專利名稱：：一種小麥試管苗葉片反復(fù)再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種小麥試管苗葉片再生的方法，尤其涉及一種通過小麥試管苗葉片的組織培養(yǎng)使小麥試管苗反復(fù)再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：小麥(TriticumaestivumL)是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，是糧食的主要來源之一。為了改良小麥，目前所進(jìn)行的小麥轉(zhuǎn)基因研究，都是將目的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。與細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因具有表達(dá)量高、遺傳穩(wěn)定、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。而作為作物遺傳改良新方向的葉綠體基因工程并未運(yùn)用于小麥遺傳性狀的改良。這是由于小麥等禾谷類糧食作物很難利用綠色的葉組織進(jìn)行反復(fù)再生，嚴(yán)重限制了其葉綠體轉(zhuǎn)基因工作的開展。國外的葉綠體基因工程應(yīng)用主要集中在雙子葉植物(Danielletal.2005)，例如煙草、馬鈴薯、番茄和胡蘿卜等。這些植物之所以能夠成功獲得性狀穩(wěn)定遺傳的改良植株，一個(gè)最主要原因是最初獲得的葉綠體轉(zhuǎn)基因雜合體可以在篩選過程中使綠色葉片或者綠色愈傷組織反復(fù)再生，在反復(fù)再生和篩選過程中，逐漸淘汰未轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，最終獲得同質(zhì)化的轉(zhuǎn)化體——即葉綠體轉(zhuǎn)基因純合體(Grevich，J.J.2005)。而單子葉的禾谷類作物，如小麥、水稻等正是由于試管苗葉組織反復(fù)再生體系的缺乏，因而無法獲得葉綠體轉(zhuǎn)基因的純合體(SaMiLeeetal.2006)，也極大地限制了利用綠色葉片作為受體材料開展葉綠體轉(zhuǎn)基因研究。自從陳惠民等(1980)首次通過小麥種子苗葉片組織培養(yǎng)獲得再生苗以來，Ahuja(1982)、Alfinetta(1983)、Kopertekh(2003)、Chugh(2003)、郝建國(2003)、宣云(2004)等都通過不同的配方及培養(yǎng)條件獲得了葉片誘導(dǎo)的再生植株。但是，他們都是以種子苗基部做為實(shí)驗(yàn)材料獲得的再生苗，也就是只進(jìn)行了一輪的再生。目前國內(nèi)外尚未見到有通過胚性愈傷組織分化的試管苗(即再生苗)幼葉反復(fù)再生試管苗的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種小麥試管苗幼葉反復(fù)再生的方法，以解決小麥試管苗反復(fù)再生難的問題。本發(fā)明所述反復(fù)再生體系指可以通過組織培養(yǎng)過程循環(huán)獲得再生苗的植物組織培養(yǎng)體系。本發(fā)明所述小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，步驟包括(l)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)(3)試管苗的獲得(4)試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織(5)二次再生苗的誘導(dǎo)(6)誘導(dǎo)生根(7)二次再生苗的移栽；其中步驟(1)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的方法是取開花后1416天的小麥未成熟麥穗，于體積比為75%酒精中浸38分鐘滅菌；然后將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚；再挑選直徑0.81.2mm的幼胚，盾片向上接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，25士rC，黑暗培養(yǎng)23周；獲得胚性愈傷組織；5步驟(2)所述愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法是取步驟(1)獲得的愈傷組織，先切除其上由幼胚長出的胚芽，再把愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，光照強(qiáng)度為5565iimo1m—2s—、光照時(shí)間1014hd—、晝溫度25±rC進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，23周繼代一次；步驟(3)所述試管苗獲得的方法是將步驟(2)所述繼代一次以上的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基I，光照強(qiáng)度為75125iimo1m—2s—、光照時(shí)間1418hd—、晝溫度25士rC進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)23周形成叢生試管苗；步驟(4)所述試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的方法是待步驟(3)培養(yǎng)的試管苗長到25cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部13mm的葉段放至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，25士rC條件下暗培養(yǎng)34周，在葉段的切口處有34mm的愈傷組織團(tuán)形成；步驟(5)所述二次再生苗誘導(dǎo)的方法是將步驟(4)中誘導(dǎo)形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基II上，按步驟(3)所述條件下進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)34周，誘導(dǎo)出二次再生的試管苗；步驟(6)所述誘導(dǎo)生根的方法是將步驟(5)中獲得的二次再生苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，按步驟(3)所述的培養(yǎng)條件下進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)34周，得生根植株；步驟(7)所述二次再生苗移栽的方法是將步驟(6)中生根的二次再生試管苗轉(zhuǎn)至20±1t:溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗24天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，相對(duì)濕度控制在50%60%之間，經(jīng)47天的適應(yīng)之后，移至大田；其中所述混合育苗基質(zhì)的成分以體積比計(jì)為營養(yǎng)土蛭石=3:l，花盆高度為15cm，花盆中所放育苗基質(zhì)厚度為12cm。