酸序列）的存在，可以實施的測定有很多種。這些測定包括，例如： 分子生物學(xué)測定，如Southern和Northern雜交、PCR和核酸測序；生物化學(xué)測定，例如通過 如免疫學(xué)方法（ELISA和/或Western印跡）或通過酶促作用檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在；植物 部分測定，如葉或根測定；和全再生植物的表型分析。
[0137] 作為舉例，整合事件可以通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行分析，其使用，例如，特異針對感興趣 的核苷酸序列的寡核苷酸引物。PCR基因分型理解為包括，但不限于，來自預(yù)測含有被整合 到基因組中的感興趣的核酸分子的分離宿主植物組織的基因組DNA的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 擴(kuò)增，隨后是標(biāo)準(zhǔn)克隆和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析。PCR基因分型的方法已經(jīng)有詳細(xì)的描述 (參見，例如，Rios, G.et al. (2002)Plant J. 32:243-53)，并可應(yīng)用于衍生自任何植物物種 (例如玉米或大豆）或組織類型（包括細(xì)胞培養(yǎng)物）的基因組DNA。
[0138] 使用土壤桿菌依賴的轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通常含有被插入到一個染色體 上的單一重組DNA序列。該單一重組DNA序列被稱作"轉(zhuǎn)基因事件"或"整合事件"。這樣 的轉(zhuǎn)基因植物對于所插入的DNA序列而言是雜合的。在一些實施方案中，可以獲得對轉(zhuǎn)基 因而言為純合的轉(zhuǎn)基因植物，這是通過使含有單個外源基因序列的獨立分離的轉(zhuǎn)基因植物 與自身（例如F tl植物）有性交配（自交）產(chǎn)生F1種子。所產(chǎn)生的F1種子中四分之一對轉(zhuǎn) 基因而言是純合的。萌發(fā)F 1種子產(chǎn)生能夠用于雜合性測試的植物，其中雜合性測定通常使 用允許區(qū)分雜合子和純合子的SNP測定或熱擴(kuò)增測定法（即，合子型測定）。
[0139] 在特定的實施方案中，在其中已經(jīng)引入了至少一個包含編碼至少一個含有至少一 個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核酸分子的含有質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生了至少一個人造 的蕓苔屬來源的CTP的多肽的多個拷貝。每個含有至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多 肽可以由被引入到不同轉(zhuǎn)化事件中的多個核酸序列表達(dá)，或者由被引入到單個轉(zhuǎn)化事件中 的單個核酸序列表達(dá)。在一些實施方案中，多個這樣的多肽可以在單個啟動子的控制下表 達(dá)。在其它實施方案中，多個這樣的多肽可以在多個啟動子的控制下表達(dá)?？梢员磉_(dá)含有 多個肽序列的單一多肽，其中每一個肽序列均將被導(dǎo)向到質(zhì)體。
[0140] 除了用重組核酸分子直接轉(zhuǎn)化植物之外，還可以通過將具有至少一個轉(zhuǎn)基因事件 的第一植物與缺少這種事件的第二植物雜交，來制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以將含有編碼包 含至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列的重組核酸分子引入到適于轉(zhuǎn) 化的第一植物品系內(nèi)，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，可以將轉(zhuǎn)基因植物和第二植物品系雜交，從而 將編碼該多肽的核苷酸序列引入到該第二植物品系內(nèi)。
[0141] VI.包含被人造蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽引導(dǎo)的多肽的植物材料
[0142] 在一些實施方案中，提供了一種植物，其中該植物包含這樣的植物細(xì)胞：該植物細(xì) 胞中含有編碼包含至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列。在特定的實施 方案中，這樣的植物可以通過轉(zhuǎn)化植物組織或植物細(xì)胞，并再生整株植物來產(chǎn)生。在進(jìn)一步 的實施方案中，這樣的植物可以從商業(yè)來源獲得，或者通過將含有編碼含有至少一個人造 的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列的核酸滲入到種質(zhì)中而獲得。還提供了這樣的 植物材料，其包含植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞中含有編碼含有至少一種人造的蕓苔屬來源的CTP 的多肽的核苷酸序列。這樣的植物材料可以從包含該植物細(xì)胞的植物中獲得。在進(jìn)一步的 實施方案中，植物材料是不能再生而產(chǎn)生植物的植物細(xì)胞。
[0143] 包含編碼包含至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因 植物或植物材料在一些實施方案中可表現(xiàn)出一個或多個以下的特征：在植物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 該多肽；在植物細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)表達(dá)該多肽的一部分；將多肽從植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入到細(xì) 胞的質(zhì)體內(nèi)；在植物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體特異性地表達(dá)該多肽；和/或?qū)⒍嚯亩ㄎ辉谥参锏募?xì)胞內(nèi)。 除了表達(dá)編碼的多肽之外，這樣的植物可以額外具有一個或多個期望的性狀。這些性狀可 以包括例如：抗昆蟲等害蟲以及致病劑；耐除草劑；增強(qiáng)穩(wěn)定性、產(chǎn)量或保質(zhì)期；環(huán)境抗性； 藥物生產(chǎn)；工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)；和營養(yǎng)強(qiáng)化。
[0144] 根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是任何能夠被本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化的植物。因 此，該植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。本發(fā)明方法中可以使用的雙子葉植物的非 限制性實例包括：擬南芥屬，苜蓿，豆類，西蘭花，卷心菜，胡蘿卜，花椰菜，芹菜，大白菜， 棉花，黃瓜，茄子，萵苣，甜瓜，豌豆，胡椒，花生，馬鈴薯，南瓜，蘿卜，油菜，菠菜，大豆，倭瓜 (squash)，甜菜，向日葵，煙草，番茄，和西瓜。本發(fā)明方法中可以使用的單子葉植物的非 限制性實例包括：玉米，蕓苔屬植物（Brassica)，洋蔥，水稻，高粱，小麥，黑麥，黍，甘蔗，燕 麥，黑小麥，柳枝稷，以及草坪草。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以按照任何方式使用或栽培。
