專利名稱：：基于油菜子葉葉綠體轉化的組織培養(yǎng)體系及獲得轉化植株的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于植物轉基因
技術領域：
。具體涉及建立油菜子葉為外植體的葉綠體轉化組織培養(yǎng)體系，通過基因槍轉化法獲得油菜葉綠體轉基因植株的方法。本發(fā)明還涉及到利用油菜葉綠體片段為同源重組片段，構建油菜葉綠體特異性表達載體，對油菜葉綠體進行轉化并獲得轉基因植株的方法。
背景技術：
：葉綠體基因工程擁有許多獨特的優(yōu)勢，包括基因的高效表達、原核基因無需改造、可實現定點整合、外源基因不會隨著花粉擴散等等。而且葉綠體基因工程還克服了傳統(tǒng)核基因工程中易出現的基因失活，基因沉默和位置效應等現象，是一種很具有發(fā)展前景的植物轉基因技術。油菜是世界四大油料作物之一，不僅是食用植物油的最主要來源，也是潛在的僅次于豆粕的大宗飼用蛋白原，還是目前全球用于解決能源危機方向之一的生物柴油的理想原料。1988年Boynton等人利用基因槍轉化體系，以單細胞生物萊因衣藻為材料，經同源重組，使突變體轉化為能進行光合作用的正常萊因衣藻，證實了葉綠體轉化是可行的，同時也是首例成功的葉綠體轉化報道，標志著葉綠體基因工程的誕生。1989年I^lMaliga等人首次在高等植物煙草中實現了葉綠體轉化。自此，葉綠體基因工程迅速發(fā)展起來(McBride等，(1995)AmplificationofachimericBacillusgeneinchloroplastsleadstoanextraordinarylevelofaninsecticidalproteinintobacco.Biotechnology(NY)13(4):362-5；KhanMS等，(1999)Fluorescentantibioticresistancemarkerfortrackingplastidtransformationinhigherplants.NatBiotechnol,17(9):910-5；HouBK等，(2003)Chloroplasttransformationinoilseedrape.TransgenicRes12(1):111-4；Kumar等，(2004)Stabletransformationofthecottonplastidgenomeandmaternalinheritanceoftransgenes.PlantMolecularBiology56(2):203-216；Kumar等，Generationoffertiletransplastomicsoybean.PlantMolBiol55(4):479-89；Chakrabarti等，(2006).Expressionofthecry9Aa2B.t.geneintobaccochloroplastsconfersresistancetopotatotubermoth.TransgenicRes15(4):481-8.；Liu,等，(2007).Stablechloroplasttransformationincabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)byparticlebombardment.PlantCellRep26(10):1733-44；Liu等，(2008).ExpressionofaBacillusthuringiensistoxin(crylAb)geneincabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)chloroplastsconfershighinsecticidalefficacyagainstPlutellaxylostella.TheorApplGenet117(1):75-88；Soria-Guerra等，(2009).Expressionofamulti-epitopeDPTfusionproteinintransplastomictobaccoplantsretainsbothantigenicityandimmunogenicityofallthreecomponentsofthefunctionaloligomer.Planta229(6):1293-302.；Scotti等’(2009).High-levelexpressionoftheHIV-lPr55(gag)polyproteinintransgenictobaccochloroplasts.Planta229(5)1109-22。其中，侯丙凱等采用的外植體是油菜萌發(fā)4-5天的子葉柄，雖然具有再生率高、再生時間短的特點，但快速進入分化狀態(tài)對于后續(xù)轉化植株的同質化是不利的(HouBK,ZhouYH,WanLH,ZhangZL,ShenGF,ChenZH,HuZM(2003)Chloroplasttransformationinoilseedrape.TransgeRes12:111-114)。同時，在油菜葉綠體轉化中，目前突出的問題就是轉化受外植體類型限制、轉化頻率不高等。本發(fā)明從外植體類型和愈傷組織培養(yǎng)入手，通過較長時期的篩選，通過構建油菜葉綠體特異性表達載體進行轉化，建立了一種高效的以油菜子葉為外植體的葉綠體遺傳轉化方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提出一種以油菜子葉為外植體進行葉綠體轉化的組織培養(yǎng)體系，通過基因槍法獲得油菜葉綠體轉基因植株的方法，提高油菜葉綠體轉化的效率。本發(fā)明通過以下技術方案實現1.引物設計與載體構建1)根據Genebank公布的擬南芥葉綠體基因組序列(序列登錄號NC000932)，設計兩對特異引物對，用該引物對擴增油菜葉綠體基因trnl和trnA作為同源重組片段(見SEQIDNO7-8所示)。所述的引物對的編號及DNA序列如下F-trnI:5，-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3，；(序列表SEQIDNO3)R-trnI:5，-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3，。(序列表SEQIDNO4)F-trnA:5，-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3，；(序列表SEQIDNO5)R-trnA:5，-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3，。(序列表SEQIDNO6)2)用步驟1)所示的引物對從待轉化的油菜品種華油雜7號的葉綠體基因組中擴增trnl和trnA基因，將PCR產物回收后，片段trnl及克隆載體pBluescript用&icl和NotI進行酶切，片段trnA及克隆載體pBluescript用MlI和ApaI進行酶切，然后分別進行連接得到中間載體p-trnl和p-trnA。