專利名稱：小麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于糧食作物中的小麥細(xì)胞工程育種技術(shù)，進(jìn)一步涉及一種小麥 花藥一步成苗培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)侨祟愖钪匾募Z食作物之一。通過各種途徑進(jìn)行小麥遺傳改良是小麥優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)。上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的小麥單倍體育種 技術(shù)已成為現(xiàn)代重要的小麥生物技術(shù)育種方法之一，在小麥遺傳改良中發(fā)揮 著重要作用，并培育了一批小麥優(yōu)良品種，在小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)中發(fā)揮了重要 作用。目前，小麥單倍體育種一直使用多步成苗技術(shù)，即先在脫分化培養(yǎng)基 上離體培養(yǎng)小麥花藥組織誘導(dǎo)花粉細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織，再在再分化培 養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織分化成無根小苗，第三步將誘導(dǎo)的無根小苗轉(zhuǎn)入到生根 培養(yǎng)基上壯苗生根，這一花藥培養(yǎng)多步成苗技術(shù)存在著培養(yǎng)程序復(fù)雜、培養(yǎng) 周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、白化苗率高等問題，限制了這一技術(shù)的進(jìn)一推廣和應(yīng)用。 近年來，個(gè)別學(xué)者進(jìn)行了小麥花藥培養(yǎng)直接出苗研究，但結(jié)果很不理想，至 今還沒有建立完整的花藥培養(yǎng)一步成苗技術(shù)。發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種小 麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法，該方法將傳統(tǒng)的小麥花藥培養(yǎng)多步成苗簡(jiǎn)化為一 步成苗，以較大幅度的簡(jiǎn)化小麥花藥培養(yǎng)程序，縮短培養(yǎng)周期，降低培養(yǎng)成 本，減少白化苗率，提高花藥培養(yǎng)效率和單倍體育種效率。 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案 一種小麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法，其特征在于，包括下列步驟首先選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，于2 。C 4'C條件下低溫預(yù)處理2天；
低溫預(yù)處理后的小麥幼穗，經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在一步成 苗培養(yǎng)基上，于25。C 27。C條件下遮光培養(yǎng)；所述的一步成苗培養(yǎng)基采用 通用培養(yǎng)基Ww，并以通用培養(yǎng)基Ww為基礎(chǔ)，添加以下物質(zhì)
6 —呋喃基氨基嘌呤1.5mg/L， a—奈乙酸0.5mg/L，鹽酸硫胺素 8mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，谷氨酰胺5mg/L，蔗糖 60000mg/L;麥芽糖40000mg/L，瓊脂粉5000mg/L;調(diào)整一步成苗培養(yǎng)基 pH值為5.6;
待培養(yǎng)的花藥組織出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織時(shí)，置于1500Lx光照條件 下培養(yǎng)一周， 一周后，將光照強(qiáng)度增加到3000Lx 4000Lx，培養(yǎng)溫度為25 °C 27°C，連續(xù)培養(yǎng)兩周，即可產(chǎn)生根、苗健壯的花粉植株。
本發(fā)明的小麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的小麥花藥培養(yǎng)單倍體育 種技術(shù)相比，減少了花粉愈傷組織誘導(dǎo)不定芽和不定根兩個(gè)必須的技術(shù)操作 環(huán)節(jié)，培養(yǎng)成本降低了近50%，培養(yǎng)天數(shù)縮短了40 50天，綠苗平均誘導(dǎo) 率與多步成苗的綠苗平均誘導(dǎo)率相當(dāng)，達(dá)到5%左右，最高達(dá)到10%。白苗 率普遍降低10個(gè)百分點(diǎn)，且試管苗生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)，根莖連接部位很