[0145] 一些實施方案還提供了含有一個或多個編碼包含至少一個人造的蕓苔屬來源的 CTP的多肽的核苷酸序列的商業(yè)產(chǎn)品，例如從含有一個或多個這樣的核苷酸序列的重組植 物或種子中產(chǎn)生的商業(yè)產(chǎn)品。含有一個或多個編碼包含至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP 的多肽的核苷酸序列的商業(yè)產(chǎn)品包括，例如但不限于：含有一個或多個編碼包含至少一個 人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列的植物的食品、柏、油、壓碎的或完整的顆粒 或種子。在一個或多個商品或商業(yè)產(chǎn)品中檢測到一個或多個編碼包含至少一個人造的蕓苔 屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列，是事實上的證據(jù)，表明該商品或商業(yè)產(chǎn)品至少部分地 是由包含一個或多個編碼包含至少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列的 植物產(chǎn)生的。在特定的實施方案中，本發(fā)明的商品產(chǎn)品包括可檢測量的、編碼包含至少一個 人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核酸序列。在一些實施方案中，這種商品產(chǎn)品可以通過， 例如，獲得轉(zhuǎn)基因植物并從它們制備食物或飼料來生產(chǎn)。
[0146] 在一些實施方案中，含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物或種子（該轉(zhuǎn)基因包含編碼包含至 少一個人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的核苷酸序列）在其基因組中還可以包含至少一個 其它的轉(zhuǎn)基因事件，包括但不限于：可轉(zhuǎn)錄RNAi分子的轉(zhuǎn)基因事件；編碼殺蟲蛋白的基因 (例如，蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白）；除草劑耐受性基因（例如，提供對草甘膦耐受性的基 因）；和有助于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生期望表型的基因（例如，增加產(chǎn)量，改變脂肪酸代謝，或 恢復(fù)細(xì)胞質(zhì)雄性不育性）。
[0147] VII.人造蕓苔屬來源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽介導(dǎo)基因產(chǎn)物定位在質(zhì)體上
[0148] 本發(fā)明的一些實施方案提供了一種用于將基因產(chǎn)物表達(dá)和/或定位于質(zhì)體（例如 葉綠體）上的方法。在特定的實施方案中，基因產(chǎn)物可以是標(biāo)志物基因產(chǎn)物，例如，熒光分 子?；虍a(chǎn)物作為還包含人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的一部分的表達(dá)，可以提供一種 用來評估特定的人造蕓苔屬來源的CTP序列的質(zhì)體定位能力的系統(tǒng)。在一些實施方案中， 標(biāo)記基因產(chǎn)物的表達(dá)，其中該標(biāo)記基因產(chǎn)物作為包含人造的蕓苔屬來源的CTP的多肽的一 部分，可用于將標(biāo)記基因產(chǎn)物的表達(dá)導(dǎo)向到表達(dá)該多肽的細(xì)胞的質(zhì)體上。在某些實施方案 中，這樣的標(biāo)記基因產(chǎn)物被定位在宿主細(xì)胞的質(zhì)體上。例如，標(biāo)志物基因產(chǎn)物在質(zhì)體中的表 達(dá)水平可能比在宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或其他細(xì)胞器中更高；標(biāo)志物基因產(chǎn)物可能在質(zhì)體中的表 達(dá)水平商得多；標(biāo)記基因廣物可能基本上只在質(zhì)體中表達(dá)；或者標(biāo)記基因廣物可能完全在 質(zhì)體中表達(dá)，從而不能檢測到其在細(xì)胞質(zhì)或非質(zhì)體細(xì)胞器中的表達(dá)。
[0149] 在一些實施方案中，包括人造的蕓苔屬來源的CTP的功能性變體的多肽，其中該 多肽與標(biāo)志物基因產(chǎn)物可操作地連接，用于評估功能性變體肽的特性。例如，可以改變?nèi)嗽?的蕓苔屬來源的CTP，例如在人造的蕓苔屬來源的CTP中引入至少一個保守突變，并且可將 所得的變體肽和標(biāo)志物基因產(chǎn)物可操作地連接。在合適的宿主細(xì)胞（例如，其中表達(dá)構(gòu)建 體中的一個或多個調(diào)節(jié)元件可運(yùn)作的細(xì)胞）中表達(dá)后，可以確定標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)。 通過在參考人造的蕓苔屬來源的CTP-標(biāo)記物構(gòu)建體和變異體肽-標(biāo)記物構(gòu)建體之間比較 標(biāo)志物基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，可以確定變異體肽是否提供，例如，更大的（greater)質(zhì)體 定位，或基本上相同的質(zhì)體定位。這樣的變體可認(rèn)為是功能性變體。通過鑒定人造的蕓苔屬 來源的CTP的能提供更大質(zhì)體定位的功能性變體，可以將這樣的變體中的突變納入到進(jìn)一 步的人造蕓苔屬來源的CTP的變體中。執(zhí)行多輪該評估過程，并隨后將被鑒定的有利突變 納入到人造的蕓苔屬來源的CTP序列內(nèi)，可以產(chǎn)生一個迭代的過程，用于優(yōu)化人造的蕓苔 屬來源的CTP序列。這種優(yōu)化的人造的蕓苔屬來源的CTP序列，和編碼它們的核苷酸序列， 被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分，無論此類優(yōu)化的人造蕓苔屬來源CTP序列是否能夠通過添加額 外的突變而進(jìn)一步被優(yōu)化。
[0150] 本文討論的參考文獻(xiàn)僅僅是由于它們公開于本專利申請?zhí)峤蝗罩啊１疚闹械娜?何內(nèi)容不應(yīng)被理解為本發(fā)明人承認(rèn)沒有資格由于先前的發(fā)明而早于這些公開。
[0151] 下面提供的實例用于例證某些特定的特征和/或?qū)嵤┓桨浮＿@些實例不應(yīng)視為將 本公開限制在所例證的這些特定特征或?qū)嵤┓桨钢小?實施例
[0152] 實施例1 :嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（TraP)序列的設(shè)計和產(chǎn)生
