一種治療多發(fā)性硬化的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療多發(fā)性硬化的藥物組合物，本發(fā)明所述的藥物組合物包括BAFF抑制劑(TACI-IgG)和IL-15抑制劑(抗IL-15抗體)。利用本發(fā)明所述的藥物組合物治療多發(fā)性硬化的小鼠模型EAE小鼠，結(jié)果顯示本發(fā)明所述的藥物組合物能夠顯著降低脾和淋巴結(jié)中B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、記憶B/T細(xì)胞的數(shù)量，抑制了B細(xì)胞的活化和自身免疫抗體的產(chǎn)生，減輕自身免疫的臨床癥狀。本發(fā)明所述的藥物組合物有效的治療了多發(fā)性硬化。
【專利說明】一種治療多發(fā)性硬化的藥物組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種治療自身免疫性疾病多發(fā)性硬化(MS)的藥物組合物。具體而言，本發(fā)明所述組合物包括BAFF抑制劑和IL-15抑制劑，動物實驗表明所述藥物組合物能有效抑制了自身免疫的發(fā)生和發(fā)展。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會時代的發(fā)展，自身免疫病在我國各類人群中的發(fā)病率不斷上升。鑒于該病后期會對人們?nèi)蘸蟮纳?、工作甚至自身健康造成?yán)重的危害，進一步加強對自身免疫性疾病的基礎(chǔ)性研究將會幫助人類了解此類疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等作用機理，從而提高對它的預(yù)防、診斷和治療水平。這對保障人類生活健康，促進社會經(jīng)濟的發(fā)展均有著重要的理論和實際意義。
[0003]自身免疫性疾病根據(jù)免疫損傷機制可以分為兩大類:一類是自身抗體引起的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重癥肌無力(MG)和原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)等，另一類是自身反應(yīng)性T細(xì)胞引起的自身免疫性疾病如多發(fā)硬化[MS，其動物模型是自身免疫性腦脊髓炎(EAE)]和胰島素依賴性糖尿病(IDDM)。
[0004]許多實驗證據(jù)表明T細(xì)胞直接參與自身免疫性疾病，多種器官特異性自身免疫病都是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，如I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化(MS)等。同時在抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病中，B細(xì)胞的活化也依賴于Th細(xì)胞的輔助。近來，許多證據(jù)顯示在T細(xì)胞驅(qū)動的自身免疫病中，自身反應(yīng)性B細(xì)胞也發(fā)揮著不可忽視的作用。因此，眾多的自身免疫性疾病通常是 由自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞共同協(xié)調(diào)并介導(dǎo)產(chǎn)生的。
[0005]自身免疫病的治療尚缺乏理想的方法。通常針對疾病的病理變化和組織損傷所致的后果進行治療，也可通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的各個環(huán)節(jié)阻斷疾病進程來達(dá)到治療的目的。目前一些常見的治療方法包括:使用大劑量皮質(zhì)激素、水楊酸或各種合成的前列腺素抑制劑，抑制一些重癥自身免疫病所致的炎癥反應(yīng)；或者使用免疫抑制劑來抑制免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。但是這兩種方法都只能減緩病情的發(fā)展速度而并非根治，同時還會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。近年來隨著自身免疫性疾病的致病機理被逐步闡明，針對該病的治療方法也在不斷的研究之中。
[0006]BAFF又稱B細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS),屬于腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily, TNSF)成員。BAFF 在 B 細(xì)胞發(fā)育、功能調(diào)節(jié)和自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其缺陷或過量表達(dá)均可引起機體免疫失衡，與某些自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。在SLE、SS和RA等自身免疫性疾病患者血清中發(fā)現(xiàn)BAFF水平明顯升高，BAFF過表達(dá)會導(dǎo)致自身反應(yīng)性B細(xì)胞逃脫正常的免疫篩除機制從而成熟為抗體分泌的B細(xì)胞或漿細(xì)胞，進一步證實了 BAFF密切參與了這些疾病的發(fā)生和發(fā)展[Editorial, et al.The B cell:a new therapeutic target in rheumatoid arthritisand other autoimmune diseases.Joint Bone Spine2004.71:357-360]。
