專利名稱：擬微綠球藻及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種擬微綠球藻 (Nannochloropsis sp)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化石能源的大量使用，極大地加劇了大氣環(huán)境污染和氣候變化以及酸雨區(qū)面積的增大，尋找新的可持續(xù)的環(huán)境安全的生物資源來(lái)生產(chǎn)生物燃料以替代化石燃料勢(shì)在必行。 生物柴油(Biodiesel)又是用未加工過(guò)的或者使用過(guò)的植物油以及動(dòng)物脂肪通過(guò)不同的化學(xué)反應(yīng)制備出來(lái)的一種被認(rèn)為是環(huán)保的生物燃料。這種生物燃料可以像柴油一樣使用。 生物柴油是已得到證明的燃料，其在能源性質(zhì)方面可以部分替代化石柴油，是最具發(fā)展?jié)摿Φ囊后w生物燃料之一。微藻是一類在水中生長(zhǎng)的種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是有陽(yáng)光驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞工廠，通過(guò)微藻細(xì)胞高效的光合作用，吸收CO2,將光能轉(zhuǎn)化為脂肪或淀粉等化合物的化學(xué)能，并放出02。微藻是光合效率最高的微生物，也是自然界中生長(zhǎng)最為迅速的一種低等生物，而且某些微藻可以生長(zhǎng)在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進(jìn)行培養(yǎng)，還可利用工業(yè)廢氣中的co2。因此，微藻生物柴油成為了潛在的能源研究熱點(diǎn)。擬微綠球藻(Narmochloropsis sp)細(xì)胞個(gè)體較小，生長(zhǎng)速度快，可進(jìn)行超高密度培養(yǎng)。在誘導(dǎo)的條件下，擬微綠球藻細(xì)胞中會(huì)大量積累三脂酰甘油(TAG)，它是生物柴油生產(chǎn)的最好原料。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有較高不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素，特別是二十碳五烯酸(EPA)和獨(dú)特的堇菜黃素，EPA含量占細(xì)胞含量的4%左右，EPA具有抗血栓形成、調(diào)節(jié)血脂、抗凝血、擴(kuò)張血管、降血壓、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指標(biāo)最佳選擇。此外，擬微綠球藻被廣泛用作為許多水產(chǎn)品幼體的開口餌料或輪蟲的餌料。同時(shí)，擬微綠球藻可用作商業(yè)應(yīng)用的色素、二十碳五烯酸(EPA)和維生素E的生產(chǎn)藻株。魏東，張學(xué)成等在名稱為富含EPA的海洋微藻眼點(diǎn)擬微球藻的大規(guī)模培養(yǎng)(中國(guó)海洋藥物，2003，1 :5-10)的文獻(xiàn)中公開了一種眼點(diǎn)擬微綠球藻。該文獻(xiàn)中的眼點(diǎn)擬微綠球藻在1999年10月間在83. 5m2戶外池中大規(guī)模獲得生物量的平均面積產(chǎn)率為1. 09g/m2 ·(!。

發(fā)明內(nèi)容
由于現(xiàn)有技術(shù)中的微藻具有生長(zhǎng)速度慢、生物量低，總油脂含量低、或是EPA等長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸含量低等這些缺點(diǎn)，限制了微藻在產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供了一種新的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A，該藻株已于2011年8月17日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5148。本發(fā)明提供的擬微綠球藻(Narmochloropsis sp)ENN1003A的核苷酸序列包括序列1所示的核苷酸序列。序列1為
CCTACGGAAACCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGATGAGGTTTAGATAACTTCTCACGCTGCCGACCGAGGCCAGTGGCGCAATCCGAA
AGCTTCACCGAATCATTCAATCGGTAAGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAATGCGAGCTGATGACTCGCGTTTACTAGGAATTCCTCGTTCAAGATTAATAGTTGCAATAATCTATCCCTATCACGATGCGCATTTCAAGATTACCCGGTCCTTCCGGACAAGGTTATAAACTCGTTGAACGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGGACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCCCCAACTTCCTTCGGCCTAGCGCCGAAAGTCCCTCTAAGAAGTCTCTGGCAATGCTAAGCATTCCCAGTACTATTTAGCAGGCGGGGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAGTCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTAAGT
TTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAAGGTGCCGATGGGGCCTTACAATGCACCCACCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGATGGTATCTAATCATCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGTAAATGCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTCCATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACGAATACCCCCAACTATCCCTATTAATCATTACCTTGGCGTGCAAACCAACAAAATAGACCACCAAGGTCGTATCTTATTATTCCATGCTAATGTATTCAGGGCCTAAGCCTGCTTCGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGATAGGGATCCCGACCCC
