專利名稱：靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鎖核酸脫氧核酶，尤其涉及一種能夠靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶，同時涉及該鎖核酸脫氧核酶在靶向治療普通和耐藥結(jié)核桿菌引起的感染、特別是L型耐藥結(jié)核桿菌引起的潛伏和持留感染領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病位居單一病原引起病人死亡的嚴重傳染病之首，每年有200多萬人死于結(jié)核病，有近870萬病例新發(fā)。過去十年以來，結(jié)核病發(fā)病率一直在持續(xù)增加，但是最近40年中沒有任何特異性抗結(jié)核藥物研發(fā)出來。尤其值得指出的是，目前全球至少有5000萬人已感染了耐多藥結(jié)核(multidrug-resistant TB，MDR)。在各種原因?qū)е碌?如艾滋病、衰老、腫瘤等)免疫低下人群中形勢更為嚴峻，據(jù)統(tǒng)計在艾滋病患者中每年有50萬人死于繼發(fā)的結(jié)核病。我國屬結(jié)核病高流行區(qū)，總數(shù)居全球第二。當前結(jié)核病已經(jīng)取代狂犬病成為我國傳染病中的第一位死因。目前困擾結(jié)核病防治工作的突出問題:·
第一，大量潛伏感染病例的存在。全球有20億人存在結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)的潛伏感染,通常一部分活菌會在宿主體內(nèi)持續(xù)終生并隨時可能活化增殖，要想從根本上根治結(jié)核病，就必須解決這一問題，然而要對潛伏感染進行及時有效的治療十分困難；第二，多耐菌株的流行。據(jù)統(tǒng)計全球每年至少有27.3萬耐藥結(jié)核新發(fā)病例，有10%左右的新發(fā)結(jié)核病例攜有MDR株(國內(nèi)某些省份統(tǒng)計達到11%)，而在曾經(jīng)治療過的病人中高達25%，其中藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的L型(L-form)細菌的耐藥問題更為突出；第三，再燃與復(fù)發(fā)。Mtb是一種古老的胞內(nèi)寄生菌，已經(jīng)進化出了真核生物樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，能夠調(diào)控宿主細胞的轉(zhuǎn)運通路，以利于其在細胞內(nèi)的存活；感染人體后寄生在單核/巨噬細胞內(nèi)并通過抑制吞噬體-溶酶體融合、抑制吞噬體酸化、抵抗超氧離子及活性氮介質(zhì)的殺傷、形成L型等機制在胞內(nèi)長期持留。體內(nèi)持留狀態(tài)的Mtb具有活化潛能并可伺機四處播散。由于傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物主要通過干擾細菌DNA或細胞壁的合成在細菌繁殖階段發(fā)揮作用，對內(nèi)增殖緩慢的持留菌無作用，這使得抗癆治療時間延長。Mtb的胞內(nèi)持留既是潛伏感染形成的基礎(chǔ)，也是參與多耐菌株產(chǎn)生以及導(dǎo)致治療后再燃和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素；第四，防治效果的差異。結(jié)核感染后的轉(zhuǎn)歸取決于環(huán)境、結(jié)核菌和宿主間的相互作用，宿主的免疫素質(zhì)和免疫狀態(tài)是決定感染后轉(zhuǎn)歸的重要因素。同一標準治療方案在不同免疫背景人群中的反應(yīng)千差萬別。研究開發(fā)更為行之有效的結(jié)核病預(yù)防與治療措施已成為當務(wù)之急。顯然，單純依賴經(jīng)典的化療方案并不能解決以上問題，因此致力于開拓覆蓋藥物治療、免疫治療、基因治療等措施，以對結(jié)核病進行全面、綜合治療的新領(lǐng)域?qū)⒕哂辛己们熬?。WHO在90年代就提出了結(jié)核病藥物治療應(yīng)與免疫治療相結(jié)合的綜合治療新理念。