[0007]T 細(xì)胞被認(rèn)為是 MS 的主要致病原因[Behi ME, et al.New insights into cellresponses involved in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiplesclerosis.1mmunology Letters2005.96 (I):11-26],與 Thl 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫密切相關(guān)。主流的分子模擬學(xué)說認(rèn)為，MS患者感染的病毒與中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白成分或少突膠質(zhì)細(xì)胞間存在著交叉抗原。病毒感染后，體內(nèi)被激活的T細(xì)胞在清除病毒的同時，由于和髓鞘的成分發(fā)生交叉反應(yīng)，從而引起中樞脫髓鞘。由于MS損傷區(qū)內(nèi)含有大量的T細(xì)胞，因此使用髓鞘堿性蛋白(MBP)多肽片段激活的T細(xì)胞傳輸給小鼠可以引起MS的動物模型試驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。但是近年來對B細(xì)胞功能認(rèn)識的不斷加深，B細(xì)胞在MS的發(fā)生過程中的作用也逐漸被重視，我們前期研究表明，在自身免疫性疾病MS中，血清中的BAFF水平升高。
[0008]正常人體腦內(nèi)BAFF的表達(dá)量僅為淋巴組織的十分之一，而MS患者損傷區(qū)BAFF的表達(dá)水平和淋巴組織中的水平相當(dāng)。而且由于活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的BAFF遠(yuǎn)高于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，因此MS患者的損傷區(qū)成為腦內(nèi)BAFF的主要來源。來自于復(fù)發(fā)緩解型EAE和慢性復(fù)發(fā)型EAE的研究也表明，實驗動物在發(fā)病或復(fù)發(fā)期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)BAFF水平增高，而緩解期BAFF水平下調(diào)。鑒于BAFF在B細(xì)胞的發(fā)育、分化中發(fā)揮重要作用，同時又是多種自身免疫性疾病中的關(guān)鍵致病分子，所以BAFF已被作為在多種自身免疫病中重要的抑制B細(xì)胞效應(yīng)的治療靶點，2011年3月，抗BAFF抗體belimumab被命名為Benlysta并在美國上市。但是阻斷BAFF治療的方法也存在一定缺陷，在MS患者的腦內(nèi)，存在著淋巴樣濾泡結(jié)構(gòu)，B細(xì)胞可以在這些結(jié)構(gòu)中不斷擴增并分化成為楽:細(xì)胞或自身反應(yīng)性記憶B細(xì)胞,通過釋放自身抗體或作為抗原呈遞細(xì)胞，使得MS的病情不斷反復(fù)并惡化。單獨的抗BAFF抗體雖然能顯著降低外周血成熟B細(xì)胞的數(shù)目，但是它不能降低漿細(xì)胞和自身反應(yīng)性記憶B細(xì)胞的數(shù)量[Vincent FB, et al.BAFF and innate immunity:new therapeutic targetsfor systemic lupus erythematossu.Tmmunol Cell Biol.2012.90:293-303] ? 因此只要自身反應(yīng)性記憶B細(xì)胞存在于體內(nèi)，體液免疫反應(yīng)就能夠被再次激活。所以通過尋找聯(lián)合治療的方法來刪除自身反應(yīng)性記憶B細(xì)胞，患有自身免疫性疾病的患者將有可能得到完全的治療并康復(fù)。