AACAACTTAATGCCAGAATCGCTCTCCCCAAGGATGACAGGAACCAACAATAGTACGGCCCCTTATCGGAACCGACCAGCCGTCCCTGCCAGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAGTATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGATAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTGCCAGAGTTAAACCCCGGCATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTCTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCCAATTCTCCGTTACCCGTTAGAGCCATGGTAGGCCAATACCCTACCATCCAAAGCTGATAGGGCAGAAACTTGAATGATTCGTCGCTGGCGAAAGCCGGCGATCCGCAAAGTTATCA
TGATTCACCACAATACCGGGTTGCCCCGCATTGGTTTCTATCTAATAAATACATCCCGTCCGACAAGCAGTTGGGAGTTGATGCATGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCAAGTAGTAAAGGACTATCAAATAAACTATAACTGATATAATGAGCCATTCGCAGGTTCAGAGAAAACTCTTTATTCTCAGACGTGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCGTATGACTA本發(fā)明提供的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的核苷酸序列包括序列2所示的核苷酸序列。
序列2 為AAGGATCATTACCAAAACATTACATGCCTCCTGGCGTACGCTTCGAGGCATTACACTTCACAACCTGTGCATTGTTTACTCCTGTGAACGCTATACAAGCACGTGC TCCCGGCCACGCCCTGCGATGGTTGCTTTGGATGGTTCCTCGGAACACGTCGAAGCCGTGGCCGAATGTGGGAGGGC GTCTCTAAATATCCTCAAACACCATTCGCAACATTTTATCAACCTTTCCAAACCGATTGTTTATACCTCATTCAAGG CTTTTCTAGTCTTCCGACAGAAAAGCCTGGTGCATGTTTCCATGCGAAACGAGCGCCCGCAATGAAAATACAACTTT CAGCAACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCC GCGAGTCATCAAACCTTTGAACGCACCTTGCGCTTTCGGGATATGCCCGTTAGCATGTTTGTTGGAGTGTCTGTTAA CCCCAATCACCACCTTGTTGTGACTTCAGAGTCATGCCAAGCAGTCGGTGGACGTTACTTGCTCCCGATACTTCGCC CGCTGCGAATTCTGTTGTCACCTCCTCTGACGAGGAACTGGCCAGAAGCTGGAGTGCGGGCGTGGAGTGAAGTAGGG CCGGCCACATACAGTCACTGGGACCACGCAACTCCTAGAGCTGCCCCCGTGAACGTGACGAGTCTTCTAATCAAGGC AATCCGTTTGCGGTCTAAAAGGTGCTCGTTTAACGGAAGCGCTAGTCTACACCAAACAGTTTCGACTTGGCGGCATC TTCTCGGTGACTTTTAACAAACACCGAGAAAGCCTTTGGACTGATCCTGGCACTCGTTGCCGTGTCATTCCATCTCC AATTCGGACCTCCAATCAAGCAAGGCTACCCGCTGAATTTAA。本發(fā)明提供的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的形態(tài)特征為細(xì)胞大小為2 5 μ m ；細(xì)胞形狀為球形或近球形；細(xì)胞顏色為綠色或黃綠色；細(xì)胞分裂形成兩個(gè)似親孢子；細(xì)胞內(nèi)有紅色眼點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp) ENN1003A在培養(yǎng)16天時(shí)干重達(dá)到9g/L ；該微藻的藻粉的總脂含量為藻粉干重的45. 9% (重量百分比)。本發(fā)明還提供了擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的以下用途在制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物或保健品方面的應(yīng)用；在食品方面的應(yīng)用；在生產(chǎn)生物燃料尤其是生物柴油中的應(yīng)用；在廢水處理、廢氣處理、CO2減排方面的應(yīng)用；在生產(chǎn)色素、 水產(chǎn)品餌料、動(dòng)物飼料、化妝品方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)自然界藻種分離純化及篩選，獲得一株性能良好的擬微綠球藻藻株。由于本發(fā)明提供的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp) ENN1003A在培養(yǎng)16天時(shí)干重可達(dá)到9g/L，10月間戶外池中培養(yǎng)平均面積產(chǎn)率可達(dá)5 8g/m2 -d,因此具有生物量高、 生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)密度高的優(yōu)勢(shì)，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。而且本發(fā)明提供的藻株的總油脂含量可達(dá)60% (重量百分比)，具有油脂含量高的特性，特別適合生物柴油的生產(chǎn)。本發(fā)明提供的藻株中的EPA含量為藻粉干重的3% 7. 5% (重量百分比)；花生四烯酸含量為藻粉干重的0.7% 3. 5% (重量百分比)，EPA具有抗血栓形成、調(diào)節(jié)血脂、 抗凝血、擴(kuò)張血管、降血壓、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指標(biāo)最佳選擇，花生四烯酸具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液粘度，調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能等一系列生理活性，對(duì)預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效，因此本發(fā)明提供的藻株可以用于開發(fā)用于預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物、保健品和食品。本發(fā)明提供的藻株中的蛋白質(zhì)含量為藻粉干重的10 30% (重量百分比)，總油脂含量為藻粉干重的10 60% (重量百分比)，是做營(yíng)養(yǎng)品的最佳原料來(lái)源。本發(fā)明提供的藻株作為生長(zhǎng)迅速、富含EPA的擬微綠球藻可被廣泛用作為許多水產(chǎn)品幼體的開口餌料或輪蟲的餌料。此外，其富含蛋白質(zhì)、各種不飽和脂肪酸和必須氨基酸，可用于開發(fā)生產(chǎn)動(dòng)物飼料。