在體內(nèi)免疫壓力環(huán)境中，或通過某些治療藥物的誘導(dǎo)作用，結(jié)核病患者體內(nèi)有部分Mtb形成L型菌或稱細胞壁缺陷型菌(cel 1-wall deficient forms, CWDF)并在體內(nèi)長期存活和持留。MtbL型的形成，與結(jié)核病的久治不愈，再燃和復(fù)發(fā)，肺外播散，多藥耐藥等現(xiàn)象的形成密切相關(guān)。利用傳統(tǒng)的細菌學(xué)技術(shù)所作的大樣本研究表明=MtbL型在活動性結(jié)核和非活動性結(jié)核患者樣本中都可以大量檢出，在實際臨床各期結(jié)核中，正常形態(tài)的Mtb與L型實際上是同時并存的，在結(jié)核病患者體內(nèi)存在著各種處于不同代謝狀態(tài)的Mtb。臨床藥物治療時，結(jié)核病患者體內(nèi)大部分的Mtb可在1-2周內(nèi)被抗結(jié)核藥物殺滅，但是為了殺滅殘留的細胞內(nèi)持留菌仍需維持化療5個月以上。而如果形成了 L型Mtb的感染，傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物將不起作用。那么常規(guī)抗結(jié)核藥物的治療程序就值得推敲。Mtb形成L型之后，對常規(guī)的抗結(jié)核藥物將產(chǎn)生抗性，菌體形態(tài)因細胞壁缺損也表現(xiàn)為多形性。然而正是因為缺少了細胞壁屏障，對一些特殊基因藥物如鎖核酸脫氧核酶而言，反而更加有利于其進入細菌體內(nèi)對靶分子進行切割。RelA是一種Mtb調(diào)節(jié)蛋白。Mtb要在Μφ內(nèi)持留，就必須承受細胞內(nèi)殺菌成分對其造成的巨大生存壓力。在漫長的進化過程中，Mtb發(fā)展出獨特的信號傳遞系統(tǒng)，以保證其在不同的感染周期中啟動不同的反應(yīng)元件，調(diào)節(jié)基因的表達來適應(yīng)環(huán)境。在眾多壓力反應(yīng)(stringent response)調(diào)節(jié)元件中，RelA起著十分關(guān)鍵的作用。在不利條件下,它可以催化GTP過磷酸化為(p)ppGpp。(p)ppGpp是Mtb的一種信號分子,它作為RNA聚合酶的配體與其β亞單位結(jié)合后，可轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)一系列后續(xù)的連鎖反應(yīng)；同時它也影響細菌σ因子與RNA聚合酶的結(jié)合。研究認為，細菌對環(huán)境壓力的抵抗與耐受是RelA依賴性的，產(chǎn)生的(ρ)PPGpp信號可分別介導(dǎo)細菌對抗生素的抵抗、耐紫外線存活、損傷DNA的修復(fù)等。滅活RelA的Mtb在壓力環(huán)境下不能夠長期存活。多種與細菌細胞內(nèi)持留有關(guān)的物質(zhì)及細菌毒力因子基因的表達都與(P)PPGpp水平有關(guān)，包括影響細菌細胞壁合成、蛋白質(zhì)分泌、哺乳動物細胞進入蛋白(mce)的產(chǎn)生等。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，RelA是抗結(jié)核持續(xù)感染的較好靶點之一。值得指出的是，長期持留菌與Mtb活性繁殖體之間在形態(tài)與染色性上存在差異，從肺部分離的持留菌的多形性和染色性與細菌壓力條件下特別是營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的表現(xiàn)極為相近，這與RelA的啟動條件完全一致；另有研究表明，RelA與分枝桿菌細胞壁改變引起的細菌形態(tài)、菌落形成等密切相關(guān)，這對于L型細胞壁缺陷型Mtb的形成是十分重要的，因此在本研究中，選擇切割其mRNA作為阻斷L型Mtb細胞內(nèi)持留的關(guān)鍵靶位。雖然全球每年有800多萬人感染了 Mtb，但其中只有10%發(fā)展成為結(jié)核病。這是由于感染人群對Mtb抵抗力的遺傳差異，特別是介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)的、抗細胞內(nèi)病原體的基因差異造成的。機體的固有免疫反應(yīng)不僅是感染初期最早和最重要的防線，而且在決定疾病的轉(zhuǎn)歸、徹底殺滅胞內(nèi)菌，尤其是L型Mtb引起的細胞內(nèi)潛伏感染中，也具有無可替代的關(guān)鍵作用。有效的抗結(jié)核免疫保護反應(yīng)依賴于IFN-Y和TNF-α等免疫介質(zhì)對Μφ的激活，