[0153] 質(zhì)體是在高等植物物種中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器，并存在于所有植物組織中。葉綠體是在 綠色光合組織中發(fā)現(xiàn)的一種特化型質(zhì)體，負(fù)責(zé)至關(guān)重要的生理功能。例如，其中一種這樣的 主要生理功能是合成植物所需的芳香族氨基酸。細(xì)胞核編碼的酶是此生物合成途徑必需 的，這些酶從細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體的內(nèi)部。這些細(xì)胞核編碼的酶通常具有N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽， 其與葉綠體膜相互作用，從而促進(jìn)肽轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體的基質(zhì)。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides:structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447。 在輸入時，基質(zhì)肽酶切掉該轉(zhuǎn)運(yùn)肽，而使成熟的功能蛋白被輸入到葉綠體內(nèi)。Richter S，Lamppa GK. (1999)Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147:33 -43。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽是可變的序列，其在長度、組成和組織上有高度多樣性。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides:structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列相似性在來自不同植物物種的同源蛋白之間有顯 著差異。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽之間的差異大小出乎人們的預(yù)料，因為比較加工成熟的功能蛋白時， 從不同植物物種獲得的同源蛋白通常具有相對高水平的序列相似度。
[0154] 設(shè)計、產(chǎn)生并在植物內(nèi)測試了新的嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。新的嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽顯示具有高效的轉(zhuǎn)位和加工性能，用于將農(nóng)藝學(xué)上重要的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中。首先，通 過ChloroP?計算機(jī)程序分析來自不同植物物種的天然5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸 合酶（EPSPS)蛋白序列，以鑒定推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（Emanuelsson 0, Nielsen H, von Heijne G, (1999)ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science 8 ;978_984),該程序可 以在http://www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/獲得。在鑒定出天然葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列 之后，將第一葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列與來自第二生物體的第二葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列進(jìn)行對齊。圖2 示出了歐洲油菜（NCBI登錄No:P17688)和擬南芥（NCBI登錄No. NP_182055)的EPSPS葉綠 體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的對齊結(jié)果。利用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列對齊，通過將來自第一生物體的葉綠 體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的一半與來自第二生物體的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的另一半以大約1:1的近似比合 并，設(shè)計了新的嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。新設(shè)計嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的示例性序列是TraP12 (SEQ ID N0:6)和TraP13(SEQ ID N0:8)。這些新的嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列來源于歐洲油菜 (NCBI 登錄 No:P17688)和擬南芥（NCBI 登錄 Ν〇·ΝΡ_182055)的 EPSPS 蛋白。TraP12(SEQ ID NO :6)嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列包括來源于歐洲油菜的N末端，而該葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的C端 來源于擬南芥。TraP13(SEQ ID N0:8)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列包括來源于擬南芥的N末端，而 該葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的C端來源于歐洲油菜。對該嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽通過多種包括瞬時植物內(nèi) 表達(dá)系統(tǒng)的測定法進(jìn)行測試，還通過轉(zhuǎn)基因手段，將其作為包含與農(nóng)藝學(xué)上重要的轉(zhuǎn)基因 序列融合的基因表達(dá)元件的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化事件加以測試。
[0155] 實施例2 :嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（TraP)序列的瞬時植物內(nèi)測試
[0156] 煙草瞬時測定：
[0157] 首先通過瞬時植物內(nèi)測定對Trapl2和Trapl3嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列進(jìn)行測試。 合成了編碼Trapl2(SEQ ID N0:5)和TraP13(SEQ ID N0:7)嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的多核 苷酸序列。在TraP序列和yfp編碼序列之間加入了一個接頭序列（SEQ ID NO: 10)。所得 的構(gòu)建體含有兩個植物轉(zhuǎn)錄單元（PTU)。第一個PTU包括擬南芥泛素10啟動子（AtUbilO 啟動子；Callis, et al·，（1990) J. Biol. Chem. ,265:12486-12493)、TraP-黃色熒光蛋白融 合基因（TraP-YFP ;美國專利申請?zhí)?007/0298412)、和根癌土壤桿菌ORF 23的3'非翻譯 區(qū)（Atu0RF23 3' UTR ;美國專利號5, 428, 147)。