所述育苗基質(zhì)購于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。上述方法各步中采用的培養(yǎng)基及其配方如下(表1):表1小麥試管苗反復(fù)再生方法中各培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基名稱配方作用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基IMS基本成分+B5維生素+130170mg/L谷氨酰胺+180220mg/L水解酪蛋白+0.52mg/L2，4-D+68g/L瓊脂+2535g/L蔗糖，pH值5.75.9用于幼胚誘導(dǎo)愈傷組織胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS基本成分+B5維生素+130170mg/L谷氨酰胺+12mg/L2，4-D+68g/L瓊脂+2535g/L蔗糖，pH值5.75.9用于胚性愈傷組織繼代分化培養(yǎng)基IMS基本成分+B5維生素+130170mg/L谷氨酰胺+0.81.2mg/L6-BA+0.450.55mg/LIAA+57g/L瓊脂+1525g/L蔗糖，pH值5.65.8用于愈傷組織分化長苗6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，保持相對(duì)濕度在60%，經(jīng)6天的適應(yīng)之后，移至大田。本發(fā)明的技術(shù)方案是先通過幼胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織，然后通過胚性愈傷組織誘導(dǎo)分化獲得試管苗，再通過試管苗誘導(dǎo)愈傷組織并分化出二次再生苗，最后再把二次再生苗移栽獲得完整植株。經(jīng)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的頻率及二次再生苗的頻率分別達(dá)到了93%和66%以上，比之國內(nèi)外通過小麥種子苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的頻率72%(郝建國2003)及再生頻率11%(宣云2004)、加％(郝建國.加03)、36%(Kopertekh.加03)都有較大提高。反復(fù)再生體系是獲得葉綠體轉(zhuǎn)基因純合體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本發(fā)明所提供的小麥試管苗幼葉反復(fù)再生的方法成功解決了小麥試管苗反復(fù)再生難的問題，是國內(nèi)外首次通過小麥試管苗幼葉建立小麥試管苗反復(fù)再生體系，通過試管苗幼葉誘導(dǎo)愈傷組織并獲得了二次再生苗，使運(yùn)用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得同質(zhì)化的葉綠體轉(zhuǎn)基因小麥成為可能。圖1幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織。圖2愈傷組織分化的試管苗。圖3試管苗葉片誘導(dǎo)的愈傷組織。圖4試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的二次再生苗。圖5二次再生苗的移栽。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1取開花后14天的濟(jì)南177小麥未成熟麥穗，于體積比為75%酒精中浸5分鐘滅菌。將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚。選擇直徑lmm的幼胚，盾片向上接種于MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+20011^/1水解酪蛋白+lmg/L2，4-D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，25t:，黑暗培養(yǎng)。2周獲得胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到100%。將誘導(dǎo)的愈傷組織上從幼胚直接長出的胚芽切除，再把誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上(PH值5.8)，光照強(qiáng)度為60molm—2s—、光照時(shí)間12hd—、恒溫度25t:進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，3周繼代一次。將繼代一次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+lmg/L6-BA+O.5mg/LIAA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2周形成叢生試管苗，分化率達(dá)到98%。待培養(yǎng)的叢生試管苗長到4cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部2mm的葉段放至MS基本成分+B5維生素+150mg/LL_天冬酰胺+2mg/L2，4-D+lmg/LNAA+8g/L瓊脂9+30g/L蔗糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上(pH值5.8)，25°C，暗培養(yǎng)4周，在葉段的切口處形成4mm的愈傷組織團(tuán)，試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到97%。將試管苗葉片誘導(dǎo)形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+lmg/L6-BA+O.5mg/LIAA+10mg/LAgN03+lmg/LTIBA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基11上(pH值5.7)，光照強(qiáng)度為lOOiimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)3周誘導(dǎo)出二次再生的試管苗，試管苗葉片二次再生率達(dá)到72%。將二次再生苗轉(zhuǎn)至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分濃度減半)+MS維生素+0.2mg/LIAA+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上(pH值5.7)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)3周，獲得生根植株。