[0009]IL-15是一種重要的多功能細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，不僅可以刺激⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的增殖而且能誘導(dǎo)CTL的生成，同時還介導(dǎo)由IgM特異性抗體或CD40配體刺激引起的B細(xì)胞增殖及免疫球蛋白的合成。在刺激NK細(xì)胞的生成、增殖和激活過程中IL-15也發(fā)揮重要作用。所以IL-15是記憶性T/B細(xì)胞存活和增殖的關(guān)鍵因子，而BAFF則可能通過抑制IL-15來負(fù)調(diào)節(jié)記憶性T/B細(xì)胞的數(shù)量。另外，IL-15還是一種多生物學(xué)效應(yīng)的促炎癥細(xì)胞因子，能夠通過抑制IL-2誘導(dǎo)的Al⑶及促進⑶8+記憶性T細(xì)胞的生存而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。IL-15在CD4+T細(xì)胞中可通過活化STAT5促進IL-17A的表達(dá)[Pandiyan P，et al.The role of IL_15in activating STAT5and fine-tuning IL-17A production inQ)4+T lymphocytes.J Immunol.2012.189:4237-46],進而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化；還可以促進多種細(xì)胞亞群產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF等促炎細(xì)胞因子；同時刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1 β、腫瘤壞死因子_α和PGE2等產(chǎn)生協(xié)同作用以放大炎癥反應(yīng)。實驗表明，多種自身免疫性疾病患者體內(nèi)的IL-15表達(dá)失調(diào)，阻斷IL-15的活性可以控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展，實現(xiàn)治療以免疫介導(dǎo)炎癥為主要機制的各種疾病。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為解決現(xiàn)有藥物在治療自身免疫性疾病中的缺陷，以及單獨使用BAFF抑制劑治療自身免疫病的不足，本發(fā)明公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括BAFF抑制劑和IL-15抑制劑。
[0011]上述藥物組合物中的BAFF抑制劑優(yōu)選TAC1-1gG，IL-15抑制劑優(yōu)選Anti_IL_15抗體，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0012]本發(fā)明所述的藥物組合物，其中BAFF抑制劑和IL-15抑制劑的質(zhì)量比為0.5~10: 1，其中優(yōu)選4: I。
[0013]本發(fā)明所述的藥物組合物還包括藥物制劑中常用的輔助劑，如:賦形劑、乳化劑、增溶劑、抗氧化劑、控釋劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３諦AFF抑制劑和IL-15抑制劑的分子的活性。
[0014]本發(fā)明通過動物實驗評價了上述藥物組合物在治療自身免疫病中的療效,具體包括以下步驟:
[0015]I)動物模型的建立:本發(fā)明選取多發(fā)性硬化的小鼠模型，即試驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型。本發(fā)明采用M0G35-55和完全弗氏佐劑制備抗原乳劑，小鼠皮下注射抗原乳劑后予以腹腔注射百日咳毒素。
[0016]2)治療分組及治療方法:動物實驗設(shè)置了正常小鼠組、PBS對照組、單抑制劑組和組合物治療組，按療程給藥2周到24周。其中較優(yōu)的給藥方式為3天給藥一次，靜脈給藥2周后腹腔給藥2周。
[0017]3)療效評價:
[0018]本發(fā)明用TAC1-1gG和Ant1-1L-15藥物組合物治療EAE小鼠有效降低了小鼠體內(nèi)B細(xì)胞的數(shù)目和B細(xì)胞的活化。
[0019]本發(fā)明用TAC1-1gG和Ant1-1L-15藥物組合物治療EAE小鼠有效減少了輔助性T細(xì)胞Thl和Thl7的數(shù)目。
[0020]本發(fā)明用TAC1-1gG和Ant1-1L-15藥物組合物治療EAE小鼠有效減少了小鼠體內(nèi)記憶性T和B細(xì)胞的數(shù)目。
[0021]本發(fā)明用TAC1-1gG和Ant1-1L-15藥物組合物治療EAE小鼠有效緩解了小鼠的臨床癥狀。
[0022]本發(fā)明用TAC1-1gG和Anti_IL_15藥物組合物治療EAE小鼠有效降低了小鼠體內(nèi)自身反應(yīng)性抗體的水平，降低了 EAE小鼠的自身免疫。
[0023]本發(fā)明通過實驗檢測了上述藥物組合物的治療效果，實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的藥物組合物顯著降低EAE臨床癥狀，顯著降低了小鼠對自身抗原的反應(yīng)，本發(fā)明的藥物組合物療效果顯著好于TAC1-1gG或抗IL-15抗體單獨治療。