少或無愈傷組織殘留，試管苗移栽成活率高。本發(fā)明總體提高了小麥花藥培 養(yǎng)效率和單倍體育種效率，大大降低了小麥花藥培養(yǎng)和單倍體育種成本和時(shí)間。


圖1是按照本發(fā)明的小麥花藥一步培養(yǎng)成苗方法得到的試管圖片，其中 (a)是2007年一步培養(yǎng)成苗的試管圖片，(b)是2008年一步培養(yǎng)成苗的 試管圖片。
以下結(jié)合發(fā)明人給出的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要通過對(duì)花藥培養(yǎng)基的改進(jìn)與使用，將小麥花粉細(xì)胞脫分化、 再分化及完整植株的形成過程在一步培養(yǎng)過程中完成，同時(shí)不降低或者還一 定程度的提高了培養(yǎng)效率。采用的主要技術(shù)手段和措施是
1) 選擇了無機(jī)鹽濃度低的通用Wi4培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。
2) 培養(yǎng)基中的滲透壓降低，蔗糖濃度由10%降到6%。
3) 添加了麥芽糖(促進(jìn)綠苗率，降低白苗率)；
4) 附加重要的有機(jī)物質(zhì)酪蛋白、生物素和谷氨酰胺，使鹽酸硫胺素(VJ 濃度增加到10mg/L。
5) 將誘導(dǎo)激素KT與NAA合理搭配。
6) 進(jìn)行了培養(yǎng)前花藥組織的低溫預(yù)處理(2'C 4'C放置2天)。
7) 培養(yǎng)過程光條件的調(diào)控由散射光到中等光照再到強(qiáng)光照。 本發(fā)明小麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法，包括下列步驟 選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，在2°C 4
"C條件下低溫預(yù)處理2天；
預(yù)處理后的小麥幼穗經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在一步成苗培養(yǎng) 基上，于25t: 27'C條件下遮光培養(yǎng)。
一步成苗培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基W"，以通用培養(yǎng)基WM為基準(zhǔn)，添加以 下物質(zhì)
6 —呋喃基氨基嘌呤(KT): 1.5mg/L， a—奈乙酸(NAA): 0.5mg/L，鹽 酸硫胺素(Vbl): 8mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，谷氨酰胺 5mg/L，蔗糖60000mg/L，麥芽糖40000mg/L，瓊脂粉5000mg/L。
調(diào)整一步成苗培養(yǎng)基的PH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌15分鐘 (1.0kg/cm2)。
通用培養(yǎng)基Wi4的配方為硝酸鉀(KN03): 2000mg/L，磷酸二氫(NH4H2P04): 380 mg/L，氯化鈣(CaCl2 *2H20): 140 mg/L，硫酸鎂(MgS04 '7H20): 200mg/L，硫酸鉀(K2S04): 700mg/L，硫酸亞鐵(FeS04 7H20): 27 . 8mg/L， 乙二酸四乙鈉(歸DTA): 37. 3mg/L，硫酸錳(MnS04 4H20): 8mg/L，硫酸 鋅(ZnS04 *7仏0): 3. Omg/L，硼酸(H3B03): 3. Omg/L，碘化鉀(KI): 0. 5mg/L， 鉬酸鈉(Na2Mo04* 2H20): 0. 005mg/L，硫酸銅(CuS04 5H20): 0. 025mg/L， 氯化鈷(CoCl2 6H20): 0. 025mg/L，鹽酸硫胺素2mg/L，鹽酸吡哆鋅0. 5mg/L， 煙酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。
待培養(yǎng)的花藥組織出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織時(shí)，置1500Lx光照條件下 培養(yǎng)一周， 一周后，將光照強(qiáng)度增加到3000Lx 4000Lx，培養(yǎng)溫度為25°C 27°C，連續(xù)培養(yǎng)兩周，即可產(chǎn)生根、苗健壯的花粉植株。
以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例-
利用本發(fā)明的小麥花藥培養(yǎng)一步成苗方法，發(fā)明人所在的小麥細(xì)胞工程 育種課題組于2007年接種培養(yǎng)共7個(gè)雜交組合約30000枚花藥，培養(yǎng)時(shí)間 50天，直接誘導(dǎo)生根完整綠苗1490株綠苗(圖la)，綠苗誘導(dǎo)率4.97%， 誘導(dǎo)白苗180株，白苗率0.6°%。
