專利名稱：具有降血糖作用的紅豆杉提取物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物提取物，具體涉及從南方紅豆杉枝葉中制備得具有降血糖作用的有效部位及有效成分。
背景技術：
當今，在全球范圍內糖尿病已經成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后威脅人類的“第三號殺手”，無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，糖尿病的發(fā)病率都在急劇上升。據世界衛(wèi)生組織公布的資料，1985年全世界有3000萬糖尿病患者，到1997年已增加至1. 35億。據國際權威糖尿病流行病學專家預測，到2050年，全球糖尿病人將達3億人，亞洲地區(qū)患者增長幅度非常快，我國的糖尿病患者總數(shù)已有6000萬以上，預計每年發(fā)病增長率超過6%。此病不僅給患者帶來極大的痛苦，生活質量受到很大影響，甚至威脅患者的生命，還給社會帶來沉重的經濟負擔。因此，糖尿病作為一種嚴重的非傳染性、慢性疾病，已成為世界各國關注的重大公共衛(wèi)生問題。糖尿病作為一種伴隨終身的慢性疾病，患者需要長期服藥，如何合理用藥顯的尤其重要，而降糖藥物就像一把雙刃劍，既能治病，也存在一定副作用?？诜堤撬帲缁酋ｋ孱?、雙胍類等藥物是治療糖尿病、調節(jié)血糖的首選藥物，嚴格掌握其適應證、作用機制、合理的聯(lián)合應用等非常重要。然而這些藥物具有一定的副作用，要嚴格在醫(yī)生的指導下合理使用。

紅豆杉科(Taxaceae )紅豆杉屬(Taxus. L )植物包括南方紅豆杉[71. mairei var.mairei (Lemcc et Level) cheng et L. K. Fu]及西藏紅豆杉(, Zucc)、云南
yummiiGiisis Cheng et. L. K. Fu)、中國紅豆杉[T1.(Pilger)Rehd.]、
東北紅豆杉(71. cuspidata. Sieb. et. Zucc.)和曼地亞紅豆杉(71. ),紅豆杉在開發(fā)抗腫瘤藥物中應用較多，但未見有在開發(fā)治療糖尿病藥物的報道。

發(fā)明內容
發(fā)明目的作為藥用、綠化和觀賞植物，現(xiàn)有大量的紅豆杉栽培，每年產生大量的廢棄枝葉，本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術的不足，實現(xiàn)紅豆杉資源有效研究開發(fā)與利用，利用現(xiàn)代分離技術并結合大量藥學實驗篩選，提供一種高效的防治糖尿病的紅豆杉提取物及其制備方法與應用。技術方案為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術方案為
一種具有降血糖作用的紅豆杉提取物，它通過以下方法制備得到
(1)取紅豆杉枝葉，用水或乙醇提取，濃縮得濃縮物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物；
(2)取步驟(I)乙酸乙酯萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物；
或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物；
(3)取步驟(I)正丁醇萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類的混合物；
或正丁醇萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類的混合物。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物，步驟(2)制備得到的精制雙黃酮類化合物包括金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果雙黃酮和穗花雙黃酮。所述的酚酸類化合物包括3，4- 二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸和3-甲氧基-4-苯甲酸。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物，步驟(3)制備得到的精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類化合物包括金松雙黃酮及其苷、銀杏黃素及其苷、異銀杏黃素及其苷、白果雙黃酮及其苷、穗花雙黃酮及其苷類化合物。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物，所述提取物和藥學上可接受的載體制成膠囊劑、片劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、噴霧劑、脂肪乳劑、栓劑或微囊劑型、外用制劑的藥物。本發(fā)明提供的具有降血糖作用的紅豆杉提取物制成片劑時，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，整粒，然后壓片制成片劑。本發(fā)明提供的具有降血糖作用的紅豆杉提取物制成顆粒劑時，把各原料的提取物和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。本發(fā)明提供的具有降血糖作用的紅豆杉提取物制成膠囊劑時，把各原料的提取物和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發(fā)明提供的具 有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，其包括以下步驟
(1)取紅豆杉枝葉，用水或乙醇提取，濃縮得濃縮物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物；
(2)取步驟(I)乙酸乙酯萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物；
或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物；