從質粒p-aadA(購自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV酶切獲得篩選標記基因aadA(見SEQIDNO1所示)及調控序列(見SEQIDNO2所示)，從質粒p-TpsbA(購自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV獲得終止子TpsbA(見SEQIDNO12所示)。將質粒p-Prrn((購自金思特科技(南京)有限公司)進行SmaI和EcoRV酶切，并與aadA基因連接得到中間載體pPrrn-aadA。將中間載體pPrrn_aadA進行EcoRV酶切，經CIAP去磷酸化酶處理后，與終止子片段TpsbA連接，得到含有完整aadA表達框架的中間載體p-aadAcassette。將含有左側同源重組片段trnl的質粒進行SpeI和SmaI酶切，將中間載體p-aadAcassette進行SpeI和SmaI雙酶切，分別回收片段并連接，得到中間載體p-trnl/aadAcassette.將p_trnl/aadAcassette載體用EcoRV酶切，經CIAP去磷酸化，將trnA片段T4DNApolymerase切平后連接，得到轉化載體pCL318-5。其具體的構建路線見附圖2。2.應用基因槍方法轉化油菜子葉，它包括以下步驟1)外植體的獲得選取飽滿的油菜種子(華油雜7號，華中農業(yè)大學選育的一個全國大面積推廣應用的油菜新品種)，先用70%酒精表面消毒種子2min，然后用15%H2O2浸泡種子35min，再用無菌水沖洗3-5遍，將種子播種于B5基本培養(yǎng)基(不添加其他附加成分)中，25°C，2000Lux,16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)4天。2)基因槍轉化及篩選切取4天經過步驟1)培養(yǎng)獲得的油菜植株的子葉，接種至B5-Y預培養(yǎng)基上，在黑暗條件下預處理4h，然后進行基因槍轟擊，每皿轟擊2次。轟擊后將其轉移至B5基本培養(yǎng)基上(不添加其他附加成分)，25°C，在黑暗條件下恢復培養(yǎng)16h。3)愈傷組織的誘導及篩選恢復培養(yǎng)后將子葉切成3mmX3mm大小的塊狀，轉入附加10mg/l壯觀霉素愈傷誘導培養(yǎng)基B5D-5S，25°C，于2000Lux下，16h光照/黑暗條件下進行愈傷組織誘導，直至篩選出綠色抗性愈傷組織。在此培養(yǎng)期間每兩周繼代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)4次。4)誘導愈傷組織的分化及篩選將上述綠色愈傷組織接種到附加20mg/l壯觀霉素BF3S分化培養(yǎng)基上，進行篩選，于25°C下，光照強度為2000LuX，16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)至分化出綠芽。5)誘導轉化的再生植株的生根及移栽將經過轉化的再生油菜苗轉移至生根培養(yǎng)基B5-N上，1周左右長出新根。將再生苗移栽到土中，放在溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，1光照/黑暗條件下培養(yǎng)。在本發(fā)明中，下列培養(yǎng)基是至關重要的，各類培養(yǎng)基的配方及編號如下1.發(fā)苗培養(yǎng)基(編號B5)2.預培養(yǎng)培養(yǎng)基(編號B5-Y)3.愈傷組織誘導及篩選培養(yǎng)基(編號B5D_5S)4.分化及篩選培養(yǎng)基(編號BF_3S)5.生根培養(yǎng)基(編號B5-N)上述培養(yǎng)基滅菌采用常規(guī)高壓蒸汽(121°C)滅菌20min，其中B5培養(yǎng)基的有機成分和AgNO3采用報道的抽濾方法滅菌，所述的有機成分和AgNO3在培養(yǎng)基溫度降至65°C左右時加入。6)PCR檢測候選轉基因植株，具體方法如下將步驟幻中抗性植株進行PCR檢測，利用PCR分子鑒定技術(具體程序參見梁國棟主編，最新分子生物學實驗技術，科學出版社，2001)，根據報告基因(aadA，見序列表SEQIDNO1所示)的序列設計引物5’端引物5’-ATGGCAGAAGCGGTGATCGC-3’(見序列表SEQIDNO9)；3，端引物5，-CTAGACATTATTTGCCGACTAC-3，(見序列表SEQIDNO10)。PCR循環(huán)反應參數95°C變性5min，然后依次在95°C變性lmin，64°C復性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)30次后在72°C保溫lOmin，最后4°C保存。取10μL擴增產物在含溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，紫外熒光下觀察結果并照相。7)PCR陽性株系的Southern雜交檢測提取步驟6)中經PCR檢測呈陽性的植物總DNA，取10μg轉基因油菜植株DNA，根據樣品數配制酶切反應混合液每個反應體系含IOXBuffer5μL，限制性內切酶EcoRI2μL含0011)，水沘“1^，混勻，分裝至0.51^的離心管中，每管；35“1，加入總0嫩15yL，酶切體系為50μL，小心彈勻，瞬時離心，置于37°C水浴中過夜(12-18h)，第二天上午取3μL電泳檢測酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚藍緩沖液終止酶切，置于4°C，直至電泳。用0.8%瓊脂糖(購自Sigma公司產品)凝膠電泳，0.8-1.OV/cm電泳18_24h。將膠切成膜一樣大小和形狀；用0.2mol/LHCl變性lOmin，置于轉膜臺上，用0.4mol/LNaOH和lmol/LNaCl作為轉移緩沖液，將DNA片段轉移到Hybond-N+尼龍膜上，轉移約Mh。轉好的膜用2XSSC漂洗兩次，各5min；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗指南(第三版M2002，科學出版社)所述方法進行。