本發(fā)明涉及抑制黑色素生成的酪氨酸酶阻礙劑、美白劑等。

背景技術(shù)：
已知酪氨酸酶是參與黑色素的生物合成的酶。在黑色素生成過程中，酪氨酸酶催化從酪氨酸到L-DOPA（3,4-二羥基-L-苯丙氨酸）的羥基化反應(yīng)、以及從L-DOPA到多巴醌（Dopaquinone）的氧化反應(yīng)，對(duì)在生物體內(nèi)從酪氨酸開始的黑色素的生物合成產(chǎn)生直接影響（Int.J.Mol.Sci.2009,10,2440-2475）。經(jīng)過這樣的過程生成的黑色素，能發(fā)揮防止生物體內(nèi)由于紫外線造成的體細(xì)胞的損傷的作用。另一方面，還已知過剩的黑色素生成會(huì)導(dǎo)致皮膚的變黑或者由色素沉淀造成的色素斑或雀斑，不僅在美容上而且從健康的方面都被視為問題。因此，一直以來為了抑制過剩的黑色素生成，提出控制酪氨酸酶活性，并進(jìn)行阻礙酪氨酸酶活性的物質(zhì)的探索。例如已知有維生素C、熊果苷、曲酸等作為阻礙酪氨酸酶活性的物質(zhì)。另一方面，異丙基甲基酚（別名：對(duì)-百里酚（p-thymol））具有殺菌力、抗菌性，作用于皮脂上容易增殖的細(xì)菌，因此，一直作為殺菌劑在化妝品或者醫(yī)藥品等中以0.05～0.10質(zhì)量%（500～1000ppm）的濃度配合。雖然報(bào)告有作為異丙基甲基酚的空間異構(gòu)體的百里酚（thymol）和香芹酚（Carvacrol）中具有對(duì)來自蘑菇的酪氨酸酶的阻礙活性以及在小鼠黑素瘤B-16細(xì)胞中具有黑色素生成抑制作用（特開平9-249544號(hào)公報(bào)），但是至今沒有報(bào)告其對(duì)來自人的酪氨酸酶的阻礙活性，對(duì)于異丙基甲基酚，至今完全沒有報(bào)告其具有酪氨酸酶阻礙活性或者黑色素生成抑制作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及以下的（1）～（10）。（1）一種酪氨酸酶阻礙劑，其中，以異丙基甲基酚為有效成分。（2）一種黑色素生成抑制劑，其中，以異丙基甲基酚為有效成分。（3）一種美白劑，其中，以異丙基甲基酚為有效成分。（4）一種化妝品，其中，以0.00001w/v%以上0.04w/v%以下的濃度含有異丙基甲基酚。（5）一種異丙基甲基酚在用于制造酪氨酸酶阻礙劑中的用途。（6）一種異丙基甲基酚在用于制造黑色素生成抑制劑中的用途。（7）一種異丙基甲基酚在用于制造美白劑中的用途。（8）一種酪氨酸酶阻礙方法，其中，將異丙基甲基酚進(jìn)行給藥或攝取。（9）一種黑色素生成抑制方法，其中，將異丙基甲基酚進(jìn)行給藥或攝取。（10）一種美白方法，其中，將異丙基甲基酚進(jìn)行給藥或攝取。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及提供具有優(yōu)異的酪氨酸酶活性阻礙作用并且安全性高的酪氨酸酶活性阻礙劑、黑色素生成抑制劑、美白劑以及化妝品。本發(fā)明者等鑒于上述技術(shù)問題進(jìn)行研究的結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，作為殺菌劑而配合至化妝品等中的異丙基甲基酚具有優(yōu)異的來自人的酪氨酸酶活性阻礙作用，而且在比作為現(xiàn)有的殺菌劑而發(fā)揮效果的濃度低的濃度下也具有這樣的作用。根據(jù)本發(fā)明的酪氨酸酶阻礙劑、黑色素生成抑制劑、美白劑以及化妝品，可以抑制皮膚中黑色素的過量生成，預(yù)防或者改善日曬之后的色素沉淀或者色素斑或雀斑。在本發(fā)明中，“酪氨酸酶阻礙”是指阻礙酪氨酸酶的活性。在此，酪氨酸酶是參與哺乳類中黑色素生成的關(guān)鍵反應(yīng)、果實(shí)或者菌類中酶的褐色化的關(guān)鍵反應(yīng)的酶，本發(fā)明中其種類不特別限定，優(yōu)選為來自哺乳類的酪氨酸酶，更加優(yōu)選為人酪氨酸酶。