IFN- Y通過激活感染的ΜΦ誘導(dǎo)產(chǎn)生N0S2、LRG-47等機制直接阻斷Mtb的繁殖；而IFN- Y主要是由NK細胞和IL-12、IL-18等Thl型細胞因子激活的T細胞分泌的；這些Thl型細胞因子最初又是由Mtb激活Toll樣受體后的樹突狀細胞和Μφ產(chǎn)生的，與此同時Toll樣受體(Toll like re ceptor, TLR)激活后也誘導(dǎo)TNF-a、IL-1 β、趨化因子、防御素等前炎性細胞因子的生成，并通過一系列后續(xù)免疫反應(yīng)，建立獲得性免疫，從而使90%以上的感染者得到保護。Mtb包含豐富的脂類抗原，此類抗原能夠通過CDl分子呈遞給CDl限制性T細胞并誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性免疫。同時還可激活免疫細胞的Toll受體，誘導(dǎo)產(chǎn)生白細胞介素12(IL-12);而IL-12的產(chǎn)生在控制胞內(nèi)菌感染中處于上游關(guān)鍵地位，IL-12受體缺陷病人由于缺乏IL-12依賴的IFN-Y的分泌而導(dǎo)致嚴重的分枝桿菌感染，這種依賴Toll樣受體激活模式的固有免疫反應(yīng)在機體抗結(jié)核感染過程中，尤其是在殺滅細胞內(nèi)潛伏的Mtb時所起的作用是十分高效和重要的。Toll樣受體是一種模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs),目前至少包含13種受體，其中與介導(dǎo)病原體感染免疫反應(yīng)密切相關(guān)的主要有TLR2(識別細菌脂蛋白，脂肽)、TLR4 (識別LPS )、TLR9 (識別細菌CpG基序)、TLR7 (識別RNA基序)、TLR8 (識別RNA基序)，其中TLR2、TLR4、TLR8、TLR9都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與機體抗結(jié)核保護性免疫反應(yīng)有關(guān)。在固有免疫反應(yīng)中，激活Toll樣受體可產(chǎn)生胞內(nèi)病原體的直接殺傷活性，在小鼠中主要是通過NO途徑，在人類TLR激活后可導(dǎo)致Μφ的維生素D受體等基因表達上調(diào)，介導(dǎo)產(chǎn)生一種具有直接殺傷Mtb的抗菌肽“cathelicidin”,從而影響人群對Mtb感染的敏感性；另一方面，實驗表明Toll樣受體激活產(chǎn)生的抗微生物活性如果受到抑制，就會導(dǎo)致宿主固有免疫反應(yīng)的抑制，從而引起感染的擴散。但是，TLR2激活途徑在介導(dǎo)機體抗結(jié)核免疫時仍然在一定程度上存在著漏洞[32]。最新研究表明，TLR7主要識別RNA基序，多種病毒的RNA基序具有TLR7激活功能，這些RNA可以是單鏈構(gòu)象的，也可以是雙鏈構(gòu)象的。值得指出的是，TLR7的激活在介導(dǎo)免疫細胞的“自噬作用”(Autophagy)中效能最強。而“自噬作
用”是新近才認識到的一種固有免疫防御機制，它能夠打破Μφ內(nèi)潛伏的Mtb對吞噬溶酶體成熟過程的阻抑，在清除細胞內(nèi)感染中具有重要意義。有趣的是:利用配體激活TLR7后，刺激細胞產(chǎn)生“自噬作用”可以有效消除胞內(nèi)菌，即使該細菌通常與TLR7不相關(guān)聯(lián)。這為通過此途徑治療細胞內(nèi)病原體感染提供了契機。人們對核酸功能的理解目前已經(jīng)不再局限于遺傳信息攜帶和功能研究領(lǐng)域。核酶(Ribozyme)的發(fā)現(xiàn)使人們首次認識到核酸也可具有酶的催化功能。1997年，Santro和Joyce通過體外分子進化技術(shù)(SELEX技術(shù))篩選發(fā)現(xiàn)一種能專一識別并催化切割RNA的寡脫氧核苷酸分子，稱為脫氧核酶。