專利名稱：一種從甘草渣中提取甘草黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取甘草黃酮的方法，尤其是涉及一種從甘草渣中提取甘草黃酮的方法。
技術(shù)背景: 甘草為豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、脹果甘草Glycyrrhizainflata Bat或光果甘草Glycyrrhiza glabra L的干燥根及根莖。富含三職和黃酮類成分，其中五環(huán)三萜類化合物甘草酸是主要有效成分之一。醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)常采用水提、含水醇提、堿提等方法從甘草藥材中提取甘草酸，提取后所剩余的甘草藥渣通常作為工業(yè)廢料棄去。進一步的研究表明甘草藥渣中富含大量的黃酮類化合物，這些黃酮類成分具有廣泛的生物活性，如抑菌、抗真菌、增強機·體免疫功能、抗H IV、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖寡趸?、保肝及降血糖等。因而，甘草藥渣是一種寶貴的可再利用資源，其可廣泛應(yīng)用于藥品、食品及化妝品等領(lǐng)域。
目前對甘草酸的提取工藝研究較多，也比較成熟。但是對于甘草中黃酮類成分的提取工藝則研究較少，而利用提取甘草酸后的廢渣提取甘草黃酮的則更少。甘草黃酮經(jīng)典提取方法有溶劑萃取法、聚酰胺吸附法等提取甘草黃酮，因為工藝復雜，收率低，成本高等原因，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。對于從甘草中提取甘草浸膏和甘草酸后得到的甘草藥渣這一工業(yè)生產(chǎn)廢料，如能夠加以充分利用，挖掘其醫(yī)療價值和經(jīng)濟價值，有利于解決工業(yè)上生產(chǎn)廢物處理的難題，更加充分合理利用甘草植物資源和保護生態(tài)環(huán)境，定會產(chǎn)生巨大的效.、/■Mo
植物的有效成分往往包裹在細胞壁內(nèi)，酶處理法可以水解破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分直接暴露出來，溶解、混懸或膠溶于提取溶劑中，以提高總黃酮的提取率。酶解法具有反應(yīng)溫和、得率高、成本低廉、操作簡單等優(yōu)點。超聲波的空化作用，能加速植物細胞壁破裂，促進活性物質(zhì)的釋放，提取效率高，時間短，雜質(zhì)少，廣泛用于植物活性成分的提取。上述酶解和超聲破壁的現(xiàn)代工藝已被引入提取植物總黃酮的技術(shù)方案中，但尚存在一些有待改進的不足。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種改進的甘草渣中甘草總黃酮的提取方法，該方法顯著提高了甘草總黃酮的提取率和純度。
本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下: 一種從甘草渣中提取甘草黃酮的方法，由以下步驟組成: (I)超聲酶解:取干燥、粉碎后的甘草渣加入質(zhì)量濃度為0.05% 0.15%的復合酶溶液，加入量為10 30ml復合酶溶液/Ig甘草渣，再將溶液的pH值調(diào)至4.5 6，然后在40 60°C下以50KHZ，160W超聲處理0.5 1.5小時后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，收集濾液，減壓濃縮至相對密度為1.05的濃縮液，60°C時；其中，所述的復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物，二者的質(zhì)量配比為1:1 ;(2)絮凝除雜:于60°C條件下，先按80mL殼聚糖膠體溶液/IOOOmL濃縮液的比例往濃縮液中加入殼聚糖，充分攪拌，再按80mL 101果汁澄清劑水溶液/IOOOmL濃縮液的比例加入101果汁澄清劑水溶液，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液；其中，所述的殼聚糖膠體溶液是體積濃度為1%的醋酸溶液與殼聚糖混合制成的殼聚糖質(zhì)量濃度為1%的醋酸溶液，所述的101果汁澄清劑水溶液是水與101果汁澄清劑混合制成的的101果汁澄清劑質(zhì)量濃度為5%的水溶液； (3)過大孔樹脂柱:將上清液過DlOl樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥即得甘草總黃酮。
作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選方案，步驟(I)所述復合酶溶液的加入量為20ml復合酶溶液/Ig甘草渣。
作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選方案，步驟(I)所述復合酶溶液的質(zhì)量濃度為1%。
作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選方案，步驟(I)所述甘草渣與復合酶溶液混合的溶液的pH值調(diào)至5.0。
作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選方案，步驟(I)所述超聲處理的溫度為50°C，時間為I小時。
本發(fā)明方法較現(xiàn)有技術(shù)具有下列優(yōu)點: (I)眾所周知，甘草渣中主要內(nèi)含有纖維素和木質(zhì)素，同時含有果膠質(zhì)；纖維素、木質(zhì)素和果膠質(zhì)是兩類特性不同的物質(zhì)，而不同的酶的降解作用又不相同。本發(fā)明所述的復合酶正是基于上述因素而設(shè)計的，利用纖維素酶充分降解甘草渣內(nèi)的纖維素和木質(zhì)素，利用果膠酶充分降解其中的果膠質(zhì)，同時結(jié)合超聲波的作用，既能激活酶的活性又能加速黃酮的溶出，從而使甘草總黃酮的提取率顯著提高。