將生根的二次再生試管苗移至2(TC溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗3天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，利用加濕器保持相對(duì)濕度在60%，經(jīng)6天的適應(yīng)之后，移至大田，成活率達(dá)95%。實(shí)施例2取開花后15天的中國春小麥未成熟麥穗，于75%酒精中浸3分鐘滅菌。將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚。選擇直徑0.8mm的幼胚，盾片向上接種于MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+180mg/L水解酪蛋白+0.5mg/L2，4-D+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，25t:，黑暗培養(yǎng)。2周獲得胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到99%。將誘導(dǎo)的愈傷組織上從幼胚直接長出的胚芽切除，再把誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+lmg/L2，4_D+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上(PH值5.8)，光照強(qiáng)度為60molm—2s—、光照時(shí)間12hd—、恒溫度25t:進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，2周繼代一次。將繼代一次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+0.8mg/L6-BA+O.45mg/LIAA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2周形成叢生試管苗，分化率達(dá)到91%。待培養(yǎng)的叢生試管苗長到2cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部lmm的葉段放至MS基本成分+B5維生素+130mg/LL_天冬酰胺+1.7mg/L2，4-D+O.5mg/LNAA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上(pH值5.8)，24°C，暗培養(yǎng)3周，在葉段的切口處形成3mm的愈傷組織團(tuán)，試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到90%。將試管苗葉片誘導(dǎo)形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+0.4mg/LTDZ+0.8mg/L6-BA+O.45mg/LIAA+5mg/LAgN03+0.5mg/LTIBA+5g/L瓊脂+15g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基II上(pH值5.7)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，4周誘導(dǎo)出二次再生的試管苗，試管苗葉片二次再生率達(dá)到66%。將二次再生苗轉(zhuǎn)至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分濃度減半)+MS維生素+0.lmg/LIAA+4g/L瓊脂+15g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上(pH值5.7)，光照強(qiáng)10度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25。C進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，4周獲得生根植株。將生根的二次再生試管苗移至2(TC溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗2天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，利用加濕器保持相對(duì)濕度在50%，經(jīng)5天的適應(yīng)之后，移至大田，成活率達(dá)90%。實(shí)施例3取開花后16天的核生3號(hào)小麥未成熟麥穗，于75%酒精中浸8分鐘滅菌。將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚。選擇直徑1.2mm的幼胚，盾片向上接種于MS基本成分+B5維生素+170mg/L谷氨酰胺+220mg/L水解酪蛋白+2mg/L2，4-D+8g/L瓊脂+35g/L蔗糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，25t:，黑暗培養(yǎng)。2周獲得胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到100%。將誘導(dǎo)的愈傷組織上從幼胚直接長出的胚芽切除，再把誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本成分+B5維生素+170mg/L谷氨酰胺+2mg/L2，4_D+8g/L瓊脂+35g/L蔗糖的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上(PH值5.8)，進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為60mol*m—2s一1，光照時(shí)間12hd—、晝溫度25°C，3周繼代一次。將繼代一次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+170mg/L谷氨酰胺+1.2mg/L6-BA+O.55mg/LIAA+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2周形成叢生試管苗，分化率達(dá)到95%。待培養(yǎng)的叢生試管苗長到5cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部3mm的葉段放至MS基本成分+B5維生素+170mg/LL-天冬酰胺+2.3mg/L2，4-D+l.5mg/LNAA+9g/L瓊脂+35g/L蔗糖的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上(pH值5.8)，25°C，暗培養(yǎng)4周，在葉段的切口處形成4mm的愈傷組織團(tuán)，試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到87%。