另外，在酪氨酸酶活性中，包括例如將酪氨酸轉(zhuǎn)化為二羥基苯丙氨酸（DOPA）的情況、以及將DOPA轉(zhuǎn)化為多巴醌的情況。在本發(fā)明中，“美白（作用）”是指抑制黑色素色素的生成，恢復(fù)到?jīng)]有多余的黑色素的本來膚色，或者防止、抑制皮膚的黑化或者色素斑或雀斑等的色素沉淀。在本發(fā)明中使用的異丙基甲基酚只要是能在化妝品、醫(yī)藥品、準(zhǔn)醫(yī)藥品等中使用的異丙基甲基酚就不特別限定。這樣的異丙基甲基酚可以通過公知的方法（例如，DE102007035515號(hào)說明書）來化學(xué)合成，也可以使用市售品。如后述實(shí)施例所示，異丙基甲基酚對(duì)人酪氨酸酶（來自新生兒表皮的黑色素細(xì)胞提取物）阻礙酪氨酸酶活性（多巴氧化酶（Dopaoxidase）活性）（實(shí)施例1）。確認(rèn)了這樣的酪氨酸酶活性阻礙作用在使用來自人新生兒表皮的黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)體系中也同樣（實(shí)施例2）。如前面所述，由于酪氨酸酶是參與黑色素生物合成的酶（上述Int.J.Mol.Sci.2009,10,2440-2475），因此，可以說異丙基甲基酚通過阻礙酪氨酸酶活性來抑制黑色素生成，發(fā)揮美白作用。在此，該酪氨酸酶活性阻礙作用是在比作為殺菌劑使用的情況下規(guī)定的異丙基甲基酚濃度（500～1000ppm）低的濃度下得到確認(rèn)，其程度比公知作為酪氨酸酶活性阻礙劑而公知的曲酸高。因此，異丙基甲基酚可以在低用量下在用于酪氨酸酶阻礙、或者用于抑制黑色素生成、或者用于美白中使用。另外，該用途可以是在人或者非人動(dòng)物上的用途，另外既可以是治療性用途，也可以是非治療性用途。另外，異丙基甲基酚可以作為酪氨酸酶阻礙劑、黑色素生成抑制劑、美白劑（以下，稱為酪氨酸酶阻礙劑等）使用，進(jìn)一步也可以在用于制造這些制劑中使用。此時(shí)，在該酪氨酸酶阻礙劑等中，可以單獨(dú)使用異丙基甲基酚，或者也可以另外根據(jù)需要使用經(jīng)過適當(dāng)選擇的制劑載體等允許的物質(zhì)。該酪氨酸酶阻礙劑等其本身發(fā)揮酪氨酸酶阻礙、黑色素生成抑制、美白的各效果，既可以是化妝品、準(zhǔn)醫(yī)藥品或者醫(yī)藥品，也可以是配合在該化妝品等中使用的原料或者制劑。另外，酪氨酸酶阻礙劑等可以作為以酪氨酸酶阻礙、黑色素生成抑制或者美白為概念、并且根據(jù)需要表達(dá)該宗旨的化妝品或者準(zhǔn)醫(yī)藥品來使用。上述醫(yī)藥品（也包括準(zhǔn)醫(yī)藥品）可以以任意的給藥方式進(jìn)行給藥。作為給藥形態(tài)，例如可以為通過栓劑、吸入藥、經(jīng)皮吸收劑、外用劑（化妝水（lotion）、乳液、凝膠、乳霜、軟膏等）等的非經(jīng)口給藥；或者通過片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等的經(jīng)口給藥的任意形態(tài)，優(yōu)選為非經(jīng)口給藥，進(jìn)一步優(yōu)選為外用給藥。在調(diào)制這樣的各種劑型的醫(yī)藥制劑中，可以單獨(dú)使用異丙基甲基酚，或者適當(dāng)組合其它藥學(xué)上允許的賦形劑、粘合劑、增量劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、分散劑、緩沖劑、防腐劑、矯味劑、香料、成膜劑（filmformingagent）、載體、稀釋劑等來使用。上述化妝品（也包含準(zhǔn)醫(yī)藥品）的形態(tài)，可以制成皮膚外用劑、清潔劑、化妝品等，也可以根據(jù)使用方法而以化妝水、乳液、凝膠、乳霜、軟膏劑、粉末、顆粒等各種劑型來提供。