8)Southern雜交陽性株系的Northern雜交檢測提取步驟7)中經Southern雜交陽性株系的總RNA，利用Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)提取總RNA，液氮研磨后每管分約0.Ig,加入Iml的Trizol試劑(購自美國hvitrogen公司)，搖勻室溫靜置IOmin；加入200μ1的三氯甲烷后立即劇烈搖晃30s，室溫靜置5min；4°C,12000r/m離心IOmin；取上清溶液轉移置新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，4°C，12000r/m離心IOmin；棄上清，沉淀用70%乙醇溶液洗一次，4°C，12000r/m離心5min收集沉淀；室溫干燥后溶于20μ1的11000稀釋的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的總RNA首先用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測其完整性，然后用紫外分光光度法測定RNA的得率(0擬60/0擬80，Ratio,R)，R值介于1.8-2.2之間時，說明提取的RNA質量良好。利用DNA酶1(購自寶生物工程(大連)有限公司)除去總RNA中的基因組DNA。反應體系如下10倍的DNA酶I緩沖液5μ1，DNA酶I2μ1，RNA酶抑制劑(40U/ml)1μ1，總RNA20μ1(約40μg)補水至50μ1。37°C反應30min后，加入50μ1的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25241)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加入等量的氯仿/異戊醇(體積比為M1)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加入1/10體積的3M醋酸鈉(ρΗ5·2)和2.5倍體積的冷無水乙醇，_20°C放置60min,12000r/m離心IOmin回收沉淀，每管加入Iml70%的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m離心IOmin收集沉淀，室溫干燥后用20μ1的DEPC水溶解并進行凝膠電泳確認是否除去基因組DNA。每個樣品取20μgRNA進行甲醛變性凝膠電泳，具體過程如下配制切甲醛凝膠電泳緩沖液將20.6g3-(N-瑪琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml經用DEPC處理的50nmol/L乙酸鈉溶液。用2mol/L氫氧化鈉將溶液的pH值調至7.0，加IOml經用DEPC處理的0.5mol/LEDTA(pH8.0)，再加經用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，避光保存于室溫。制備凝膠將1.28g瓊脂糖溶于水，冷卻至60°C，加入切甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為Ix和2.2mol/L，在化學通風櫥內灌制凝膠，于室溫放置30分鐘使凝膠凝固。在一滅菌的微量離心管中混合樣品RNA(約20μg)4.5μ1，5χ甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μ1，甲醛3.5μ1，甲酰胺10.0μ1，于65°C溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒使管內所有液體集中于管底。然后加入2μ1滅菌切經DEPC處理過的甲醛加樣緩沖液(50%甘油，lmmol/LEDTApH8.0，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF)。加樣前將凝膠預電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，然后將樣品加至凝膠加樣孔L。將膠浸入Ix甲醛凝膠電泳緩沖液中，4V/cm電壓進行電泳。當溴酚藍遷移出點樣孔約8cm時停止電泳將膠切成膜一樣大小和形狀，先用DEPC處理過的水淋洗膠3次以去除甲醛，然后將膠在0.05mol/LNaOH中浸泡20min，用DEPC水沖洗后將膠置于轉膜臺上，20xSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)作為轉移緩沖液，將RNA片段轉移到Hybond-N+尼龍膜上，轉移約Mh。轉好的膜用2乂55(漂洗兩次，各5!^11；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗指南(第三版M2002，科學出版社)所述方法進行。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以油菜子葉為外植體，在參考已發(fā)表的油菜葉綠體轉化及其他高等植物葉綠體轉化的方法，并結合申請人已得到的油菜壯觀霉素耐受性研究結果的基礎上獲得。目前葉綠體遺傳轉化因受到外植體類型、篩選效率及重組體系的束縛，能應用到的高等植物種類還不是很多，在油菜中僅僅有使用下胚軸進行葉綠體轉化的報道。本發(fā)明克服了現有技術的不足，打破了油菜葉綠體轉化外植體類型的限制，利用油菜子葉為外植體，創(chuàng)造一種油菜子葉葉綠體轉化的新方法。根據擬南芥葉綠體的DNA序列設計特異性引物，擴增得到油菜葉綠體中的部分基因序列作為同源重組片段構建特異性轉化載體，通過基因槍法得到油菜葉綠體轉基因植株。通過PCR、S0uthern雜交和Nothern雜交，證明外源基因不僅整合到葉綠體基因組的特定位點，而且獲得表達。序列表SEQIDNO1是人工合成的aadA基因序列；序列表SEQIDNO:2是人工合成的核糖體結合位點序列；序列表SEQIDNO:3是引物F-trnI的序列；序列表SEQIDNO:4是引物R-trnI的序列；序列表SEQIDNO:5是引物F-trnA的序列；序列表SEQIDNO6是引物R-trnA的序列；序列表SEQIDNO7是油菜葉綠體基因trnl的序列；序列表SEQIDNO8是油菜葉綠體基因trnA的序列；序列表SEQIDNO9和10是鑒定aadA基因的引物對序列序列表SEQIDNO11是人工合成的啟動子ftTn序列；序列表SEQIDNO12是人工合成的終止子子TpsbA序列。圖1，是本發(fā)明的技術流程圖。圖2，是本發(fā)明中油菜葉綠體特異性表達載體pCL318-5物理構建圖譜，圖2續(xù)1是載體構建的第一部分。圖3，是本發(fā)明中利用基因槍法轉化得到的油菜葉綠體轉化植株，均能正常抽苔、開花和結果。圖3A是本發(fā)明獲得的轉基因油菜植株，圖:3B是本發(fā)明的轉基因植株正常開花和結莢。圖4，是本發(fā)明中轉化植株的PCR檢測結果，圖中標注M為分子量標記，1為空白對照，2為非轉基因油菜植株對照，3-7為本發(fā)明的轉基因油菜。圖5，是本發(fā)明中轉化植株的Southern雜交檢測結果，圖中標注CK為非轉基因油菜植株對照，1-5為本發(fā)明的轉基因油菜。圖6，是本發(fā)明中轉化植株的Northern雜交檢測結果，圖中標注CK為非轉基因油菜植株對照，1-5為轉基因油菜。圖7，是本發(fā)明中建立適合油菜葉綠體轉化的組織培養(yǎng)體系中6種愈傷誘導培養(yǎng)基和3種分化培養(yǎng)基之間的差異比較。