[0024] 本發(fā)明的藥物組合物能有效治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，包括自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療EAE小鼠中B細(xì)胞的數(shù)目；
[0026]圖2TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療EAE小鼠中B細(xì)胞的活化；[0027]圖3TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療EAE小鼠中Thl和Thl7細(xì)胞的數(shù)目；
[0028]圖4TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療EAE小鼠脾和淋巴結(jié)中記憶性T和B細(xì)胞的數(shù)目；
[0029]圖5TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療EAE小鼠的臨床癥狀；
[0030]圖6不同組小鼠對自身抗原反應(yīng)性。
[0031]實施例1TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療對B細(xì)胞的影響
[0032]一材料和方法
[0033]1、材料
[0034]BALB/c小鼠購買自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白33-55 (M0G33-55)、完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素購于Sigma公司；兔抗鼠B220單抗、兔抗鼠⑶3單抗、兔抗鼠⑶21單抗、兔抗鼠⑶23單抗購于Abeam ;BAFF抑制劑TAC1-1gG，抗小鼠IL-15中和性抗體購自R&D公司。
[0035]2、方法
[0036]2.1、EAE小鼠模型構(gòu)建
[0037]用0.01mol/L的PBS將M0G35-55稀釋為2mg/mL，然后將稀釋液與等量的完全福氏佐劑充分混合，通過三 通管將乳劑抽打為油包水狀態(tài)，即為誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠于背部兩側(cè)皮下注射抗原乳劑(內(nèi)含MOG抗原200~250 μ g/只)。對照組不予抗原處理。免疫后第O、第48小時給予全部小鼠(包括對照組)腹腔注射百日咳毒素，每只動物500ng/0.2mL。
[0038]2.2、實驗分組
[0039]將實驗小鼠分為5組:對照小鼠，PBS治療EAE小鼠，TAC1-1gG治療EAE小鼠，Ant1-1L-15治療EAE小鼠，TAC1-1gG和Ant1-1L-15聯(lián)合治療EAE小鼠。每組12只動物。通過尾靜脈注射TAC1-1gG和Ant1-1L-15到發(fā)病的EAE小鼠體內(nèi)，每3天注射I次，連續(xù)治療2周后，改用腹腔繼續(xù)治療2周。TAC1-1gG用量:每次2mg/kg ;抗IL-15抗體用量:每次
0.5mg/kg。
[0040]2.4、淋巴組織的預(yù)處理
[0041]a)將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；
[0042]b)用剪刀將組織剪至勻漿狀；
[0043]c)加入IOml生理鹽水；
[0044]d)用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中；
[0045]e)離心沉淀1000rpm, 3-5min,再用生理鹽水洗3遍,每次以低速(500_800rpm)短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片；
[0046]f)以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團塊；
[0047]g)細(xì)胞保存?zhèn)溆谩?br> [0048]2.3、流式細(xì)胞樣品處理及檢測
[0049]a)取2X IO6個細(xì)胞,用冷的PBS2ml洗漆細(xì)胞一次，800rpm離心5min ；
[0050]b)用211114%多聚甲醒室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min ;2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm 離心 5min ；
[0051]c)用Iml含0.2% Triton-XlOO和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置lOmin，800rpm 離心 5min ；
[0052] d)加入飽和劑量未標(biāo)記抗體(兔抗鼠B220、⑶3、⑶21、⑶23抗體)，冰上放置40min, 800rpm離心5min,用2ml冷的PBS重懸細(xì)胞,800rpm離心5min,洗去未結(jié)合一抗,重
復(fù)一次；
