專利名稱：一種從甘草中提取純化多種甘草黃酮成分的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從中藥材中提取、純化藥理活性成分的方法，尤其是一種從甘草中提取純化甘草甙、甘草素、異甘草甙、異甘草素葡萄糖芹菜甙等多種黃酮成分的新方法。
背景技術(shù)：
甘草被許多中醫(yī)醫(yī)書稱為“和中劑”、“調(diào)和劑”，幾乎被用在所有的中藥方劑中，用于配合與調(diào)和其它中藥材發(fā)揮作用。為了使中醫(yī)藥走向世界，現(xiàn)在對(duì)各種中藥材包括對(duì)甘草的研究越來(lái)越深入和細(xì)致，與使用全草入藥的傳統(tǒng)作法不同，現(xiàn)在的趨勢(shì)是研究各種中藥材含有哪些活性成分以及這些成分各自獨(dú)立的藥理作用，以便在此基礎(chǔ)上有針對(duì)性的將該種成分單獨(dú)提取出來(lái)用于臨床，以期取得更為明確而顯著的療效。近年藥理試驗(yàn)表明，甘草的許多成分具有很好的抗氧化活性，而現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究結(jié)果顯示，自由基氧化損傷涉及或直接導(dǎo)致了許多重要疾病的發(fā)生。藥理試驗(yàn)還表明，作為甘草主要活性成分的甘草黃酮具有抗?jié)儭⒖鼓[瘤、鎮(zhèn)痙、抗病毒、抗心律失常等生物活性。甘草黃酮是甘草中一大類活性物質(zhì)的總稱，它又由許多不同的成分組成，每種成分的藥理作用又各自不同，為了研究和應(yīng)用需要提取純化各種不同的甘草黃酮成分。
現(xiàn)有技術(shù)中公開號(hào)為1477104的專利文件文獻(xiàn)1和“黃甘草化學(xué)成分的研究”(載《藥學(xué)學(xué)報(bào)》，1989，24(7)525-531)文獻(xiàn)2與“黃甘草的化學(xué)成分(II)”(載《植物學(xué)報(bào)》，1991，33(4)314-322)文獻(xiàn)32篇文章，介紹了提取純化各種不同黃酮成分的方法，但是他們的方法都使用了有毒有害的有機(jī)溶劑例如三氯甲烷、二氯甲烷等，一方面會(huì)污染環(huán)境，另一方面在提取物中的殘留也會(huì)使提取物的應(yīng)用受到限制。再有文獻(xiàn)1的方法使用了昂貴的專用超濾設(shè)備和膜材料，文獻(xiàn)2、3的方法工藝流程復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，得率低，需要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，使得它們的生產(chǎn)成本都比較高。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)過(guò)程中不使用有毒有害的三氯甲烷、二氯甲烷，同時(shí)工藝流程簡(jiǎn)單，成本較低廉的提取純化甘草甙、甘草素、異甘草甙、異甘草素葡萄糖芹菜甙等黃酮成分的方法，該方法既可以減少對(duì)提取物與環(huán)境的污染又可以提高經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下(參見附圖“工藝流程圖”)1)預(yù)處理a)將甘草粉碎；b)使用70-80％乙醇常溫超聲提取兩次；c)用200目尼龍濾布粗濾，5,000rmp離心10分鐘左右；d)離心上清液減壓濃縮(0.05MPa，50℃)，蒸去乙醇至1/10體積。
2)交聯(lián)聚苯乙烯大孔吸附樹脂柱吸附、洗脫a)濃縮上清液上大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂柱中填充交聯(lián)聚苯乙烯樹脂(物理參數(shù)粒徑范圍0.3～1.25mm，比表面100～120m2/g，平均孔徑280～300，孔容0.78～0.82ml/g)；b)依次用水、10-50％乙醇梯度洗脫。
3)繼續(xù)不同工藝過(guò)程以分別純化甘草甙、甘草素、異甘草甙、異甘草素葡萄糖芹菜甙等黃酮成分，其中3A)取30％乙醇洗脫液，經(jīng)4℃冷藏，析出甘草甙。