圖7A是子葉在6種不同愈傷誘導培養(yǎng)基上誘導出的愈傷組織的差異；圖7B是培養(yǎng)4周后在6種愈傷誘導培養(yǎng)基上仍能保持愈傷狀態(tài)的頻率；圖7C是愈傷組織在3種不同分化培養(yǎng)基上的分化率差異。具體實施例方式實施例1以油菜子葉為外植體的葉綠體轉基因植株的培育方法1.轉化載體的構建(1)同源重組片段trnl/trnA的克隆參照Genebank公布的擬南芥葉綠體基因組序列(序列登錄號NC000932)，設計兩對特異引物對，用該引物對擴增油菜葉綠體基因trnl和trnA作為同源重組片段。所述的引物對的編號及DNA序列如下F-trnI:5，-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3，；(序列表SEQIDNO3)R-trnI:5，-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3，。(序列表SEQIDNO4)F-trnA:5，-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3，；(序列表SEQIDNO5)R-trnA:5，-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3，。(序列表SEQIDNO6)反應體系為dNTP(2mM)2μ1IOX緩沖液2·5μ1(購自寶生物工程(大連)有限公司)MgCl21.5μ1Primerl(IOmM)0.5μ1Primer2(IOmM)0.5μ1Taq(5U/L)0.5μ1模板DNA(50ng/μ1)1μ1去離子水17.5μ1總體積25μ1PCR循環(huán)反應參婁'1:95°C變性4min，然后依次在95°C變性lmin，58°C復性lmin,72°C延伸lmin，循環(huán)35次后在72°C保溫lOmin，最后4°C保存。取3μL擴增產物在含溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，紫外熒光下觀察結果并照相。將剩余的PCR回收，片段trnl及克隆載體pBluescript用McI和NotI進行酶切，片段trnA及克隆載體pBluescript用&ill和ApaI進行酶切，然后分別進行連接得到中間載體p_trnl和p-trnA。(2)aad_cassette表達框架的構建從質粒p-aadA(購自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV酶切獲得篩選標記基因aadA及調控序列，從質粒p-TpsbA(購自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV獲得終止子TpsbA。將質粒p-Prrn(購自金思特科技(南京)有限公司)進行SmaI和EcoRV酶切，并與aadA基因連接得到中間載體pPrrn_aadA。將中間載體pPrrn-aadA進行EcoRV酶切，經CIAP去磷酸化酶處理后，與終止子片段TpsbA連接，得到含有完整aadA表達框架的中間載體p-aadAcassette。(3)轉化載體pCL318-5的構建將含有左側同源重組片段trnl的質粒進行SpeI和SmaI酶切，中間載體p-aadAcassette進行SpeI和SmaI雙酶切，分別回收片段并連接，得到中間載體p-trnl/aadAcassette。將p-trnl/aadAcassette載體進行EcoRV酶切，經CIAP去磷酸化，將trnA片段T4DNApolymerase切平后連接，得到轉化載體pCL318_5。2.基因槍法介導的油菜子葉的葉綠體遺傳轉化(1)轉化外植體的獲得選取飽滿的油菜種子(華油雜7號，華中農業(yè)大學選育的一個全國大面積推廣應用的油菜新品種)，)，先用70%酒精表面消毒種子2min，然后用15%H2O2浸泡種子35min，再用無菌水沖洗3-5遍，將種子播種于B5基本培養(yǎng)基(不添加其他附加成分)中，25°C，2000Lux,16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)4天。(2)基因槍轉化切取生長4天的油菜植株的子葉，接種至B5-Y預培養(yǎng)基上，在黑暗條件下預處理4h，然后進行基因槍轟擊，每皿轟擊2次。轟擊后將其轉移至B5基本培養(yǎng)基上(不添加其他附加成分)，25°C，黑暗條件下恢復培養(yǎng)16h。(3)愈傷誘導及篩選恢復培養(yǎng)后將子葉切成3mmX3mm大小的塊狀，轉入附加10mg/l壯觀霉素愈傷誘導培養(yǎng)基B5D-5S，25°C，于2000Lux下，16h光照/黑暗條件下進行愈傷組織誘導，直至篩選出綠色抗性愈傷組織。在此培養(yǎng)期間每兩周繼代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)4次。(4)愈傷組織的分化及篩選將上述綠色愈傷組織接種到附加20mg/l壯觀霉素BF3S分化培養(yǎng)基上，進行篩選，于25°C下，光照強度為2000LuX，16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)至分化出綠芽。(5)誘導轉化的再生植株生根及移栽將經過轉化的再生油菜苗轉移至生根培養(yǎng)基B5-N上，1周左右長出新根。將再生苗移栽到土中，放在溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，1光照/黑暗條件下培養(yǎng)至開花結實(見附圖3)。在以上步驟中，培養(yǎng)基是獲得轉基因植株的關鍵所在，相關培養(yǎng)基的配方如下1.發(fā)苗培養(yǎng)基(編號B5)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMo04·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，VB1lmg/L,VB6lmg/L，半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.6；2.預培養(yǎng)培養(yǎng)基(編號B5-Y)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2O10mg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，VB1lmg/L，VB6lmg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L,瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.6；3.