圖1為擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的顯微鏡檢圖片。圖2為不同藻株18S序列進(jìn)化樹。以萊茵衣藻，三角褐指藻，梅氏小環(huán)藻和部分?jǐn)M微綠球藻(Nannochloropsis)的18S序列為基礎(chǔ)，使用鄰接法(Neighbor-Joining)制作進(jìn)化樹。圖3示出不同藻株ITS序列進(jìn)化樹，以萊茵衣藻，三角褐指藻，梅氏小環(huán)藻和部分?jǐn)M微綠球藻(Nannochloropsis)的ITS序列為基礎(chǔ)，使用Neighbor-Joining法制作進(jìn)化樹。圖4為Blast獲得的部分?jǐn)M微綠球藻(Nannochloropsis)藻株ITS序列進(jìn)化樹， 使用 Neighbor-Joining 法制作。圖 5 示出 ENN1003A 與 UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的 OD75tl (Optical Density，在750nm處的吸光度)值變化曲線。圖 6 示出 ENN1003A 與 UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的葉綠素 a 含量變化曲線。圖 7 示出 ENN1003A與UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的干重變化曲線。圖 8 示出 ENN1003A與UTEX LB2164 (Nannochloropsis oculata)的油脂含量變化。圖9為不同水源ENN1003A生物量變化圖。圖10為不同氣源ENN1003A干重變化曲線圖。圖11為不同氣源ENN1003A0D75Q值變化曲線圖。圖12示出不同水源和氣源對(duì)ENN1003A油脂累積的影響。圖13示出不同水源和氣源對(duì)ENN1003AEPA含量的影響。
具體實(shí)施例方式下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，這僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1藻種分離、純化、篩選在青島石老人附近海域取水樣。向水樣中加1/3體積的海水培養(yǎng)基，在25°C、光照強(qiáng)度為50ymOl/m2 · s的條件下培養(yǎng)10天左右，取該水樣于顯微鏡下觀察，判斷水樣中存在的主要物種。調(diào)整細(xì)胞濃度約為1000個(gè)/ml，取100μ 1水樣鋪于海水培養(yǎng)基的固體瓊脂板上，在25°C、光照強(qiáng)度為50ymOl/m2 · s左右的條件下培養(yǎng)兩周左右，即可看到單藻落長(zhǎng)出，用接種環(huán)或無(wú)菌牙簽挑取藻落接種于表1示出的海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)。表1海水培養(yǎng)基配方
" 3 克/升
NaCl27.0
權(quán)利要求
1.一種保藏號(hào)為 CGMCC No. 5148 的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其核苷酸序列包括序列1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其核苷酸序列包括序列2所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其細(xì)胞大小為 2 6μπι ；細(xì)胞形狀為球形或近球形；細(xì)胞顏色為綠色或黃綠色；細(xì)胞內(nèi)有紅色色素點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的總油脂含量為藻粉干重的10% 60%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的EPA 含量為藻粉干重的3% 7.5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的花生四烯酸含量為藻粉干重的0. 7% 3. 5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A，其藻粉的蛋白質(zhì)含量為藻粉干重的10 30%。
9.權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp) ENN1003A在制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物或保健品方面的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A在生產(chǎn)或制備食品方面的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A在生產(chǎn)生物燃料中的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中所述生物燃料為生物柴油。
13.權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp) ENN1003A在廢水處理、廢氣處理、(X)2減排方面的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1所述的擬微綠球藻(Nannochloropsissp) ENN1003A在生產(chǎn)色素、水產(chǎn)品餌料、動(dòng)物飼料、化妝品方面的應(yīng)用。
全文摘要
一種保藏號(hào)為CGMCC No.5148的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A。本發(fā)明提供的擬微綠球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A具有生物量高的特性，該藻株具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)密度高的優(yōu)勢(shì)，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。而且本發(fā)明提供的藻株由于油脂含量高而特別適合生物柴油的生產(chǎn)。本發(fā)明提供的藻株富含EPA等長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸并且蛋白質(zhì)脂肪含量總和達(dá)到60％以上，適合用于保健品、醫(yī)藥品、食品的開發(fā)。
文檔編號(hào)A23L1/30GK102492626SQ201110425210
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者吳洪, 尹順吉, 張成武, 王冰, 陳傳紅, 馬建源 申請(qǐng)人:新奧科技發(fā)展有限公司