2008年接種培養(yǎng)共5個(gè)雜交組合約26000枚花藥，培養(yǎng)時(shí)間50天，直 接誘導(dǎo)生根完整綠苗1390株綠苗(圖lb)，綠苗誘導(dǎo)率5.35%，誘導(dǎo)白苗 193株，白苗率0.7%。培養(yǎng)試劑與傳統(tǒng)的方法相比，消耗減少近50%，培 養(yǎng)時(shí)間縮短45天左右，白苗率大大降低。
圖1是按照本發(fā)明的一步培養(yǎng)成苗方法得到的試管圖片，可以看出，試 管苗生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)，根莖連接部位很少或無愈傷組織殘留。
權(quán)利要求
1、一種小麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法，其特征在于，包括下列步驟首先選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，在2℃～4℃條件下低溫預(yù)處理2天；低溫預(yù)處理后的小麥幼穗，經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在一步成苗培養(yǎng)基上，于25℃～27℃條件下遮光培養(yǎng)；所述的一步成苗培養(yǎng)基采用通用培養(yǎng)基W14，并以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)6-呋喃基氨基嘌呤1.5mg/L，α-奈乙酸0.5mg/L，鹽酸硫胺素8mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，谷氨酰胺5mg/L，蔗糖60000mg/L；麥芽糖40000mg/L，瓊脂粉5000mg/L；調(diào)整一步成苗培養(yǎng)基pH值為5.6；待培養(yǎng)的花藥組織出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織時(shí)，置于1500Lx光照條件下培養(yǎng)一周，一周后，將光照強(qiáng)度增加到3000Lx～4000Lx，培養(yǎng)溫度為25℃～27℃，連續(xù)培養(yǎng)兩周，即可產(chǎn)生根、苗健壯的花粉植株。
2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的通用培養(yǎng)基Ww的配 方為硝酸鉀(跳):2000mg/L，磷酸二氫氨(NH4H2P04): 380mg/L，氯化 韓(CaCl2 '2H20): 140mg/L，硫酸鎂(MgS04 *7H20): 200mg/L，硫酸鉀(K2S04): 700mg/L，硫酸亞鐵(FeS04 7H20): 27. 8mg/L，乙二酸四乙鈉(Na2EDTA): 37. 3mg/L，硫酸錳(MnS04'訓(xùn)20): 8mg/L，硫酸鋅(ZnS04 7H20): 3.0mg/L， 硼酸(H3B03): 3.0mg/L，碘化鉀(KI): 0. 5mg/L，鉬酸鈉(歸。04 2H20): 0.005mg/L，硫酸銅(CuS04 5H20): 0.025mg/L，氯化鈷(CoCl2 6H20): 0.025mg/L，鹽酸硫胺素2mg/L，鹽酸吡哆鋅0. 5mg/L，煙酸0.5mg/L， 甘氨酸2mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥花藥一步成苗培養(yǎng)方法，選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，低溫(2℃～4℃)預(yù)處理2天；經(jīng)預(yù)處理的小麥幼穗，經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在一步成苗培養(yǎng)基上遮光培養(yǎng)；待培養(yǎng)的花藥組織出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織時(shí)，置于1500Lx光照條件下培養(yǎng)一周后，將光照強(qiáng)度增加到3000Lx～4000Lx，連續(xù)培養(yǎng)兩周，即可產(chǎn)生根、苗健壯的花粉植株。該方法減少了花粉愈傷組織誘導(dǎo)不定芽和不定根兩個(gè)必須的技術(shù)操作環(huán)節(jié)，培養(yǎng)成本降低了近50％，培養(yǎng)天數(shù)縮短了40～50天，綠苗平均誘導(dǎo)率與多步成苗的綠苗平均誘導(dǎo)率相當(dāng)，白苗率普遍降低10個(gè)百分點(diǎn)，且試管苗生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)，根莖連接部位很少或無愈傷組織殘留，試管苗移栽成活率高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101554136SQ20091002244
公開日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者任慧莉, 麗 劉, 呂瑞華, 李得孝, 李春蓮, 白延紅, 甘 胡, 郭東偉, 陳耀鋒 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)