[0053]e)加入突光標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗,冰上避光放置40min后，800rpm離心5min,去上清，PBS洗滌兩次；
[0054]f)加入0.5ml I %多聚甲醛重懸細(xì)胞，固定待測；
[0055]g)流式細(xì)胞儀檢測熒光值，每管計數(shù)10000個細(xì)胞。
[0056]二結(jié)果
[0057]數(shù)據(jù)分析:采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間的比較采用t檢驗法。
[0058]圖1顯示與PBS治療組相比，TAC1-1gG治療導(dǎo)致脾和淋巴結(jié)中B細(xì)胞顯著減少(P
<0.01)。與PBS對照組相比，聯(lián)合治療導(dǎo)致脾和淋巴結(jié)腫B細(xì)胞顯著減少(P < 0.01)。與TAC1-1gG單獨治療組相比，聯(lián)合治療組并沒有顯著降低B細(xì)胞數(shù)目。這顯示，TAC1-1gG特異性地抑制B細(xì)胞，而抗IL-15抗體沒有這方面的功能，但TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療組合TAC1-1gG單獨治療組相似，都能顯著降低EAE小鼠脾和淋巴結(jié)中B細(xì)胞數(shù)目。
[0059]圖2顯示與PBS治療組相比，TAC1-1gG治療導(dǎo)致脾和淋巴結(jié)中B細(xì)胞活化標(biāo)志⑶21顯著減少(P < 0.01)，聯(lián)合治療組也導(dǎo)致脾和淋巴結(jié)中B細(xì)胞活化顯著減少(P
<0.01)。與TAC1-1gG單獨治療組相比，聯(lián)合治療組并沒有顯著降低B細(xì)胞活化標(biāo)志。這顯示，TAC1-1gG特異性地抑制B細(xì)胞活化，TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療的EAE小鼠脾和淋巴結(jié)中B細(xì)胞活化標(biāo)志⑶21顯著地降低。
[0060]實施例2TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療對輔助性T細(xì)胞(Thl、Thl7)的影響
[0061]—材料和方法
[0062]1、材料
[0063]BALB/c小鼠購買自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白33-55 (M0G33-55)、完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素購于Sigma公司；兔抗鼠⑶4單抗、兔抗鼠IL-17單抗、兔抗鼠IFNy單抗購于Abeam ;BAFF抑制劑TAC1-1gG，抗小鼠IL-15中和性抗體購自R&D公司。
[0064]2、方法
[0065]2.1、EAE小鼠模型構(gòu)建
[0066]用0.01mol/L的PBS將M0G35-55稀釋為2mg/mL，然后將稀釋液與等量的完全福氏佐劑充分混合，通過三通管將乳劑抽打為油包水狀態(tài)，即為誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠于背部兩側(cè)皮下注射抗原乳劑(內(nèi)含MOG抗原200~250 μ g/只)。對照組不予抗原處理。免疫后第O、第48小時給予全部小鼠(包括對照組)腹腔注射百日咳毒素，每只動物500ng/0.2mL。
[0067]2.2、實驗分組
[0068]將實驗小鼠分為5組:對照小鼠，PBS治療EAE小鼠，TAC1-1gG治療EAE小鼠，Ant1-1L-15治療EAE小鼠，TAC1-1gG和Ant1-1L-15聯(lián)合治療EAE小鼠。每組12只動物。通過尾靜脈注射TAC1-1gG和Ant1-1L-15到發(fā)病的EAE小鼠體內(nèi)，每3天注射I次，連續(xù)治療2周后，改用腹腔繼續(xù)治療2周。TAC1-1gG用量:每次2mg/kg ;抗IL-15抗體用量:每次0.5mg/kg。
[0069]2.3、淋巴組織的預(yù)處理
[0070]a)將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；
[0071]b)用剪刀將組織剪至勻漿狀；
[0072]c)加入IOml生理鹽水；
[0073]d)用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中；
[0074]e)離心沉淀1000rpm, 3-5min,再用生理鹽水洗3遍,每次以低速(500_800rpm)短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片；
[0075]f)以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團塊；
[0076]g)細(xì)胞保存?zhèn)溆谩?br> [0077]2.4、流式細(xì)胞樣品處理及檢測