3B)a)取30％乙醇洗脫液，經(jīng)4℃冷藏，析出甘草甙；b)加入含有5％濃硫酸、40％甲醇的水溶液回流水解1.5小時(shí)；c)過(guò)Sephadex LH-20柱；d)依次用水，10-50％甲醇梯度洗脫；e)50％甲醇洗脫液經(jīng)4℃冷藏，析出甘草素。
3C)a)取50％乙醇洗脫液，濃縮，蒸去乙醇；b)濃縮液上80-100目聚酰胺柱；c)依次用水、5-60％甲醇梯度洗脫；d)取60％甲醇洗脫液，減壓濃縮；e)過(guò)Sephadex LH-20柱；f)以40-70％甲醇梯度洗脫；g)自上柱液在柱子上被分成兩個(gè)黃色的色帶起，分別收集洗掉兩色帶的70％甲醇洗脫液并經(jīng)減壓濃縮，分別獲得異甘草甙、異甘草素葡萄糖芹菜甙。
有益效果1、本發(fā)明完全不使用二氯甲烷，三氯甲烷等任何有毒有害的有機(jī)溶劑，可以保證提取物和環(huán)境不受污染。
2、我們使用本發(fā)明與使用文獻(xiàn)1和文獻(xiàn)2、3的方法做了提取對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果有機(jī)溶劑的消耗量分別如下(以提取1公斤甘草計(jì)算)文獻(xiàn)1方法95％乙醇(10L)、三氯甲烷(3000mL)、甲醇(300mL)。
文獻(xiàn)2、3方法95％乙醇(15L)、石油醚(800mL)、二氯甲烷(2000mL)、乙酸乙酯(1000mL)、正丁醇(1000mL)、甲醇(2000mL)。
本發(fā)明95％乙醇(10L)，甲醇(2000mL)。
可以看出本發(fā)明可以節(jié)約大量的有機(jī)溶劑，因而降低生產(chǎn)成本。
3、本發(fā)明相對(duì)文獻(xiàn)1而言，無(wú)需專用超濾設(shè)備，可以大大降低生產(chǎn)成本


附圖為從甘草中提取純化多種甘草黃酮成分的工藝流程圖。本發(fā)明的方法可以提取純化至少4種甘草黃酮成分，分別是甘草甙、甘草素、異甘草甙和異甘草素葡萄糖芹菜甙。它們提取純化工藝的前一部分是共同的，都要經(jīng)過(guò)由甘草提取并濃縮甘草醇提液，上交聯(lián)聚苯乙烯大孔吸附樹脂柱吸附，水、10-50％乙醇梯度洗脫。后一部分則是取不同濃度的乙醇洗脫液，分別再繼續(xù)不同的工藝過(guò)程，然后獲得4種不同的甘草黃酮成分方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一(參見附圖“工藝流程圖”)取烏拉爾甘草1kg粉碎，置入10000mL 70％乙醇常溫超聲提取兩次，每次30min，用200目尼龍濾布粗濾，5,000rmp離心10分鐘，離心上清液減壓濃縮(0.05MPa，50℃)，蒸去乙醇至1/10體積，取濃縮上清液上大孔樹脂柱吸附(填充交聯(lián)聚苯乙烯樹脂)，依次用水、10-30％乙醇梯度洗脫，洗脫流速為1.5BV/h。使用HPLC或TLC檢識(shí)流出液，洗至在流出液中檢不出主要物質(zhì)時(shí)止。取30％乙醇洗脫液經(jīng)4℃冷藏，析出甘草甙14g。
實(shí)施例二(參見附圖“工藝流程圖”)取前實(shí)施例得出的甘草甙1g，置入50毫升含有5％濃硫酸，40％甲醇的水溶液回流水解1.5小時(shí)，減壓濃縮(0.05MPa，50℃)，蒸去甲醇至1/10體積，過(guò)Sephadex LH-20柱，依次用水，10-50％甲醇常壓洗脫，使用HPLC或TLC檢識(shí)流出液，洗至在流出液中檢不出主要物質(zhì)時(shí)止。取50％甲醇洗脫液經(jīng)4℃冷藏，析出白色針晶甘草素0.25g。
實(shí)施例三(參見附圖“工藝流程圖”)取烏拉爾甘草1kg粉碎，置入10000mL 80％乙醇常溫超聲提取兩次，每次30min，用200目尼龍濾布粗濾，5,000rmp離心10分鐘，離心上清液減壓濃縮(0.05MPa，50℃)，蒸去乙醇至1/10體積，取濃縮上清液上大孔樹脂柱吸附，依次用水、10-50％乙醇梯度洗脫，取50％乙醇洗脫液，濃縮蒸去乙醇，濃縮液上80-100目聚酰胺柱，依次用水、5-60％甲醇常壓梯度洗脫，取60％甲醇洗脫液減壓濃縮，過(guò)Sephadex LH-20柱，以40-70％甲醇常壓梯度洗脫，自上柱液在柱子上被分成兩個(gè)黃色的色帶起開始，收集70％甲醇洗脫液，將洗出兩個(gè)黃色色帶的洗脫液分別收集，經(jīng)減壓濃縮分別得到異甘草甙和異甘草素葡萄糖芹菜甙。