這樣的各種劑型的化妝品可以將異丙基甲基酚單獨(dú)進(jìn)行調(diào)制，或者通過適當(dāng)組合在準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品以及清潔劑中配合的油性成分、保濕劑、粉體、色素、乳化劑、增溶劑、清潔劑、紫外線吸收劑、增粘劑、藥效成分、香料、樹脂、防菌防霉劑、植物提取物、醇類等來進(jìn)行調(diào)制。另外，作為藥效成分，可以列舉激素劑或者曲酸、熊果苷、胎盤提取物、洋甘菊提取物、間苯三酚（Lucinol）等其它美白成分。上述醫(yī)藥品、準(zhǔn)醫(yī)藥品或者化妝品的總量中，異丙基甲基酚的含量通常為0.00001w/v%以上0.04w/v%以下的濃度，從酪氨酸酶阻礙效果和安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，為0.00001w/v%以上，優(yōu)選為0.0001w/v%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.0005w/v%以上，更加優(yōu)選為0.0007w/v%以上，更進(jìn)一步優(yōu)選為0.001w/v%以上，更加進(jìn)一步優(yōu)選為0.002w/v%以上，并且為0.04w/v%以下，優(yōu)選為0.02w/v%以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.01w/v%以下，更加優(yōu)選為0.005w/v%以下，更進(jìn)一步0.003w/v%以下，更加進(jìn)一步優(yōu)選為0.002w/v%以下。另外，例如為0.00001～0.04w/v%、0.0001～0.04w/v%、0.0005～0.04w/v%、0.001～0.04w/v%、0.002～0.04w/v%、0.00001～0.02w/v%、0.0001～0.02w/v%、0.0005～0.02w/v%、0.001～0.02w/v%、0.002～0.02w/v%、0.0007～0.02w/v%、0.0007～0.002w/v%、0.0007～0.005w/v%、0.001～0.005w/v%、0.00001～0.003w/v%、0.0001～0.01w/v%等。另外，異丙基甲基酚迄今為止僅作為殺菌劑在藥用化妝品（準(zhǔn)醫(yī)藥品）或者醫(yī)藥品等中以0.05～0.10w/v%濃度進(jìn)行配合（藥食審查發(fā)第1225001號(hào)“關(guān)于所謂藥用化妝品中的有效成分清單”），以0.00001w/v%以上0.04w/v%以下的濃度含有異丙基甲基酚的藥用化妝品或者化妝品迄今為止尚未公知。另外，上述醫(yī)藥品等的給藥量或者攝取量可以根據(jù)對(duì)象者的狀態(tài)、體重、性別、年齡或者其它要因而變動(dòng)，在經(jīng)口給藥或攝取的情況下，成人每1人作為異丙基甲基酚優(yōu)選每1天為0.0001mg/kg以上，并且為100mg/kg以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50mg/kg以下，更加優(yōu)選為25mg/kg以下。另外，為0.0001～100mg/kg，優(yōu)選為0.0001～50mg/kg，進(jìn)一步優(yōu)選為0.0001～25mg/kg。作為給藥或者攝取對(duì)象，可以列舉需要或者希望抑制皮膚中黑色素的過量生成的人，例如希望改善色素沉淀或者色素斑或雀斑的人，希望抑制日曬之后的色素沉淀或色素斑或雀斑的發(fā)生、或者希望美白的人等。關(guān)于上述實(shí)施方式，在本發(fā)明中公開了以下方式。<1>一種酪氨酸酶阻礙劑，其中，以異丙基甲基酚作為有效成分。<2>一種黑色素生成抑制劑，其中，以異丙基甲基酚作為有效成分。<3>一種美白劑，其中，以異丙基甲基酚作為有效成分。