[0078]a)取2X IO6個細(xì)胞,用冷的PBS2ml洗漆細(xì)胞一次，800rpm離心5min ；
[0079]b)用2ml4%多聚甲醒室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min ;2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm 離心 5min ； [0080]c)用Iml含0.2% Triton-XlOO和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置lOmin，800rpm 離心 5min ；
[0081]d)加入飽和劑量未標(biāo)記抗體(兔抗鼠⑶4、IL-17、IFN Y抗體)，冰上放置40min，800rpm離心5min,用2ml冷的PBS重懸細(xì)胞,800rpm離心5min,洗去未結(jié)合一抗，重復(fù)一次；
[0082]e)加入突光標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗,冰上避光放置40min后，800rpm離心5min,去上清，PBS洗滌兩次；
[0083]f)加入0.5ml I %多聚甲醛重懸細(xì)胞，固定待測；
[0084]g)流式細(xì)胞儀檢測熒光值，每管計數(shù)10000個細(xì)胞。
[0085]二結(jié)果
[0086]數(shù)據(jù)分析:采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間的比較采用t檢驗法。
[0087]圖3顯示TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療的EAE小鼠脾和淋巴結(jié)中Thl和Thl7細(xì)胞顯著降低。在自身免疫性疾病如EAE中，Thl和Thl7細(xì)胞顯著升高。與PBS治療組相t匕，TAC1-1gG治療組不能降低Thl和Thl7細(xì)胞。與TAC1-1gG單獨治療組相比，聯(lián)合治療組顯著降低Thl和Thl7細(xì)胞。與PBS治療組相比，抗IL-15抗體治療組Thl和Thl7細(xì)胞顯著地降低。這說明，在抑制Thl和Thl7細(xì)胞方面，抗IL-15抗體發(fā)揮著主要作用。
[0088]實施例3TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療對記憶性T/B細(xì)胞的影響
[0089]一材料和方法
[0090]1、材料
[0091]BALB/c小鼠購買自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白33-55 (M0G33-55)、完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素購于Sigma公司；兔抗鼠B220單抗、兔抗鼠⑶44單抗、兔抗鼠⑶27單抗、兔抗鼠⑶3單抗購于Abeam ；BAFF抑制劑TAC1-1gG，抗小鼠IL-15中和性抗體購自R&D公司。
[0092]2、方法
[0093]2.1、EAE小鼠模型構(gòu)建[0094]用0.01mol/L的PBS將M0G35-55稀釋為2mg/mL，然后將稀釋液與等量的完全福氏佐劑充分混合，通過三通管將乳劑抽打為油包水狀態(tài)，即為誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠于背部兩側(cè)皮下注射抗原乳劑(內(nèi)含MOG抗原200~250 μ g/只)。對照組不予抗原處理。免疫后第O、第48小時給予全部小鼠(包括對照組)腹腔注射百日咳毒素，每只動物500ng/0.2mL。
[0095]2.2、實驗分組
[0096]將實驗小鼠分為5組:對照小鼠，PBS治療EAE小鼠，TAC1-1gG治療EAE小鼠，Ant1-1L-15治療EAE小鼠，TAC1-1gG和Ant1-1L-15聯(lián)合治療EAE小鼠。每組12只動物。通過尾靜脈注射TAC1-1gG和Ant1-1L-15到發(fā)病的EAE小鼠體內(nèi)，每3天注射I次，連續(xù)治療2周后，改用腹腔繼續(xù)治療2周。TAC1-1gG用量:每次2mg/kg ;抗IL-15抗體用量:每次
0.5mg/kg。
[0097]2.2、淋巴組織的預(yù)處理
[0098]a)將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；
[0099]b)用剪刀將組織剪至勻漿狀； [0100]c)加入IOml生理鹽水；
[0101]d)用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中；
[0102]e)離心沉淀1000rpm, 3-5min,再用生理鹽水洗3遍,每次以低速(500_800rpm)短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片；
[0103]f)以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團塊；