(2)由于甘草渣經(jīng)過超聲酶解后，提取液中存在顆粒較大的懸浮顆粒、重金屬離子等大分子不穩(wěn)定性雜質(zhì)而嚴重影響提取物的純度和品質(zhì)。因此，本發(fā)明絮凝除雜步驟先加入殼聚糖，利用其吸附架橋和對負電荷的中和作用，除去中藥提取液中懸浮顆粒等，然后加入101果汁澄清劑，利用101果汁澄清劑的吸附和聚凝的雙重作用，使所述的大分子雜質(zhì)快速聚凝沉淀；同時，所述的101果汁澄清劑對溶液中的殘留殼聚糖也同樣具有吸附和聚凝作用，進一步消除了殘留的殼聚糖對提取物品質(zhì)的影響。該技術(shù)應(yīng)用于黃酮類成分的除雜，使甘草總黃酮的得率得到大幅度的提升，相比不應(yīng)用該絮凝除雜步驟的提取工藝，得率可提聞5倍左右。
(3)此外，本發(fā)明所述方法還具有過程操作簡單、耗時少、成本低和安全無毒的優(yōu)點。


圖1為甘草苷標準曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例和對比例對本發(fā)明進行詳細的說明，實施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不是對本發(fā)明的限定。
實施例11、提取甘草總黃酮 (I)先做前期的準備工作，即，將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為0.1%的復合酶溶液；取殼聚糖0.8g，加入到80mL濃度為1%醋酸溶液中配成殼聚糖濃度為1%的殼聚糖膠體溶液，備用；取101果汁澄清劑4g，加入到80mL蒸餾水中配成101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入配制的復合酶溶液中，加入量為Ig甘草渣/20ml復合酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到5.0，然后在501:下超聲(50腿2，1601)處理1.011后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05 (60°C)，得到濃縮液。
(3)于60°C時條件下，在上一步所得的IOOOml濃縮液中先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品32g。
2、甘草總黃酮的純度測定 (1)對照品溶液的制備:精密稱取甘草苷對照品5.08mg置5ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得濃度為1.016mg.πιΓ1的對照品儲備溶液。精密吸取Iml對照品溶液于IOml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到濃度為0.1016mg.πιΓ1的對照品溶液待用。
(2)標準曲線的繪制:精密吸取0.1016 mg.πιΓ1的甘草苷對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml分別置IOml容量瓶中，加入10%的KOH溶液0.5ml，放置5min后，用甲醇稀釋至刻度，以相應(yīng)的溶劑作為空白溶液。在波長250 600 nm之間測定吸收光譜，在最大吸收波長為337nm條件下分別測得每個容量瓶中對照品的吸光度。以對照品的濃度為橫坐標(X)值，吸光度為縱坐標(Y)值，在直角坐標系中繪制出6個對應(yīng)點的坐標，然后進行線性回歸得到相關(guān)系數(shù)為r=0.9997的標準曲線為Y=0.018+3.3824x。標準曲線見圖1。
(3)樣品中總黃酮的含量測定:精密稱取甘草總黃酮粗品20mg置于25mL量瓶中，加濃度為50%的乙醇定容，濾過；精密量取續(xù)濾液ImL置于IOml量瓶中，加濃度為50%的乙醇定容；然后從IOml的量瓶中精密量取0.5ml，并按上述步驟(2)所述的方法，加入10%K0H溶液，再用甲醇定容至10 ml得到待測樣品并測定吸光度(本例的測定結(jié)果為0.486);最后，將所測得的吸光度值代入方程Y=0.018+3.3824x，再根據(jù)待測樣品的制備過程計算出待測樣品中總黃酮的量(本例所得32g甘草總黃酮粗品中含總黃酮的量為[(0.486-0.018)/3.3824] X0.5X 10X25X32000/20=27672.6 (mg)，即得甘草總黃酮粗品中總黃酮的含量。本例所得22g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為27.672 + 32X 100%=86.5%。
實施例2 (O將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為0.15%的復合酶溶液；按例I相同的方法配制出殼聚糖濃度為1%的殼聚糖膠體溶液和101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入配制的復合酶溶液中，加入量為Ig甘草渣/25ml復合酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到4.5，然后在401:下超聲(50腿2，1601)處理1.011后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05 (60°C )，得到濃縮液。
(3)于60°C時條件下，在上一步所得IOOOml濃縮液中先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品27g，按實施例1所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得27g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為73.0%。