愈傷組織誘導及篩選培養(yǎng)基(編號是否為B5)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨10mg/L，2，4_D0.6mg/L，KT0.ang/L，壯觀霉素10mg/L，AgNOJmg/1，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調ρΗ5·6；4.分化及篩選培養(yǎng)基(編號BF_3S)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨10mg/L，6_BAlmg/L,KTlmg/L,NAA0.5mg/L,壯觀霉素20mg/L，AgNOJmg/l，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.6；5.生根培養(yǎng)基(編號:B5-N)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨10mg/L，NAA0.lmg/L，壯觀霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.6。3.候選轉基因植株的PCR檢測利用PCR分子鑒定技術(具體程序參見梁國棟主編，最新分子生物學實驗技術，科學出版社，2001)，根據報告基因(aadA，見序列表SEQIDNO!)的序列設計引物，序列如下5，端引物:5，-ATGGCAGAAGCGGTGATCGC-3，(見序列表SEQIDNO9)3，端引物:5，-CTAGACATTATTTGCCGACTAC-3，(見序列表SEQIDNO10)。反應體系為dNTP(2mM)2μ1IOX緩沖液(Buffer)2.5μ1(購自寶生物工程(大連)有限公司)MgCl21.5μ1Primerl(IOmM)0.5μ1Primer2(IOmM)0.5μ1Taq(5U/L)0.5μ1模板DNA(50ng/y1)1μ1去離子水17.5μ1總體積25μ1PCR循環(huán)反應參數95°C變性5min，然后依次在95°C變性lmin，64°C復性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次后在72°C保溫lOmin，最后4°C保存。取10μL擴增產物在含溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，紫外熒光下觀察結果并照相。發(fā)明效果如附圖4。4.轉基因植株的Southern雜交檢測取經PCR檢測呈陽性的植物總DNA約10μg，根據樣品數配制酶切反應混合液每個反應體系含10XBuffer5μL，限制性內切酶EcoRI2μ1^含QOu)，水觀μL，混勻，分裝至0.5mL的離心管中，每管35μ1，加入總DNA15μL，酶切體系為50μL，小心彈勻，瞬時離心，置于37°C水浴中過夜(12-1)，第二天上午取3μL電泳檢測酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚藍緩沖液終止酶切，置于4°C，直至電泳。用0.8%瓊脂糖(購自Sigma公司產品)凝膠電泳，0.8-1.OV/cm電泳18_24h。將膠切成膜一樣大小和形狀；用0.2mol/LHCl變性lOmin，置于轉膜臺上，用0.4mol/LNaOH和lmol/LNaCl作為轉移緩沖液，將DNA片段轉移到Hybond-N+尼龍膜上，轉移約Mh。轉好的膜用2乂33(漂洗兩次，各51^11；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗指南(第三版M2002，科學出版社)所述方法進行。發(fā)明效果見附圖5。5.轉基因植株的Northern雜交檢測提取經Southern雜交陽性株系的總RNA，利用Trizol試劑(購自美國hvitrogen公司)提取總RNA，液氮研磨后每管分約0.lg，加入Iml的Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)，搖勻室溫靜置IOmin；加入200μ1的三氯甲烷后立即劇烈搖晃30s，室溫靜置5min；4°C，12000r/m離心IOmin；取上清溶液轉移置新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，4°C，12000r/m離心IOmin；棄上清，沉淀用70%乙醇溶液洗一次，4°C，12000r/m離心5min收集沉淀；室溫干燥后溶于20μ1的11000稀釋的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的總RNA首先用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測其完整性，然后用紫外分光光度法測定RNA的得率(OD26tlA)D28tl，Ratio,R)，R值介于1.8-2.2之間時，說明提取的RNA質量良好。利用DNA酶1(購自寶生物工程(大連)有限公司)除去總RNA中的基因組DNA。反應體系如下10倍的DNA酶I緩沖液5μ1(購自美國hvitrogen公司)，DNA酶I2μ1，RNA酶抑制劑(40U/ml)1μ1，總RNA20μ1(約40μg)補水至50μ1。37。C反應30min后，加入50μ1的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25241)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加入等量的氯仿/異戊醇(體積比為M1)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加Λ1/10體積的3Μ醋酸鈉(ρΗ5·2)和2.5倍體積的冷無水乙醇，_20°C放置60min,12000"m離心IOmin回收沉淀，每管加入Iml70%的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m離心IOmin收集沉淀，室溫干燥后用20μ1的DEPC水溶解并進行凝膠電泳確認是否除去基因組DNA。每個樣品取20μgRNA進行甲醛變性凝膠電泳，具體過程如下配制切甲醛凝膠電泳緩沖液將20.6g3-(N-瑪琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml經用DEPC處理的50nmol/L乙酸鈉溶液。用2mol/L氫氧化鈉將溶液的pH值調至7.0，加IOml經用DEPC處理的0.5mol/LEDTA(pH8.0)，再加經用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，避光保存于室溫。制備凝膠將1.28g瓊脂糖溶于水，冷卻至60°C，加入切甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為Ix和2.2mol/L，在化學通風櫥內灌制凝膠，于室溫放置30分鐘使凝膠凝固。