第二個PTU包括木薯葉脈花葉病毒啟動子 (CsVMV promoter ；Verdaguer et al., (1996)Plant Molecular Biology, 31:1129-1139)> 草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT ;Wohlleben et al.，（1988)Gene, 70:25-37)、和根癌土壤桿菌 ORF 1 的 3' 非翻譯區(qū)（AtuORF13' UTR ;Huang et al.，（1990) J. Bacteriol.，172:1814-1822)。 構(gòu)建體PDAB101981包含TraP12嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（圖3)。構(gòu)建體pDAB101989包含TraP13 嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（圖4)。在本研究中構(gòu)建并選用了對照質(zhì)粒101908,其在yfp基因的上 游不含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（圖5)。通過限制酶消化和測序驗證了這些構(gòu)建體。最后，將 構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌中，并作為甘油儲液存儲。
[0158] 從土壤桿菌甘油儲液，將一滿接種環(huán)的冷凍培養(yǎng)物接種到含有2ml YPD (100 μ g/ ml壯觀霉素）的14ml無菌管中。將接種后的培養(yǎng)基在28°C溫育過夜，同時以200rpm震 蕩。翌日，將大約100 μ 1培養(yǎng)物接種在含有25mlYPD (100 μ g/ml壯觀霉素）的125ml無菌 三隔擋板燒瓶（tri-baffled flask)中，并在28?下溫育過夜，同時以200rpm振蕩。第二 天，用無菌的CldH2O (pH 8. 0)將培養(yǎng)物稀釋至0D_為0. 5。將稀釋的土壤桿菌菌株以1:1的 比例與含有P19輔助蛋白的第二土壤桿菌菌株混合。使用該培養(yǎng)物通過下列文獻(xiàn)中所述的 方法浸潤煙草葉片：Voinnet 0, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D·，（2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9protein of tomato bushy stunt virus,The Plant Journal, 33:949-956。將 經(jīng)過浸潤的煙草植株置于Conviron?組件中，在16小時光照、24°C下放置至少三天，直到測 定。
[0159] 顯微觀察結(jié)果
[0160] 從植物切下經(jīng)土壤桿菌浸潤的煙草葉片，并置于含有水的培養(yǎng)皿（petri-dish) 中防止脫水。通過藍(lán)光激發(fā)，使用裝配好長通濾光片（long-pass filter glasses)的Dark Reader Hand Lamp?(Clare Chemical Research Co. ;Dolores, CO)并使用對經(jīng)過浸潤的 煙草葉片進(jìn)行觀察，以鑒定成功表達(dá)YFP報告蛋白的葉片的未損傷區(qū)域。將具體鑒定的 葉片區(qū)域從葉片切下，并置于水中，通過共聚焦顯微鏡（Leica TCS-SP5A0BS? Buffalo Grove，IL)成像。YFP報告蛋白使用多譜線氬離子激光器用514nm激光譜線激發(fā)。使用一 個無表達(dá)的（暗）對照葉片樣品調(diào)節(jié)檢測狹縫（slit)的寬度，以排除背景葉自發(fā)熒光。同 時在另一個通道內(nèi)收集葉綠素自發(fā)熒光，用于與確定葉綠體定位用的熒光報告蛋白的信號 進(jìn)行直接比較。
[0161] 顯微鏡成像的結(jié)果表明，包含TraP12或TraP13葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的YFP熒光蛋白積 累在位于煙草細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體內(nèi)，與之相比，對照YFP熒光蛋白不會轉(zhuǎn)位到煙草細(xì) 胞細(xì)胞質(zhì)葉綠體內(nèi)（圖6和圖7)。這些顯微鏡成像結(jié)果提示，YFP蛋白轉(zhuǎn)位到葉綠體內(nèi)是 由于TraP12或TraP13葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽造成的。如圖6和圖7所示，YFP熒光信號被定位在 葉綠體內(nèi)，而葉綠體由于自發(fā)熒光在顯微鏡成像條件下還發(fā)紅色熒光。相比之下，圖8提供 了用不含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的對照構(gòu)建體PDAB101908浸潤的煙草葉組織的顯微圖像。在顯微 鏡成像條件下，該圖像中的葉綠體僅由于自發(fā)熒光而顯示紅色熒光，而沒有任何在TraP浸 潤的煙草細(xì)胞中所顯示的YFP熒光信號。相反，對照煙草植物細(xì)胞中的YFP熒光在整個煙 草植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中彌散表達(dá)。
[0162] Western 印跡結(jié)果：
[0163] 通過Western印跡對經(jīng)過浸潤的煙草植物樣品進(jìn)行測定。收集葉沖孔（leaf punches)樣品并進(jìn)行球珠研磨。將大約100-200mg葉材料與2BBs(Daisy ;Rogers，AR)和 500ml PBST在Kleco?珠磨機(jī)中混合3分鐘。然后將樣品在離心機(jī)中4°C下以14, OOOx g離 心沉降。移出上清液，直接通過Western印跡進(jìn)行分析，或者進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀使用 Pierce Direct IP Kit?(Thermo Scientific ;Rockford, IL)并按照制造商的方案進(jìn)行。大 約50yg抗-YFP被結(jié)合在樹脂上。樣品與樹脂在4°C溫育過夜。接著，次日早晨對樣品進(jìn) 行清洗和洗脫，并通過與等體積的2X 8M尿素樣品緩沖液混合后煮沸樣品5分鐘準(zhǔn)備用于 分析的樣品。將煮沸過的樣品在MOPS緩沖液中的4-12% SDS-Bis Tris凝膠上運(yùn)行40分 鐘。然后，使用 Invitrogen iBlot?(Life Technologies ;Carlsbad, CA)按照制造商的方案 對凝膠進(jìn)行印跡。印跡過的膜用PBS-吐溫溶液中5%的脫脂奶粉封閉10分鐘。用PBS-吐 溫溶液中5%的脫脂奶粉以1:1000稀釋第一抗體（兔單克隆抗-GFP)，并用該第一抗體探 測膜1小時。接著，用PBS-吐溫將膜漂洗三次，每次5分鐘，以除去所有未結(jié)合的第一抗體。 用1:1000稀釋的第二單克隆山羊抗兔抗體（Life Technologies)探測膜60分鐘。如前所 述地清洗膜，并通過添加 Themo BCIP/NBT底物進(jìn)行顯影。讓比色底物顯影5-10分鐘，然后 用水漂洗印跡，再令印跡干燥。