[0104]g)細(xì)胞保存?zhèn)溆谩?br> [0105]2.3、流式細(xì)胞樣品處理及檢測
[0106]a)取2X IO6個細(xì)胞,用冷的PBS2ml洗漆細(xì)胞一次,800rpm離心5min ;
[0107]b)用211114%多聚甲醒室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min ;2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm 離心 5min ；
[0108]c)用Iml含0.2% Triton-XlOO和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置lOmin，800rpm 離心 5min ；
[0109]d)加入飽和劑量未標(biāo)記抗體(兔抗鼠一抗)，冰上放置40min,800rpm離心5min,用2ml冷的PBS重懸細(xì)胞,800rpm離心5min,洗去未結(jié)合一抗,重復(fù)一次；
[0110]e)加入突光標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗,冰上避光放置40min后，800rpm離心5min,去上清，PBS洗滌兩次；
[0111]f)加入0.5ml I %多聚甲醛重懸細(xì)胞，固定待測；
[0112]g)流式細(xì)胞儀檢測熒光值，每管計數(shù)10000個細(xì)胞。
[0113]二結(jié)果
[0114]數(shù)據(jù)分析:采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間的比較采用t檢驗法。
[0115]圖4顯示與健康小鼠相比，在自身免疫性疾病EAE中，記憶性T和B細(xì)胞顯著升高。與PBS治療組相比，TAC1-1gG治療組記憶性T和B細(xì)胞升高(P < 0.05)。與TAC1-1gG單獨治療組相比，聯(lián)合治療組顯著降低記憶性T和B細(xì)胞(P<0.01)。與PBS治療組相比，抗IL-15抗體治療組記憶性T和B細(xì)胞顯著地降低(P < 0.01)。這顯示，TAC1-1gG特異性地抑制B細(xì)胞活化，而不能抑制記憶性T/B細(xì)胞的形成，而抗IL-15抗體特異性地抑制記憶性T和B細(xì)胞的功能。因此，TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療的EAE小鼠脾和淋巴結(jié)中記憶性T和B細(xì)胞顯著降低。
[0116]實施例4TACI_IgG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療EAE對臨床病情及自身抗原反應(yīng)的影響
[0117]—材料和方法
[0118]1、材料
[0119]BALB/c小鼠購買自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白33-55 (M0G33-55)、 完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素購于Sigma公司；BAFF抑制劑TAC1-1gG，抗小鼠IL-15中和性抗體購自R&D公司。
[0120]2、方法
[0121]2.1、EAE小鼠模型構(gòu)建
[0122]用0.01mol/L的PBS將M0G35-55稀釋為2mg/mL，然后將稀釋液與等量的完全福氏佐劑充分混合，通過三通管將乳劑抽打為油包水狀態(tài)，即為誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠于背部兩側(cè)皮下注射抗原乳劑(內(nèi)含MOG抗原200~250 μ g/只)。對照組不予抗原處理。免疫后第O、第48小時給予全部小鼠(包括對照組)腹腔注射百日咳毒素，每只動物500ng/0.2mL。
[0123]2.2、實驗分組
[0124]將實驗小鼠分為5組:對照小鼠，PBS治療EAE小鼠，TAC1-1gG治療EAE小鼠，Ant1-1L-15治療EAE小鼠，TAC1-1gG和Ant1-1L-15聯(lián)合治療EAE小鼠。每組12只動物。通過尾靜脈注射TAC1-1gG和Ant1-1L-15到發(fā)病的EAE小鼠體內(nèi)，每3天注射I次，連續(xù)治療2周后，改用腹腔繼續(xù)治療2周。TAC1-1gG用量:每次2mg/kg ;抗IL-15抗體用量:每次
0.5mg/kg。
[0125]2.3臨床癥狀評分
[0126]5分法評分標(biāo)準(zhǔn)分級如下:0分為不發(fā)??；1分為尾巴無力；2分為輕微后肢無力；3分為嚴(yán)重后肢麻痹；4分為四肢麻痹；5分為瀕死或死亡。免疫當(dāng)天起每天對小鼠稱重，并采用雙盲法進行神經(jīng)功能評分。由兩位非實驗人員觀察并評價，參照評分細(xì)則進行評分。首先由一位人員進行5分法和7分法評分，兩者可以同時進行。上述評分30min后，再由另外一位觀察者進行15分法評分。由于小鼠晝夜活動差異很大，每天均于上午8時進行評價。