在一滅菌的微量離心管中混合樣品RNA(約20yg)4.5yl，5χ甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μ1，甲醛3.5μ1，甲酰胺10.0μ1，于65°C溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒使管內所有液體集中于管底。然后加入2μ1滅菌切經DEPC處理過的甲醛加樣緩沖液(50%甘油，lmmol/LEDTApH8.0，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF)。加樣前將凝膠預電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，然后將樣品加至凝膠加樣孔。將膠浸入Ix甲醛凝膠電泳緩沖液中，4V/cm電壓進行電泳。當溴酚藍遷移出點樣孔約8cm時停止電泳將膠切成膜一樣大小和形狀，先用DEPC處理過的水淋洗膠3次以去除甲醛，然后將膠在0.05mol/LNaOH中浸泡20min，用DEPC水沖洗后將膠置于轉膜臺上，20xSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)作為轉移緩沖液，將RNA片段轉移到Hybond-N+尼龍膜上，轉移約Mh。轉好的膜用2\55(漂洗兩次，各5!^11；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗指南(第三版M2002，科學出版社)所述方法進行。發(fā)明效果見附圖6。實施例2對比實驗實施例1)不同愈傷誘導培養(yǎng)基對甘藍型油菜子葉誘導愈傷組織的差異在本實施例中，申請人設計了6種誘導愈傷組織的培養(yǎng)基(如后所述)，以三個油菜品種華油雜6號、華油雜7號、華油雜9號(該三個品種均為華中農業(yè)大學選育，在中國大面積推廣應用的油菜新品種)的子葉為外植體，期望能夠獲得一種能夠長期保持愈傷組織脫分化狀態(tài)，并能得到較高質量愈傷組織的愈傷誘導培養(yǎng)基。本發(fā)明設計的6種培養(yǎng)基的配方及編號如下B5D-1:B5基本培養(yǎng)基+NAA5mg/l+6_BA5mg/l；B5D-2:B5基本培養(yǎng)基+0.4%MES；B5D-3:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.2mg/l；B5D-4:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.4mg/l；B5D-5:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.6mg/l+KT0.2mg/l；B5D-6:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.8mg/l+KT0.3mg/l；上述培養(yǎng)基中的激素英文縮寫的定義為6-BA:6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤；KTKinetin，激動素；NAA=Napthaleneaceticacid,萘乙酸；2，4_D:2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸；MES:2_(N-嗎啉)乙磺酸MES。上述培養(yǎng)基均添加30g/l蔗糖和;3mg/lAgNO3,制備時補充水分至1L，滅菌前調pH至5.6，培養(yǎng)基用121°C高壓蒸汽滅菌20min。試驗表明，在上述培養(yǎng)基中，編號為B5D-5培養(yǎng)基誘導的愈傷組織出愈率較高，4周后大部分愈傷組織仍保持較好的脫分化狀態(tài)，致密且呈淡綠色，有利于芽苗的分化。而且在4周后，仍有80%以上的愈傷組織保持脫分化狀態(tài)，發(fā)明效果如圖6A-e，6B。2)不同分化培養(yǎng)基對芽苗分化的影響將上述在B5D-5培養(yǎng)基上，25°C，2000Lux，16h光照/8h黑暗條件下生長1個月的愈傷組織分別接種到下列分化培養(yǎng)基上，30d后統(tǒng)計分化率，期望獲得能使長期保存的愈傷組織具有較高分化能力，較低玻璃化和畸形再生植株頻率的分化培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基的配方和編號BFl:B5基本培養(yǎng)基+6-BA3mg/L+ZTlmg/1；BF2:B5基本培養(yǎng)基+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/l；BF3:B5基本培養(yǎng)基+6-BAlmg/L+KTlmg/1+0.5mg/lNAA；上述培養(yǎng)基均添加30g/l蔗糖和;3mg/lAgNO3,制備時補充水分至1L，滅菌前調pH至5.6，培養(yǎng)基用121°C高壓蒸汽滅菌20min。根據培養(yǎng)30天的油菜葉綠體愈傷組織的分化率統(tǒng)計，編號為BF3的分化培養(yǎng)基能夠使長期處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織快速進入分化階段，10-15d左右在油菜葉綠體愈傷組織表面出現綠色芽點，30d左右分化出綠芽，未發(fā)現有玻璃化和形態(tài)畸形的再生芽。正常再生綠芽經生根培養(yǎng)基誘導，通過壯苗后移栽至溫室管理，所有再生植株均能正常抽苔、開花和結果，未發(fā)現畸形苗(見圖6C)。序列表<110>華中農業(yè)大學<120>基于油菜子葉葉綠體轉化的組織培養(yǎng)體系及獲得轉化植株的方法<130><141>2010-01-27<160>12<170>PatentInversion3.1<210>1<211>792<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1)..