[0164] Western印跡結(jié)果表明，在被浸潤的煙草細(xì)胞中表達(dá)了 YFP蛋白。在pDAB101981 和PDAB101989浸潤的煙草植物葉組織中均表達(dá)了 YFP蛋白，其表現(xiàn)是存在與YFP抗體反應(yīng) 的蛋白條帶，并且該條帶大小與從用YFP對照構(gòu)建體浸潤的煙草植物葉組織中獲得的YFP 蛋白條帶相當(dāng)。而且，這些結(jié)果表明，TraP嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽被加工，并且從YFP蛋白切除。 TraP12-YFP和TraP13-YFP構(gòu)建體表達(dá)一個被前處理的蛋白條帶，其分子量大于對照YFP蛋 白。在Western印跡上存在與對照YFP大小相當(dāng)?shù)臈l帶，表明該TraP12和TraP13葉綠體 轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列被加工，由此減少了 YFP的大小，使其分子量大小與YFP對照相當(dāng)。
[0165] 玉米原牛.質(zhì)體瞬時測定
[0166] 將Trapl2嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼多核苷酸序列（SEQ ID N0:5)和接頭序列（SEQ ID NO :10)克隆在黃色熒光蛋白基因的上游，并且納入到構(gòu)建體中，用于通過玉米原生質(zhì)體 瞬時植物內(nèi)測定法進(jìn)行測試。所得的構(gòu)建體含有下列植物轉(zhuǎn)錄單元（PTU)。第一個PTU包括 玉米泛素 1 啟動子（ZmUbil 啟動子；Christensen, A.，Sharrock R.，and Quail P.，（1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689)，TraP-黃色突光蛋白融 合基因（TraP12-YFP;美國專利申請2007/0298412)，和玉米過氧化物酶53'非翻譯區(qū) (ZmPer53' UTR ;美國專利No. 6384207)。該構(gòu)建體通過限制酶消化和測序得到了確認(rèn)。
[0167] 對玉米栽培種B104的種子在含有2?3滴吐溫20的50% Clorox (3 %次氯酸鈉） 中劇烈震蕩大約20分鐘進(jìn)行表面滅菌。將種子用無菌蒸餾水徹底漂洗。將無菌的種子點 種在放有1/2MS培養(yǎng)基的Phytatrays或相似類型盒子中，并讓它們在黑暗中（28°C )中生 長12至20天。使用玉米原生質(zhì)體瞬時測定法獲得并轉(zhuǎn)染來自B104-玉米葉片的原生質(zhì) 體。這種玉米原生質(zhì)體測定法是下列文獻(xiàn)所述系統(tǒng)的修改版本：Yoo, S. -D.，Cho, Υ. -H.，and Sheen,J.，（2007)，Arabidopsis Mesophyll Protoplasts:A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2:1565-1572。溶液的制備如 Yoo et.al. (2007)所述，只是用于下述實驗的甘露醇濃度改為0.6M。
[0168] 100-500 μ 1原生質(zhì)體（1-5χ105)的轉(zhuǎn)染通過在室溫下將原生質(zhì)體加入到含有約 40 μ g質(zhì)粒DNA(pDAB106597)的2ml微量離心管中來完成。DNA的體積優(yōu)選地保持為原生 質(zhì)體體積的約10%。在5分鐘的溫育期間偶爾對原生質(zhì)體和DNA進(jìn)行混合。將等體積的 PEG溶液緩慢加入到原生質(zhì)體和DNA中，每次加2滴，在各次加 PEG溶液之間的間隔進(jìn)行混 合。將試管再溫育約10分鐘，并偶爾輕輕混合。接著，加入Iml W5+溶液，并顛倒試管數(shù)次 混勻。將管在4°C下75x g離心5分鐘。最后除去上清液，并將沉淀物重懸浮于Iml WI溶 液中，并將原生質(zhì)體放置在小培養(yǎng)皿（35x IOmm)中或放置于6孔多孔平板中，并在室溫下 黑暗溫育過夜。溫育12小時后，通過顯微鏡觀察YFP熒光。使用前述的顯微鏡條件進(jìn)行成 像。
[0169] 顯微鏡成像的結(jié)果表明，包含TraP12嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的YFP熒光蛋白積累在煙 草細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體內(nèi)，相比之下，對照YFP熒光蛋白不轉(zhuǎn)位到煙草細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)葉綠 體內(nèi)（圖9)。這些顯微鏡成像結(jié)果提示，YFP蛋白轉(zhuǎn)位到葉綠體內(nèi)是由于TraP12嵌合葉綠 體轉(zhuǎn)運(yùn)肽造成的。
[0170] 實施例3 :用于在擬南芥中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)上重要的轉(zhuǎn)基因的嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽 (TraP)序列
[0171] 大腸桿菌5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）中的一個單氨基酸突 變（G96A)會導(dǎo)致草甘勝不敏感性（Padgette et al.，（1991) ;Eschenburg et al.，（2002); Priestman et al·，（2005) ;Haghani et al·，（2008))。盡管該突變會賦予對草甘膦的耐受 性，但是它已知也會不利地影響EPSP合酶與其天然底物--磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的結(jié) 合。由此造成的底物結(jié)合效率的改變可能會使得突變酶不適合于在植物內(nèi)提供對草甘膦的 耐受性。
[0172] 在計算機(jī)上對NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫篩選在EPSP合酶的與該酶的大腸桿菌版 本中引入的G96A突變類似的位置上天然含有丙氨酸的EPSP合酶蛋白和多核苷酸序列 (Padgette et al. , (1991) ；Eschenburg et al. , (2002) ；Priestman et al. , (2005)； Haghani et al. , (2008) )〇
[0173] -種被鑒定為在該位置含有天然丙氨酸的酶是來自斯維鏈霉菌（Streptomyces sviceus)ATCC29083 的 DGT-28 (GENBANK 登錄號 N0:ZP_06917240. 1)。進(jìn)一步的計算機(jī)數(shù)據(jù) 挖掘顯示了 3個另外的與DGT-28具有更大同源性的獨特鏈霉菌酶：DGT-31 (GENBANK ACC N0:YP_004922608.1) ;DGT-32(GENBANK ACC N0:ZP_04696613);和 DGT-33(GENBANK ACC N0:NC_010572)。這些酶中的每一個都在EPSP合酶的與該酶的大腸桿菌形式中引入的G96A 突變類似的位置上含有一個天然的丙氨酸。圖1。
[0174] 因為來自不同生物體的EPSP合酶蛋白具有不同的長度，所以對大腸桿菌版本的 EPSP合酶的突變編號不一定與對來自其它生物體的EPSP合酶的突變編號相對應(yīng)。這些鑒 定的EPSP合酶先前并未就其草甘膦耐受性或PEP底物親和力被表征過。而且，這些EPSP 合酶代表了一類新的EPSP合酶，且它們不含有任何已經(jīng)被用于表征先前描述的I類（在美 國專利No. RE39247中進(jìn)一步描述的植物來源序列）、II類（在美國專利No. RE39247中進(jìn) 一步描述的細(xì)菌來源序列）、和ΠΙ類（在國際專利申請WO 2006/110586中進(jìn)一步描述的 細(xì)菌來源序列）EPSP合酶的序列基序。