實施例3 (O將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為0.05%的復合酶溶液；按實施例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為1%的殼聚糖膠體溶液和101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入配制的復合酶溶液中，加入量為Ig甘草渣/20ml復合酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到6.0，然后在60°C下超聲(50KHZ，160W)處理1.5h后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05 (60°C)，得到濃縮液。
(3)于60°C時條件下，在上一步所得IOOOml濃縮液中先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品28g，按實施例1所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得30g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為75.7%。
比較例I (I)將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為0.1%的復合酶溶液。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入上一步配制的復合酶溶液，加入量為Ig甘草渣/IOml復合酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到5.`0，然后在50 °C下超聲(50KHZ，160W)處理1.0h后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05(60°C)。
(3)加入適量乙醇，使含醇量達60 80%，靜置冷藏12小時，取上清液回收乙醇，濃縮，濾過，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品15g，按實施例1所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得15g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為40.5%。
將本比較例與實施例1相比可見，超聲酶解和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將絮凝除雜改用乙醇沉淀去除雜質(zhì)，所得粗品的純度就明顯降低。
比較例2(I)將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為0.1%的復合酶溶液；按實施例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為1%的殼聚糖膠體溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入上一步配制的復合酶溶液，加入量為Ig甘草渣/15ml復合酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到5.0，然后在50 °C下超聲(50KHZ，160W)處理1.0h后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05(60°C)。
(3)于60°C時條件下，加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品19g，按例I所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得19g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為51.3%。
將本比較例與實施例1相比可見，超聲酶解和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將絮凝除雜步驟中的101果汁澄·清劑澄清的步驟略去，所得粗品的純度也明顯降低。
比較例3 (O將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為0.1%的復合酶溶液。按實施例1相同的方法配制出101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入上一步配制的復合酶溶液，加入量為Ig甘草渣/IOml復合酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到5.0，然后在50 °C下超聲(50KHZ，160W)處理1.0h后迅速升溫至90°C，保持1Omin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05(60°C)。
(3)于60°C時條件下，加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品21g，按實施例1所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得21g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為56.8%。
將本比較例與實施例1相比可見，超聲酶解和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將絮凝除雜步驟中的殼聚糖澄清的步驟略去，所得粗品的純度也明顯降低。