將試管苗葉片誘導(dǎo)形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生+170mg/L谷氨酰胺+0.6mg/LTDZ+1.2mg/L6-BA+O.55mg/LIAA+15mg/LAgN03+l.5mg/LTIBA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基II上(pH值5.6)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25。C進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)3周，誘導(dǎo)出二次再生的試管苗，試管苗葉片二次再生率達(dá)到70%。將二次再生苗轉(zhuǎn)至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分濃度減半)+MS維生素+0.3mg/LIAA+5g/L瓊脂+25g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上(pH值5.7)，光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、恒溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)3周，獲得生根植株。將生根的二次再生試管苗移至2(TC溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗3天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，利用加濕器保持相對(duì)濕度在60%，經(jīng)7天的適應(yīng)之后，移至大田，成活率達(dá)97%。本發(fā)明方法實(shí)施中所用小麥濟(jì)南177、中國春、核生3號(hào)均購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，其中中國春小麥?zhǔn)菄H通用的實(shí)驗(yàn)用麥，濟(jì)南177和核生3號(hào)是山東省普遍種植的小麥品種。1權(quán)利要求一種小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，步驟包括(1)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)(3)試管苗的獲得(4)試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織(5)二次再生苗的誘導(dǎo)(6)誘導(dǎo)生根(7)二次再生苗的移栽；其特征在于步驟(1)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的方法是取開花后14～16天的小麥未成熟麥穗，于體積比為75％酒精中浸3～8分鐘滅菌；然后將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚；再挑選直徑0.8～1.2mm的幼胚，盾片向上接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，25±1℃，黑暗培養(yǎng)2～3周；獲得胚性愈傷組織；步驟(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法是取步驟(1)獲得的愈傷組織，先切除其上由幼胚長出的胚芽，再把愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，光照強(qiáng)度為55～65μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間10～14h·d-1，晝溫度25±1℃進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，2～3周繼代一次；步驟(3)試管苗獲得的方法是將步驟(2)所述繼代一次以上的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基I，光照強(qiáng)度為75～125μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14～18h·d-1，晝溫度25±1℃進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3周形成叢生試管苗；步驟(4)試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的方法是待步驟(3)培養(yǎng)的試管苗長到2～5cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部1～3mm的葉段放至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，25±1℃條件下暗培養(yǎng)3～4周，在葉段的切口處有3～4mm的愈傷組織團(tuán)形成；步驟(5)二次再生苗誘導(dǎo)的方法是將步驟(4)中誘導(dǎo)形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基II上，光照強(qiáng)度為75～125μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14～18h·d-1，晝溫度25±1℃進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)3～4周，誘導(dǎo)出二次再生的試管苗；步驟(6)誘導(dǎo)生根的方法是將步驟(5)中獲得的二次再生苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，光照強(qiáng)度為75～125μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14～18h·d-1，晝溫度25±1℃進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)3～4周，得生根植株；步驟(7)所述二次再生苗移栽的方法是將步驟(6)中生根的二次再生試管苗轉(zhuǎn)至20±1℃溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗2～4天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，相對(duì)濕度控制在50％～60％之間，經(jīng)4～7天的適應(yīng)，移至大田；其中上述混合育苗基質(zhì)的成分以體積比計(jì)為營養(yǎng)土∶蛭石＝3∶1，花盆高度為15cm，花盆中所放育苗基質(zhì)厚度為12cm；上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基II配方是MS基本成分+B5維生素+130～170mg/LL-天冬酰胺+1.7～2.3mg/L2，4-D+0.8～1.2mg/LNAA+7～9g/L瓊脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.7～5.9；上述分化培養(yǎng)基II配方是MS基本成分+B5維生素+130～170mg/L谷氨酰胺+0.4～0.6mg/LTDZ+0.8～1.2mg/L6-BA+0.45～0.55mg/LIAA+5～15mg/LAgNO3+0.5～1.5mg/LTIBA+5～7g/L瓊脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8；上述MS基本成分及B5維生素為2.