<4>一種化妝品，其中，以0.00001w/v%以上0.04w/v%以下、0.0001w/v%以上0.04w/v%以下、0.0005w/v%以上0.04w/v%以下、0.001w/v%以上0.04w/v%以下、0.002w/v%以上0.04w/v%以下、0.00001w/v%以上0.02w/v%以下、0.0001w/v%以上0.02w/v%以下、0.0005w/v%以上0.02w/v%以下、0.001w/v%以上0.02w/v%以下、0.002w/v%以上0.02w/v%以下、0.0007w/v%以上0.02w/v%以下、0.0007w/v%以上0.002w/v%以下、0.0007w/v%以上0.005w/v%以下、0.001w/v%以上0.005w/v%以下、0.00001w/v%以上0.003w/v%以下、或者0.0001w/v%以上0.01w/v%以下的濃度含有異丙基甲基酚。<5>如<4>所述的化妝品，其中，所述化妝品為美白化妝品。<6>一種異丙基甲基酚在用于制造酪氨酸酶阻礙劑中的用途。<7>一種異丙基甲基酚在用于制造黑色素生成抑制劑中的用途。<8>一種異丙基甲基酚在用于制造美白劑中的用途。<9>一種在用于酪氨酸酶阻礙中使用的異丙基甲基酚。<10>一種在用于黑色素生成抑制中使用的異丙基甲基酚。<11>一種在用于美白中使用的異丙基甲基酚。<12>一種酪氨酸酶阻礙方法，其中，將異丙基甲基酚進(jìn)行給藥或者攝取。<13>一種黑色素生成抑制方法，其中，將異丙基甲基酚進(jìn)行給藥或者攝取。<14>一種美白方法，其中，將異丙基甲基酚進(jìn)行給藥或者攝取。實(shí)施例實(shí)施例1使用細(xì)胞提取物的由異丙基甲基酚產(chǎn)生的多巴氧化酶活性抑制（1）細(xì)胞提取物（CellLysate）的調(diào)制將來自正常人新生兒表皮的黑色素細(xì)胞（NHEMs：KURABO公司）播種于T-175燒瓶中，在37℃、5%CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用含有PMA（-）的增殖用添加劑（HMGS）的Medium254。在細(xì)胞達(dá)到90%融合的密度的時(shí)點(diǎn)回收細(xì)胞，加入10mL的提取緩沖液（0.1MTris-HCL（pH7.2）、1%NP-40、0.01%SDS、100μMPMSF、1μg/m抑肽酶），超聲波處理之后，在15000r.p.m.的速度下離心分離10分鐘時(shí)間，得到上清液。（2）酪氨酸酶活性的測(cè)定使用上述細(xì)胞提取物進(jìn)行酪氨酸酶活性的測(cè)定。多巴氧化酶活性測(cè)定是參考MBTH法（WinderA.etal.,1991,Eur.J.Biochem.198:317-326），按照以下的方法進(jìn)行。在96孔盤的各孔中分別加入分析緩沖液（AssayBuffer）（4%二甲基甲酰胺、100mM磷酸鈉緩沖（pH7.1））80μL、20.7mMMBTH（3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙）溶液60μL、作為基質(zhì)的5mML-DOPA（L-二羥苯丙氨酸）溶液40μL，并添加以下所示的試驗(yàn)化合物20μL以達(dá)到表1的最終濃度。向其中添加（1）中所得到的細(xì)胞提取物20μL，在37℃下反應(yīng)30～60分鐘之后，用490nm的吸光度來測(cè)定其顯色反應(yīng)（N=3）。將測(cè)定值作為相對(duì)于對(duì)照結(jié)果的相對(duì)值來表示。（3）結(jié)果結(jié)果示于表1。發(fā)現(xiàn)異丙基甲基酚超過曲酸的多巴氧化酶活性抑制作用存在濃度依附性（0.00075～0.015w/v%）。另一方面，比較化合物1（百里酚）以及比較化合物2（香芹酚）中沒有發(fā)現(xiàn)多巴氧化酶活性抑制作用。