(792)<223><400>1atggcagaaggagcgccatcggcctgaagcacaacgcggcgagattctcctatccagctaatcttcgagccatagcgttggatctatttgggcgatgagccggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatc60tcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggc120cacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaa180gagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagc240gcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgt300agcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggt360cagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaa420ccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcttgaacag480aggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggct540gaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggc600aaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataa<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><221>RBS<222>(1)..(36)<223><400>2aataattttgtttaactttaagaaggagatataccc36<210>3<211>28<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221>primer_bind<222>(1)..(28)<223><400>3atagagctctggaaccctgaacagactg28<210>4<211>29<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221>primer_bind<222>(1)..(29)<223><400>4atagcggccgcatttgaaccagagacctc29<210>5<211>28<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220>660720780792<221>primer_bind<222>(1)..(28)<223><400>5atagtcgacggggatatagctcagttgg28<210>6<211>28<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221>primer_bind<222>(1)..(28)<223><400>6taagggccccggtactacttcgctatcg28<210>7<211>1493<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene<222>(1)..(1493)<223><400>7tggaaccctgaacagactgccggtgataagccggaggaaggtgaggatgacgtcaagtca60tcatgccccttatgccctgggcgacacacgtgctacaatggccgggacaaagggtcgcga120tcccgcgagggtgagctaactccaaaaacccgtcctcagttcggattgcaggctgcaact180cgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgccggtcagccatacggcggtgaattcgt240tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacactatgggagctggccatgcccgaagtcgtt300accttaaccgcaaggaggggggtgccgaaggcagggctagtgactggagtgaagtcgtaa360caaggtagccgtactggaaggtgcggctggatcacctccttttcagggagagctaatgct420tcttgggtatttaggtttgacacagcttcaaacccaaagcccatgagcttattatcctag480gtcggaacaagttgataggatccccttttacgcccccatgtccctctcgtgtggcggcag540gggggcgtaaaaaggaaagagagggatggggtttctctcgcttttggcttggcatagcgg600gcccccagcaggaggcccgcacgacgggctattagctcagtggtagagcgcgcccctgat660aattgcgtcgttgtgcctgggctgtgagggctctcagccacatggatagttcaatgtgct720catcagcgcctgaccctgagatgtggatcatccaaggcacattagcatggcgtactcctc780ctgttcgaaccggggtttgaaaccaaacttctcctcaggaggatagatggggcgattcac840gtgagatccaatgtagatccaactttctattcactcgtgggatccgggcggtccggaggg900gaccaccacggctcctctcttctcgagaatccatacatcccttatcagtgtatggacagc960tatctctcgagcgcaggtttaggttcggcctcaatgggaaaataaaatggagcacctaac1020aacgtatcttcacagaccaagaactacgagatcacccctttcattctggggtgacggagg1080gatcgtaccgttcgagcctttttttcatgcttttcccaggggtctggagaaagctgcaatl140caataggattttcctaatcctcccttcccgaaaggaagaacgtgaaattctttttccttt1200ccgcctcgaaatgggagcaggtttgaaaaaggatcttagagtgtctagggttaggccagt1260agggtctcttaacgccctcttttttcttctcatcgaagttatttcacaaatacttcctat1320ggtaaggaagagggggggaacaagcacacttggagagcgcagtacaacggagagttgtat1380gctgcgttcgggaaggatgaatcgctcccgaaaaggaatctattgattctctcccaattg1440gttggaccataggtgcgatgatttacttcacgggcgaggtctctggttcaBat1493<210>8<211>1490<2l2>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><22l>gene權利要求1.