[0175] 對新型DGT-14, DGT-28, DGT-31, DGT-32和DGT-33酶的草甘膦耐受性和PEP底物 親和性進(jìn)行了表征，并與I類EPSP合酶進(jìn)行了比較。使用如下的I類酶進(jìn)行比較：來自大豆 的DGT-1，來自歐洲油菜的DGT-3 (GENBANK登錄號N0:P17688)，來自小麥的DGT-7 (GENBANK 登錄號N0:EU977181)。合成并評估了 I類EPSP合酶及其突變變體。在植物EPSP合酶中導(dǎo) 入的一個突變是與該酶的大腸桿菌版本中的G96A突變的相似位置處導(dǎo)入的甘氨酸向丙氨 酸的突變。此外，在如Funke et al.，（2009)所述的大腸桿菌EPSP合酶的氨基酸97 (T變 為I)和氨基酸101 (P變?yōu)镾)的相似位置處，在這些I類EPSP合酶中引入了蘇氨酸向異亮 氨酸和脯氨酸向絲氨酸的突變。
[0176] DGT14:
[0177] 如美國專利申請No. 11/975,658所述產(chǎn)生了含有與(^卜14轉(zhuǎn)基因融合的1'四卩12 和TraP13嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的轉(zhuǎn)基因的T1擬南芥植物。用不同比率的草甘膦噴灑轉(zhuǎn)基因 植物。在本研究中采用了不同濃度的草甘膦比率的分布，其中包括高比率，用于確定耐受性 的相對水平（105, 420, 1，680或3, 360gae/ha)。草甘膦的典型IX田間使用比例為1，120g ae/ha。本研究中使用的1\擬南芥植物的dgt-14轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)不同。通過分子確認(rèn)方法鑒 定低拷貝dgt-14 T1擬南芥植物，并自花受粉，用于產(chǎn)生T2植物。表1示出了 dgt-14轉(zhuǎn)基 因植物的耐受性，與包含草甘膦除草劑抗性基因 dgt-Ι的（如美國專利申請?zhí)朜o. 12558351 中描述的）對照植物進(jìn)行比較。
[0178] 擬南芥T1轉(zhuǎn)化體首先用草甘膦篩選方案從未轉(zhuǎn)化種子的背景中選擇出來。為每個 T1構(gòu)建體分析3個淺箱（flat)或30, 000個種子。對選出的T1植物進(jìn)行分子表征，并隨后 將植物轉(zhuǎn)移到單獨的地塊，并用如前所述的不同比例的商業(yè)草甘膦噴灑。這些植物的劑量 響應(yīng)用處理2周后（WAT)的％目測損傷表示。下面表中提供的數(shù)據(jù)顯示了展示很少或沒有 損傷（〈20% )、中等損傷（20?40% )或嚴(yán)重?fù)p傷（>40% )的各個植株。為每個用于擬南 芥轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體提供了算術(shù)平均和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列中對每個比率和轉(zhuǎn)化示明了個體 響應(yīng)的范圍。野生型，非轉(zhuǎn)化的擬南芥（哥倫比亞栽培種），用作草甘膦敏感型對照。
[0179] 在T1擬南芥植物中植物的響應(yīng)水平有不同。該變差可能是由于這樣的事實，即 每株植物代表一個獨立的轉(zhuǎn)化事件，因此感興趣的基因的拷貝數(shù)在每個植物之間有不同。 表1中提供了按比率別的總?cè)后w損傷平均值，證明與dgt-Ι和非轉(zhuǎn)化野生型對照相比，與 TraP12 v2或TraP13 v2葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽連鎖的每一個dgt-14構(gòu)建體均提供了對不同比例草 甘膦的耐受性。這些事件含有與TraP12V2(SEQIDN0 :ll)連鎖的dgt-14，其包含在構(gòu)建 體pDAB105528(圖10)中，和與TraP13v2(SEQ ID N0:12)連鎖的dgt-14,其包含在構(gòu)建體 pDAB105529(圖11)中。來自對T1植物的草甘膦選擇的數(shù)據(jù)證明，當(dāng)dgt-14與這些葉綠體 轉(zhuǎn)運(yùn)肽連鎖時，可以提供強(qiáng)的對高水平草甘膦的耐受性。相比之下，在用相似比率的草甘膦 處理非轉(zhuǎn)化的（或野生型）對照時，沒有提供對高濃度草甘膦處理的耐受性。此外，有些情 況下，顯示含有3個或更多個拷貝的dgt-14的事件對高比例的草甘膦更加敏感。這可能是 由于，擬南芥植物中存在的高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因沉默或者表觀遺傳效應(yīng)，結(jié)果雖然 存在dgt-14轉(zhuǎn)基因仍對草甘膦敏感。
[0180] 表I. dgt-14轉(zhuǎn)化的T1擬南芥對萌發(fā)后施用的一定范圍的草甘膦比例的響應(yīng)，與 dgt-l(T2)分離群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后2周的目測％損傷
[0181]

【權(quán)利要求】
1. 一種分尚的核酸分子，包含： 人造的蕓苔屬（Brassica)來源的核苷酸序列，其編碼包含第一蕓苔屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽 的連續(xù)氨基酸序列的肽，該肽還包含第二葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的連續(xù)氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其還包含感興趣的核苷酸序列，所述感興趣的核苷 酸序列與該人造的蕓苔屬來源的核苷酸序列可操作地連接。
3. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述第一蕓苔屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來自歐洲油菜 (Brassica napus)〇
4. 權(quán)利要求3的分離的核酸分子，其中所述第二葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來自與第一蕓苔屬葉綠 體轉(zhuǎn)運(yùn)肽不同的蕓苔屬物種。
5. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述第二葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來自擬南芥屬 (Arabidopsis)物種。
6. 權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述第二葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)〇
7. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述第一蕓苔屬葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來自3-烯醇式丙 酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶基因。
8. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述第二葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來自3-烯醇式丙酮酰莽 草酸-5-磷酸合成酶基因。
9. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述肽與選自SEQ ID N0:6和8的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽至少80 %相同。
10. 權(quán)利要求9的分離的核酸分子，其中所述肽與選自SEQ ID N0:6和8的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽至少85 %相同。
11. 權(quán)利要求10的分離的核酸分子，其中該肽與選自SEQ ID N0:6和8的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽至少90 %相同。
12. 權(quán)利要求11的分離的核酸分子，其中該肽與選自SEQ ID N0:6和8的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽至少95 %相同。
13. 權(quán)利要求12的分離的核酸分子，其中該肽與選自SEQ ID N0:6和8的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽至少98 %相同。
14. 權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中該肽選自SEQ ID N0:6和8。
15. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中該感興趣的核苷酸編碼序列不編碼SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO:3 的肽。
16. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中編碼該肽的核苷酸序列能夠與選自SEQ ID N0:6和8的核苷酸序列特異性雜交。
17. 權(quán)利要求2的分離的核酸分子，還包含至少一個額外的核苷酸序列，所述額外的核 苷酸序列分別編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述額外的核苷酸序列與所述感興趣的核苷酸序列 可操作地連接。
18. 權(quán)利要求17的分離的核酸分子，其中所述至少一個額外的核苷酸序列來自選自下 組的生物：原核生物、低等光合真核生物、和綠藻。
19. 權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所述人造的蕓苔屬來源的核苷酸序列以及感 興趣的核苷酸序列與一個或多個調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
20. 權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中該核酸分子編碼嵌合多肽，嵌合多肽包含由所 述感興趣的核苷酸序列編碼的肽和由所述人造的蕓苔屬來源的核苷酸序列編碼的肽。
21. 由權(quán)利要求20的核酸分子編碼的嵌合多肽。
22. 權(quán)利要求21的嵌合多肽，其中由所述感興趣的核苷酸序列編碼的肽被導(dǎo)向到含質(zhì) 體細(xì)胞中的質(zhì)體。
23. 權(quán)利要求22的嵌合多肽，其中該多肽包含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，當(dāng)由所述感興趣的多核 苷酸序列編碼的肽被導(dǎo)向到質(zhì)體時，該葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽被除去。
24. 權(quán)利要求21的嵌合多肽，其中該由感興趣的核苷酸序列編碼的肽是生物活性肽。
25. 權(quán)利要求21的嵌合多肽，其中該由感興趣的核苷酸序列編碼的肽是熒光肽。
26. 權(quán)利要求24的嵌合多肽，其中該生物活性肽是酶。
27. 權(quán)利要求24的嵌合多肽，其中該生物活性肽正常表達(dá)于天然表達(dá)所述肽的細(xì)胞的 質(zhì)體中。
28. 權(quán)利要求24的嵌合多肽，其中該生物活性肽參與選自下組的過程：除草劑抗性， 病毒抗性，細(xì)菌病原體抗性，昆蟲抗性，線蟲抗性，真菌抗性，植物活力，植物產(chǎn)量，溫度耐受 性，土壤條件耐受性，低光照水平耐受性，低水位耐受性，高水位耐受性，化學(xué)環(huán)境耐受性， 種子顏色，淀粉改性，氨基酸合成，光合作用，脂肪酸合成，油合成，類胡蘿卜素合成，萜類合 成，淀粉合成，和除草劑抗性。
29. 權(quán)利要求24的嵌合多肽，其中該生物活性肽選自下組：玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶，膽堿單加 氧酶，亞鐵螯合酶，ω -3脂肪酸去飽和酶，谷氨酰胺合成酶，維生素原A，激素，Bt毒素蛋白， 和對于鑒定含有感興趣的性狀的植物有用的標(biāo)志物。
30. 權(quán)利要求28的嵌合多肽，其中所述生物活性肽參與除草劑抗性。
31. 權(quán)利要求26的嵌合多肽，其中所述生物活性肽選自下組：乙酰乳酸合酶（ALS)，突 變的ALS，ALS的前體，3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合酶（EPSPS)，CP4 EPSPS和III類 EPSPS。
32. 包含權(quán)利要求2的核酸分子的植物表達(dá)載體。
33. 包含權(quán)利要求2的核酸分子的植物材料。
34. 權(quán)利要求33的植物材料，其中該植物材料選自下組：植物細(xì)胞、植物組織、植物組 織培養(yǎng)物、愈傷組織培養(yǎng)物、植物部分、和全植物。
35. 權(quán)利要求33的植物材料，其還包含含有所述肽的多肽。
36. 權(quán)利要求35的植物材料，其中所述感興趣的核苷酸序列編碼多肽的一部分，所述 多肽被導(dǎo)向到該植物材料的細(xì)胞中的質(zhì)體。
37. 權(quán)利要求33的植物材料，其中所述核酸分子穩(wěn)定整合到來自所述植物材料的細(xì)胞 的基因組中。
38. 權(quán)利要求33的植物材料，其中所述植物材料是全植物。
39. 權(quán)利要求33的植物材料，其中所述植物材料來自選自下組的植物：擬南芥屬，苜 蓿，蕓苔屬，豆類，西蘭花，卷心菜，胡蘿卜，花菜，芹菜，大白菜，棉花，黃瓜，茄子，萵苣，甜 瓜，豌豆，胡椒，花生，馬鈴薯，南瓜，蘿卜，油菜，菠菜，大豆，倭瓜，甜菜，向日葵，煙草，番茄， 西瓜，玉米，洋蔥，水稻，高粱，小麥，黑麥，黍，甘蔗，燕麥，黑小麥，柳枝稷，和草坪草。
40. -種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物材料的方法，該方法包括： 獲得權(quán)利要求2的分離的核酸分子；和 用該核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述植物材料選自下組：植物細(xì)胞、植物組織、植物 組織培養(yǎng)物、愈傷組織培養(yǎng)物、植物部分、和全植物。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中該植物材料不是全植物。
43. 通過根據(jù)權(quán)利要求40的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物材料。
44. 從權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因植物材料再生的轉(zhuǎn)基因植物。