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，其特征在于步驟(1)培養(yǎng)條件為25°C，黑暗培養(yǎng)2周；其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基I組成為MS基本成分+B5維生素+1461^/1谷氨酰胺+20011^/1水解酪蛋白+lmg/L2，4-D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。3.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，其特征在于步驟(2)培養(yǎng)條件為以光照強(qiáng)度為60iimo1m—2s—、光照時(shí)間12hd—、晝溫度25。C條件進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)，3周繼代一次；其中胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基組成為MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。4.如權(quán)利要求l所述的小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，其特征在于步驟(3)培養(yǎng)條件為以光照強(qiáng)度為lOOiimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、晝溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基I組成為MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+lmg/L6-BA+0.5mg/LIAA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.8。5.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，其特征在于步驟(4)培養(yǎng)條件為25t:，黑暗培養(yǎng)4周；其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基II組成為MS基本成分+B5維生素+150mg/LL-天冬酰胺+2mg/L2，4-D+lmg/LNAA+8g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。6.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，其特征在于步驟(5)培養(yǎng)條件為以光照強(qiáng)度為lOOiimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、晝溫度25。C進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基II組成為MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+lmg/L6-BA+0.5mg/LIAA+10mg/LAgN03+lmg/LTIBA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.7。7.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復(fù)再生方法，其特征在于步驟(6)培養(yǎng)條件為以光照強(qiáng)度為100iimolm—2s—、光照時(shí)間16hd—、晝溫度25"進(jìn)行晝夜光照周期培養(yǎng)3周；其中生根培養(yǎng)基組成優(yōu)選為1/2MS基本成分+MS維生素+0.2mg/LIAA+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.7;其中所述MS維生素配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>全文摘要本發(fā)明涉及一種通過小麥試管苗葉片的組織培養(yǎng)使小麥試管苗反復(fù)再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，其步驟包括(1)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)；(3)試管苗的獲得；(4)試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織；(5)二次再生苗的誘導(dǎo)；(6)誘導(dǎo)生根；(7)二次再生苗的移栽。本發(fā)明所提供的小麥試管苗幼葉反復(fù)再生的方法成功解決了小麥試管苗反復(fù)再生難的問題，是國內(nèi)外首次通過小麥試管苗幼葉建立起小麥試管苗反復(fù)再生體系，使運(yùn)用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得同質(zhì)化的葉綠體轉(zhuǎn)基因小麥成為可能。經(jīng)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)通過使用本方法試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的頻率及二次再生苗的頻率分別達(dá)到了93％和66％以上。文檔編號(hào)A01H4/00GK101699992SQ20091023081公開日2010年5月5日申請(qǐng)日期2009年11月25日優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日發(fā)明者侯丙凱,王文超,耿曉霞,胡洪群申請(qǐng)人:山東大學(xué)