一種利用基因槍方法培育油菜葉綠體轉基因的方法，其步驟包括培養(yǎng)基制備，引物設計、PCR擴增、載體構建和遺傳轉化，其特征在于，以油菜子葉為外植體，通過基因槍法將油菜葉綠體特異性表達載體導入受體油菜中，通過篩選及鑒定，得到葉綠體轉化植株，其步驟如下1)引物設計和載體構建根據Genebank公布的擬南芥葉綠體基因組序列(登錄號為NC00093》，設計兩對特異引物對F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA，以油菜葉綠體基因組為模板，用所述的引物對F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA擴增trnl和trnA基因片段，測序后作為同源重組片段，從質粒p-aadA中分別用SmaI和EcoRV酶切獲得篩選標記基因aadA，其序列如SEQIDNO:X所示，調控序列，其序列如SEQIDNO:Y所示，從質粒p-Prrn中分別用SpeI和BioI酶切獲得啟動子Prrn，從質粒p-TpsbA中分別用SmaI和EcoRV獲得終止子TpsbA，將所述的同源重組片段、啟動子、篩選標記基因和終止子連接到載體pBluescript上，構建得到油菜葉綠體特異性表達載體pCL318_5；所述的特異引物對F-trnI、R-trnI、F-trnA禾口R-trnA的DNA序列如下所示F-trnI:5’-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3’，R-trnI:5’-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3，；F-trnA:5’-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’，R-trnA5'-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3’；2)應用基因槍方法轉化油菜子葉，它包括以下步驟1)外植體的獲得取飽滿油菜種子經表面消毒后接種至B5基本培養(yǎng)基上，在25°C，2000Lux,16h光照/黑暗條件下生長4d，然后將子葉切下，黑暗條件下高滲？預處理4h；2)基因槍轉化及篩選將步驟1)的油菜子葉，進行基因槍轟擊，每皿轟擊2次，轟擊后在黑暗條件下用B5培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)16h；3)愈傷組織的誘導及篩選將恢復培養(yǎng)后的油菜子葉切成3mmX3mm的塊狀，轉入附加10mg/l壯觀霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基B5D-5S上，于25°C，2000Lux,16h光照/黑暗條件下誘導愈傷組織，每兩周繼代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)4次；4)愈傷組織的分化誘導將步驟3)的綠色抗性愈傷組織接種到附加20mg/l壯觀霉素的分化培養(yǎng)基BF3S上，于25°C下，2000Lux,16h光照/黑暗條件下培養(yǎng)至分化出綠色小芽，得到候選轉基因苗；5)再生芽的生根誘導將步驟4)的得到的材料，在生根培養(yǎng)基B5-N上和壯苗培養(yǎng)基B5上培養(yǎng)，篩選獲得候選轉基因植株；6)采用PCR、Southern方法檢測PCR陽性株系，獲得轉基因植株。其中所述的培養(yǎng)基成分如下所述發(fā)苗培養(yǎng)基B5:KNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，Vbilmg/L,VB6lmg/L,半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L,補充水分至1L，滅菌前調pH至5.5；預培養(yǎng)培養(yǎng)基B5-YKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L,瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.5；愈傷組織誘導和篩選培養(yǎng)基B5D-5SKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L,半胱氨10mg/L，2，4_D0.6mg/L，KT0.ang/L，壯觀霉素10mg/L，AgNO3:3mg/l，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調ρΗ5·5；分化和篩選培養(yǎng)基BF-3SKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，Vbilmg/L，Vb6lmg/L，半胱氨10mg/L，6-BAlmg/L,KTlmg/L,NAA0.5mg/L,壯觀霉素20mg/L，AgNO33mg/l，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.5；生根培養(yǎng)基B5-NKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2Η200.25mg/L,CuSO4‘5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoC126H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，Vbilmg/L，Vb6lmg/L，半胱氨10mg/L，NAA0.lmg/L，壯觀霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補充水分至1L，滅菌前調pH至5.5。2.權利要求1所述的方法，其中步驟6)中Southern雜交所述的步驟如下提取經PCR檢測呈陽性的油菜葉片的總DNA，用限制性內切酶EcoRI酶切，將酶切過的DNA片段轉移到Hybond-N+尼龍膜上，并用32P制備探針，對轉好的膜進行分子雜交、洗膜、壓片，篩選陽性植株。3.權利要求1和2所述的方法在培育油菜轉基因植株上的應用。全文摘要本發(fā)明屬于植物轉基因
技術領域：
。具體涉及一種甘藍型油菜轉基因的方法。本發(fā)明建立了適合以油菜子葉為外植體的葉綠體轉化組織培養(yǎng)體系，通過基因槍轉化法獲得油菜葉綠體轉基因植株。本發(fā)明還公開了利用油菜葉綠體片段為同源重組片段，構建油菜葉綠體特異性表達載體，對油菜葉綠體進行轉化并獲得轉基因植株的方法。本發(fā)明為甘藍型油菜的轉基因提供了一種新途徑。文檔編號C12N15/82GK102051376SQ201010103458公開日2011年5月11日申請日期2010年1月27日優(yōu)先權日2010年1月27日發(fā)明者傅庭棟,廖玉才,李和平,涂金星,瞿波,程琳,黃濤申請人:華中農業(yè)大學