45. 從權(quán)利要求43的植物材料產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)產(chǎn)品。
46. 權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中所述感興趣的核苷酸序列編碼生物活性肽。
47. 權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中所述生物活性肽參與選自下組的過程：除草 劑抗性，病毒抗性，細(xì)菌病原體抗性，昆蟲抗性，線蟲抗性，真菌抗性，植物活力，植物產(chǎn)量， 溫度耐受性，土壤條件耐受性，低光照水平耐受性，低水位耐受性，高水位耐受性，化學(xué)環(huán)境 耐受性，種子顏色，淀粉改性，氨基酸合成，光合作用，脂肪酸合成，油合成，類胡蘿卜素合 成，萜類合成，淀粉合成，和除草劑抗性。
48. 權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中所述生物活性肽選自下組：玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶， 膽堿單加氧酶，亞鐵螯合酶，ω-3脂肪酸去飽和酶，谷氨酰胺合成酶，維生素原A，激素 ，Bt 毒素蛋白，和對于鑒定含有感興趣的性狀的植物有用的標(biāo)志物。
49. 權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中所述生物活性肽參與除草劑抗性。
50. 權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中該生物活性肽選自下組：乙酰乳酸合酶 (ALS)，突變的ALS，ALS的前體，3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合酶（EPSPS)，CP4 EPSPS 和 III 類 EPSPS。
51. 權(quán)利要求49的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中該植物材料與相同物種的野生型植物材料相 t匕，顯示增加的除草劑抗性或除草劑耐受性。
52. -種分離的核酸分子，其包含蕓苔屬來源的用于將多肽導(dǎo)向到葉綠體的手段。
53. 權(quán)利要求52的分離的核酸分子，其還包含與所述蕓苔屬來源的用于將多肽導(dǎo)向到 葉綠體的手段可操作地連接的感興趣的核苷酸序列。
54. 權(quán)利要求53的分尚的核酸分子，其中該核酸分子編碼嵌合多肽，該嵌合多肽包括 由所述感興趣的核苷酸序列編碼的肽。
55. 由權(quán)利要求54的核酸分子編碼的嵌合多肽。
56. 權(quán)利要求55的嵌合多肽，其中由所述感興趣的核苷酸序列編碼的肽被導(dǎo)向到含質(zhì) 體細(xì)胞中的質(zhì)體。
57. 權(quán)利要求56的嵌合多肽，其中該多肽包含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，當(dāng)由所述感興趣的多核 苷酸序列編碼的肽被導(dǎo)向到質(zhì)體時，該葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽被除去。
58. 權(quán)利要求55的嵌合多肽，其中由感興趣的核苷酸序列編碼的肽是生物活性肽。
59. 權(quán)利要求58的多肽，其中該生物活性肽參與選自下組的過程：除草劑抗性，病毒抗 性，細(xì)菌病原體抗性，昆蟲抗性，線蟲抗性，真菌抗性，植物活力，植物產(chǎn)量，溫度耐受性，土 壤條件耐受性，低光照水平耐受性，低水位耐受性，高水位耐受性，化學(xué)環(huán)境耐受性，種子顏 色，淀粉改性，氨基酸合成，光合作用，脂肪酸合成，油合成，類胡蘿卜素合成，萜類合成，淀 粉合成，和除草劑抗性。
60. 權(quán)利要求58的多肽，其中該生物活性肽選自下組：玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶，膽堿單加氧 酶，亞鐵螯合酶，ω -3脂肪酸去飽和酶，谷氨酰胺合成酶，維生素原A，激素，Bt毒素蛋白，和 對于鑒定含有感興趣的性狀的植物有用的標(biāo)志物。
61. 權(quán)利要求58的多肽，其中該生物活性肽選自下組：乙酰乳酸合酶（ALS)，突變的 ALS，ALS的前體，3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合酶（EPSPS)，CP4 EPSPS和III類EPSPS。
62. 包含權(quán)利要求53的核酸分子的植物表達(dá)載體。
63. 包含權(quán)利要求53的核酸分子的植物材料。
64. 權(quán)利要求63的植物材料，其中所述核酸分子穩(wěn)定整合到來自所述植物材料的細(xì)胞 的基因組中。
65. 權(quán)利要求63的植物材料，其中所述植物材料是全植物。
66. 權(quán)利要求63的植物材料，其中所述植物材料來自選自下組的植物：擬南芥屬，苜 蓿，蕓苔屬，豆類，西蘭花，卷心菜，胡蘿卜，花菜，芹菜，大白菜，棉花，黃瓜，茄子，萵苣，甜 瓜，豌豆，胡椒，花生，馬鈴薯，南瓜，蘿卜，油菜，菠菜，大豆，倭瓜，甜菜，向日葵，煙草，番茄， 西瓜，玉米，洋蔥，水稻，高粱，小麥，黑麥，黍，甘蔗，燕麥，黑小麥，柳枝稷，和草坪草。
67. -種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物材料的方法，該方法包括： 獲得權(quán)利要求53的分離的核酸分子；和 用該核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料。
68. 根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中該植物材料選自下組：植物細(xì)胞、植物組織、植物組 織培養(yǎng)物、愈傷組織培養(yǎng)物、植物部分、和全植物。
69. 根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中該植物材料不是全植物。
70. 通過根據(jù)權(quán)利要求67的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物材料。
71. 從權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因植物材料再生的轉(zhuǎn)基因植物。
72. 權(quán)利要求70的植物材料，其中所述轉(zhuǎn)基因植物材料是全植物。
73. 從權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因植物材料產(chǎn)生的植物商業(yè)產(chǎn)品。
74. 權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中該感興趣的核苷酸序列編碼生物活性肽。
75. 權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物材料，其中所述植物材料是不能再生而產(chǎn)生植物的植物 細(xì)胞。
76. 權(quán)利要求41的方法，其中所述植物材料是不能再生而產(chǎn)生植物的植物細(xì)胞。
【文檔編號】C07K19/00GK104219950SQ201380018571
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】J·M·里拉, R·M·西奇洛, C·耶基斯, A·E·魯賓遜 申請人:陶氏益農(nóng)公司