[表1]評(píng)價(jià)濃度（μM）曲酸IPMP（w/v%濃度）比較化合物1比較化合物25093.9±1.583.1±3.9（0.00075%）103.7±0.9102.1±0.510083.3±1.662.9±3.5（0.0015%）93.8±1.696.9±1.850060.9±1.932.8±3.7（0.0075%）104.4±0.899.6±1.6100042.2±0.519.8±1.2（0.015%）105.4±0.597.8±1.9實(shí)施例2使用培養(yǎng)細(xì)胞的由異丙基甲基酚產(chǎn)生的多巴氧化酶活性抑制（1）（1）細(xì)胞培養(yǎng)將來自正常人新生兒表皮的黑色素細(xì)胞（NHEMs：KURABO公司）以1×104個(gè)細(xì)胞/孔（100μL/孔）的細(xì)胞密度播種于96孔盤中，在37℃、5%CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中使用含有PMA（-）的增殖用添加劑（HMGS）的Medium254。培養(yǎng)3天之后，將內(nèi)皮素-1（ET-1）、SCF、α-MSH、組胺(Histamine)、前列腺素(PGE2)各自在培養(yǎng)基中的最終濃度調(diào)節(jié)為1nM，并且添加與實(shí)施例1同樣的試驗(yàn)化合物至最終濃度，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)3天。作為對(duì)照，添加等量的DMSO。（2）多巴氧化酶活性的測(cè)定培養(yǎng)結(jié)束之后，以20μL/孔添加阿爾瑪藍(lán)（AlamarBlue）（InvitrogenCorporation）試藥，培養(yǎng)2～3小時(shí)之后，測(cè)定培養(yǎng)基中的熒光強(qiáng)度以測(cè)定細(xì)胞呼吸活性。之后，用PBS清洗細(xì)胞，以20μL/孔添加提取緩沖液（0.1MTris-HCL（pH7.2）、1%NP-40、0.01%SDS、100μMPMSF、1μg/m抑肽酶）、并以20μL/孔添加分析緩沖液（AssayBuffer）（4%二甲基甲酰胺、100mM磷酸鈉緩沖（pH7.1）），在4℃下將細(xì)胞增溶3小時(shí)，進(jìn)行多巴氧化酶活性的測(cè)定。多巴氧化酶活性測(cè)定是參考MBTH法（WinderA.etal.,1991,Eur.J.Biochem.198:317-326），按照以下的方法進(jìn)行。向增溶過的細(xì)胞溶液的各孔中分別加入上述分析緩沖液80μL、20.7mMMBTH（3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙）溶液60μL、作為基質(zhì)的5mML-DOPA（L-二羥苯丙氨酸）溶液40μL，在37℃下反應(yīng)30～60分鐘之后，用490nm的吸光度測(cè)定其顯色反應(yīng)（N=3）。將測(cè)定值作為相對(duì)于對(duì)照結(jié)果的相對(duì)值來表示。（3）結(jié)果結(jié)果示于表2。發(fā)現(xiàn)異丙基甲基酚超過曲酸的多巴氧化酶活性抑制作用存在濃度依附性。另一方面，比較化合物1（百里酚）以及比較化合物2（香芹酚）中沒有發(fā)現(xiàn)多巴氧化酶活性抑制作用。另外，從通過阿爾瑪藍(lán)法進(jìn)行的細(xì)胞呼吸活性的測(cè)定中可以確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)多巴氧化酶活性抑制作用的異丙基甲基酚濃度不影響細(xì)胞增殖。[表2]實(shí)施例3使用培養(yǎng)細(xì)胞的由異丙基甲基酚產(chǎn)生的多巴氧化酶活性抑制（2）添加異丙基甲基酚至表3所示的最終濃度，與實(shí)施例2同樣測(cè)定多巴氧化酶的活性。結(jié)果一并示于表3。[表3]由表3確認(rèn)，異丙基甲基酚在0.00001～0.0025w/v%的濃度范圍內(nèi)具有濃度依附性的多巴氧化酶活性抑制作用，并且在該濃度范圍內(nèi)不影響細(xì)胞增殖。