比較例4 (I)將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取纖維素酶加入水制備成濃度為0.1%的酶溶液；按例I相同的方法配制出殼聚糖濃度為1%的殼聚糖膠體溶液和101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入上一步配制的酶溶液，加入量為Ig甘草渣/IOml酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到5.0，然后在50 1:下超聲(50腿2，1601)處理1.011后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05 (60°C)。
(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品Hg，按例所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得14g甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為37.8%。
將本比較例與實施例1相比可見，絮凝除雜和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將超聲酶解步驟中的復合酶改用單一的纖維素酶，甘草總黃酮的得率就明顯降低。
比較例5 (I)將甘草渣干燥并粉碎成粗粉；取果膠酶加入水制備成濃度為0.1%的酶溶液；按例I相同的方法配制出殼聚糖濃度為1%的殼聚糖膠體溶液和101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。
(2)取甘草渣粗粉IOOOg，加入上一步配制的酶溶液，加入量為Ig甘草渣/15ml酶溶液，再將溶液的pH值調(diào)到5.0，然后在50 1:下超聲(50腿2，1601)處理1.011后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.12 (60°C)。
(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。
(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥，稱重，得甘草總黃酮粗品10g，按實施例1所述的甘草總黃酮的純度測定方法，測得所得IOg甘草總黃酮粗品的總黃酮含量為60%。。
將本比較例與實施例1相比可見，絮凝除雜和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將超聲酶解步驟中的復合酶改用單一的果膠酶 ，甘草總黃酮的得率也明顯降低。
權(quán)利要求
1.一種從甘草渣中提取甘草黃酮的方法，其特征在于，該方法由以下步驟組成: (1)超聲酶解:取干燥、粉碎后的甘草渣加入質(zhì)量濃度為0.05% 0.15%的復合酶溶液，加入量為10 30ml復合酶溶液/Ig甘草渣，再將溶液的pH值調(diào)至4.5 6，然后在40 60°C下以50KHZ，160W超聲處理0.5 1.5小時后迅速升溫至90°C，保持IOmin滅酶，濾過，收集濾液，減壓濃縮至相對密度為1.05的濃縮液，60°C時；其中，所述的復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物，二者的質(zhì)量配比為1:1 ; (2)絮凝除雜:于60°C條件下，先按80mL殼聚糖膠體溶液/IOOOmL濃縮液的比例往濃縮液中加入殼聚糖，充分攪拌，再按80mL 101果汁澄清劑水溶液/IOOOmL濃縮液的比例加入101果汁澄清劑水溶液，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液；其中，所述的殼聚糖膠體溶液是體積濃度為1%的醋酸溶液與殼聚糖混合制成的殼聚糖質(zhì)量濃度為1%的醋酸溶液，所述的101果汁澄清劑水溶液是水與101果汁澄清劑混合制成的101果汁澄清劑質(zhì)量濃度為5%的水溶液； (3)過大孔樹脂柱:將上清液過DlOl樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥即得甘草總黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從甘草渣中提取甘草黃酮的方法，其特征在于:步驟(I)所述復合酶溶液的加入量為20ml復合酶溶液/Ig甘草渣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從甘草渣中提取甘草黃酮的方法，其特征在于:步驟(I)所述復合酶溶液的質(zhì)量濃度為1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從甘草渣中提取甘草黃酮的方法，其特征在于:步驟(I)所述甘草渣與復合酶溶液混合的溶液的PH值調(diào)至5.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從甘草渣中提取甘草黃酮的方法，其特征在于:步驟(I)所述超聲處理的溫度為50°C， 時間為I小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取甘草黃酮的方法，尤其是涉及一種從甘草渣中提取甘草黃酮的方法。該方法由以下步驟組成(1)超聲酶解取甘草渣干燥、粉碎后在纖維素酶和果膠酶的混合物溶液中超聲處理；(2)絮凝除雜在濃縮液中加入殼聚糖膠體溶液及101果汁澄清劑水溶液；(3)過大孔樹脂柱將上清液過D101樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥即得甘草總黃酮。本發(fā)明所述方法顯著提高了甘草總黃酮的提取率和純度。
文檔編號A61K8/97GK103142682SQ20131006270
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者黃輝球, 劉強, 江潔 申請人:惠州市九惠制藥股份有限公司