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了幾十種脫氧核酶，至少能催化7種化學(xué)反應(yīng)。其中一種具有10-23基序(10-23motif)的脫氧核酶(10_23DNAzymeorl0-23deoxyribozyme)被認為最具應(yīng)用潛力。它是在模擬生理濃度下能切割所有RNA的Mg2+依賴型DNAzyme, 10-23脫氧核酶由15個脫氧核苷酸構(gòu)成保守的活性中心域,兩側(cè)分別連有一條由7 10個脫氧核苷酸構(gòu)成的底物結(jié)合臂。通過兩邊的底物結(jié)合臂與靶RNA特異性結(jié)合后，10-23DNAzyme能高效、特異地對靶mRNA進行切割，其切割的靶位為“5 ’ -R丨Y-3 ’ ”序列(R=A / G, Y=U / C;丨為切割部位)。該切割位點在幾乎所有的mRNA分子中普遍存在(包括所有mRNA的翻譯起始密碼子“AUG”序列)。由于具有較高的切割特異性、切割效率和穩(wěn)定性，10-23DNAzyme較反義核酸及核酶更為優(yōu)越，自被發(fā)現(xiàn)以來，特別是作為基因表達抑制劑在基因治療方面，已被成功地用于病毒感染、腫瘤、心血管等疾病的基因治療，且在細胞和動物實驗水平都取得了很好的效果，對靶RNA的切割效率最高可達90%以上?！禨cience》等雜 志評論認為10-23DNAzyme會在不久的將來走向臨床，為眾多疾病的治療提供嶄新的手段。
雖然與反義RNA、核酶等RNA類藥物相比，10-23DNAzyme具有較好的穩(wěn)定性，但化學(xué)合成的10-23DNAzyme仍面臨半衰期不夠長，容易受DNA酶降解等問題；而且10-23DNAzyme在針對耐藥結(jié)核桿菌，特別是L型結(jié)核分枝桿菌時，存在功能單一的局限，因此需要在此方面需求新的突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶及其應(yīng)用，從而消除上述背景技術(shù)中缺陷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶，其核苷酸序列為 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 中的一種。其中，
權(quán)利要求
1.靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3中的一種。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶在治療L型結(jié)核分枝桿菌引起的潛伏感染的藥物中的用途。
3.如權(quán)利 要求2所述的靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶在治療L型結(jié)核分枝桿菌引起的潛伏感染的藥物中的用途，其特征在于:核苷酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 及 SEQ ID NO:3 中的至少兩種聯(lián)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一種，本發(fā)明同時公開了靶向治療結(jié)核的RelA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶在治療L型結(jié)核分枝桿菌引起的潛伏感染的藥物中的用途。本發(fā)明綜合了基因治療與免疫治療效果的優(yōu)勢，專門針對體內(nèi)感染的耐藥結(jié)核桿菌，特別是L型結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮治療作用。
文檔編號A61K48/00GK103243098SQ201310157280
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者付玉榮, 伊正, 伊星昊, 伊鑫 申請人:付玉榮