[0127]2.4、淋巴結(jié)對自身抗原M0G33-55反應(yīng)性的檢測
[0128]a)將淋巴結(jié)放入平皿中，加入少量生理鹽水；
[0129]b)用剪刀和鑷子將淋巴結(jié)剪捏至勻漿狀；
[0130]c)加入IOml生理鹽水；
[0131]d)用吸管吸收組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中；
[0132]e)離心沉淀1000rpm, 3-5min,在用生理鹽水洗3遍,每次以低速(500_800rpm)短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片；
[0133]f)以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團塊；
[0134]g)用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞；
[0135]h)用一系列濃度(0,5,10,20μg/ml)的自身抗原M0G33-55刺激淋巴細(xì)胞3天；
[0136]i)在第三天加入 0.5 μ Ci3H-TdR ；[0137]j)16小時后，用細(xì)胞閃爍儀讀取數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為CPM土S.E.[0138]二結(jié)果
[0139]數(shù)據(jù)分析:采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間的比較采用t檢驗法。
[0140]圖5顯示TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療的EAE小鼠臨床癥狀顯著降低。在自身免疫性疾病如EAE中，臨床癥狀顯著升高。與PBS治療組相比，TAC1-1gG治療組臨床癥狀顯著降低(P < 0.05)。與PBS治療組相比，抗IL-15抗體治療組臨床癥狀顯著地降低(P < 0.05)。與TAC1-1gG或抗IL-15抗體單獨治療組相比，聯(lián)合治療組顯著降低臨床癥狀。因此，聯(lián)合治療效果顯著好于TAC1-1gG或抗IL-15抗體單獨治療。
[0141] 圖6顯示TAC1-1gG和抗IL-15抗體聯(lián)合治療的EAE小鼠淋巴細(xì)胞對自身抗原M0G33-55肽反應(yīng)顯著降低。在自身免疫性疾病如EAE中，對自身抗原反應(yīng)性顯著升高。與PBS治療組相比，TAC1-1gG或抗IL-15抗體單獨治療組自身抗原反應(yīng)性顯著降低。與TAC1-1gG或抗IL-15抗體單獨治療組相比，聯(lián)合治療組顯著降低對自身抗原的反應(yīng)。因此，聯(lián)合治療效果顯著好于TAC1-1gG或抗IL-15抗體單獨治療。
【權(quán)利要求】
1.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括TAC1-1gG和抗IL-15抗體。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，TAC1-1gG和抗IL-15抗體抑制劑的質(zhì)量比為0.5~10: 1。
3.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，TAC1-1gG和抗IL-15抗體抑制的質(zhì)量比為4:1。
4.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的抗IL-15抗體為單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項所述的藥物組合物，在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的自身免疫性疾病，其特征在于，所述的自身免疫性疾病為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，包括多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病。
7.權(quán)利要求1-4中任意一項所述的藥物組合物在制備治療自身免疫性腦脊髓炎藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-4中任意一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包括賦形劑、乳化劑、增溶劑、抗氧化劑、控釋劑中的一種或多種。
【文檔編號】A61K39/395GK103977401SQ201310120331
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月9日
【發(fā)明者】王仁喜, 黎燕, 肖鶴, 韓根成, 陳國江, 侯春梅, 沈倍奮, 馬寧, 邢陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所