權(quán)利要求
1.一種從甘草中提取、純化甘草甙的方法，其特征在于依次包括如下步驟，1)提取并濃縮甘草醇提液將甘草粉碎，使用乙醇超聲提取，粗濾，離心，離心上清液減壓濃縮；2)大孔吸附樹脂柱吸附、洗脫濃縮上清液上交聯(lián)聚苯乙烯大孔吸附樹脂柱吸附，依次用水、10-50％乙醇梯度洗脫；3)取30％乙醇洗脫液，經(jīng)4℃冷藏，析出甘草甙。
2.一種從甘草中提取、純化、水解制備甘草素的方法，其特征在于依次包括如下步驟，1)提取并濃縮甘草醇提液將甘草粉碎，使用乙醇超聲提取，粗濾，離心，離心上清液減壓濃縮；2)大孔吸附樹脂柱吸附、洗脫濃縮上清液上交聯(lián)聚苯乙烯大孔吸附樹脂柱吸附，依次用水、10-50％乙醇梯度洗脫；3)取30％乙醇洗脫液，經(jīng)4℃冷藏；4)取析出物加入濃硫酸-甲醇回流水解；5)過(guò)SephadexLH-20柱；6)依次用水，10-50％甲醇梯度洗脫；7)取50％甲醇洗脫液經(jīng)4℃冷藏，析出甘草素。
3.一種從甘草中提取、純化異甘草甙和異甘草素葡萄糖芹菜甙的方法，其特征在于依次包括如下步驟，1)提取并濃縮甘草醇提液將甘草粉碎，使用乙醇超聲提取，粗濾，離心，離心上清液減壓濃縮；2)大孔吸附樹脂柱吸附、洗脫濃縮上清液上交聯(lián)聚苯乙烯大孔吸附樹脂柱吸附，依次用水、10-50％乙醇梯度洗脫；3)取50％乙醇洗脫液，濃縮，蒸去乙醇；4)濃縮液上80-100目聚酰胺柱；5)依次用水、5-60％甲醇梯度洗脫；6)取60％甲醇洗脫液，減壓濃縮；7)過(guò)Sephadex LH-20柱；8)以40-70％甲醇梯度洗脫；9)分別收集70％甲醇洗脫液的特定部分并濃縮；10)分別獲得異甘草甙、異甘草素葡萄糖芹菜甙。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的從甘草中提取、純化甘草黃酮成分的方法，其特征在于在所述步驟1)中的乙醇超聲提取是使用70-80％乙醇常溫超聲提取兩次，每次30min，離心上清液減壓濃縮是蒸去乙醇至不大于原來(lái)1/10的體積。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的從甘草中提取、純化甘草黃酮成分的方法，其特征在于在所述步驟2)中大孔樹脂柱填充的是交聯(lián)聚苯乙烯樹脂(物理參數(shù)粒徑范圍0.3～1.25mm，比表面100～120m2/g，平均孔徑280～300，孔容0.78～0.82ml/g)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從甘草中提取、純化水解制備甘草素的方法，其特征在于在所述步驟4)中加入的是含有5％濃硫酸、40％甲醇的水溶液，回流水解1.5小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從甘草中提取、純化異甘草甙和異甘草素葡萄糖芹菜甙的方法，其特征在于所述步驟9)中分別收集70％甲醇洗脫液的特定部分并濃縮，是指從上柱液在柱子上被分成兩個(gè)黃色的色帶起，開始分別收集洗掉兩色帶的那兩部分70％甲醇洗脫液并濃縮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從甘草中提取純化多種黃酮成分的新方法。該方法不使用有毒有害的三氯甲烷、二氯甲烷”，可以保證提取物和環(huán)境不受污染，同時(shí)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)化生產(chǎn)中。該方法包括如下步驟1.提取并濃縮甘草醇提液；2.大孔樹脂柱吸附，水、乙醇梯度洗脫；3.留取不同濃度乙醇洗脫液，分別繼續(xù)不同工藝過(guò)程，包括冷藏，加入濃硫酸－甲醇回流水解，上80－100目聚酰胺柱，水、甲醇梯度洗脫，過(guò)SephadexLH－20柱，水、甲醇再次梯度洗脫等，最后分別獲得甘草甙、甘草素、異甘草甙、異甘草素葡萄糖芹菜甙等多種黃酮成分。
文檔編號(hào)C07C45/79GK1865273SQ20051007247
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月16日
發(fā)明者傅博強(qiáng), 王小如 申請(qǐng)人:廈門倍爾思生化科技有限公司