(3)取步驟(I)正丁醇萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類混合物；
或正丁醇萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類的混合物。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，步驟(I)所述的提取方法為浸潰提取法、超聲提取法或加熱回流提取法。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，步驟(2)所述的大孔樹脂為AB-8、DlOl大孔吸附樹脂；聚酰胺的粒徑為15-60目。以上所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，乙醇提取乙醇的濃度為30-99%o本發(fā)明制備得到的將得到的精制雙黃酮類提取物用反復硅膠柱法，得到的精制雙黃酮類有效部位進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫分別得到金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果雙黃酮、穗花雙黃酮單體化合物。本發(fā)明提供的具有降血糖作用的紅豆杉提取物在制備降血糖藥物中的應用。有益效果本發(fā)明提供的組合物和現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明所用的原材料為紅豆杉的枝葉，現(xiàn)有技術大量枝葉均都廢棄，本發(fā)明變費為寶，原材料來源豐富，價格低廉，可實現(xiàn)工業(yè)化生產。2.本發(fā)明通過現(xiàn)代化分離純化方法，結合大量體內外藥理實驗篩選，優(yōu)選得到具有很好降血糖作用的精制紅豆杉總精制雙黃酮類部位，該有效部位成分清楚，活性強，藥效好，質量安全可控。3.本發(fā)明提供的具有降血糖作用的紅豆杉提取物可方便和不同的賦形劑制備成不同的藥物劑型，能方便臨床應用。同時本發(fā)明提供的紅豆杉提取物的制備方法，工藝設計合理、提取有效成分含量高，可操作性強，適合工業(yè)化大生產。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更·好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1
一種具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其通過以下方法制備得到
南方紅豆杉枝葉5 kg,切成飲片規(guī)格，用10倍體積量95%乙醇，8倍50%醇各回流提取一次，合并藥液將藥液濃縮至無醇味，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物上AB-8型大孔樹脂，用蒸餾水和0%-80%乙醇洗脫，合并60%-70%乙醇洗脫液減壓濃縮、冷凍干燥即得精制雙黃酮類和酚酸類化合物。
用90%乙醇溶解有效部位，用紫外分光光度法，將樣品在350-600nm波長處掃描。在504nm處有最大吸收，確定測定波長為504nm。以穗花雙黃酮為對照品，測出總黃酮含量為72%。經HPLC測定測得總黃酮含有五個雙黃酮，依次為金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果雙黃酮、穗花雙黃酮。所述的酚酸類化合物包括3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸和3-甲氧基-4-苯甲酸。實施例2
一種具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其通過以下方法制備得到
南方紅豆杉枝葉5 kg,切成飲片規(guī)格，用8倍體積量95%乙醇回流提取3次，合并藥液將藥液濃縮至無醇味，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物上粒徑為15-60目的聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物；按實施例1方法測得總黃酮含量為70%。經HPLC測定測得總黃酮含有五個雙黃酮依次為金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果雙黃酮、穗花雙黃酮，所述的酚酸類化合物包括3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸和3-甲氧基-4-苯甲酸。實施例3
一種具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其通過以下方法制備得到
南方紅豆杉枝葉5 kg,切成飲片規(guī)格，用8倍體積量95%乙醇回流提取3次，合并藥液將藥液濃縮至無醇味，先用石油醚萃取除去色素，再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物。正丁醇萃取物上AB-8型大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其苷類混合物；按實施例1方法測得總黃酮含量為70%。經HPLC測定測得總黃酮含五個雙黃酮及其苷類依次為金松雙黃酮及其苷、銀杏黃素及其苷、異銀杏黃素及其苷、白果雙黃酮及其苷、穗花雙黃酮及其苷。實施例4
一種具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其通過以下方法制備得到
南方紅豆杉枝葉5 kg,切成飲片規(guī)格，用10倍體積量90%乙醇回流提取3次，合并藥液將藥液濃縮至無醇味，先用石油醚萃取除去色素，再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物。正丁醇萃取物上粒徑為15-60目的聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其苷類化合物，按實施例1方法測得總黃酮含量為69%。經HPLC測定測得總黃酮含有五個雙黃酮及其苷類依次為金松雙黃酮及其苷、銀杏黃素及其苷、異銀杏黃素及其苷、白果雙黃酮及其苷、穗花雙黃酮及其苷。實施例5南方紅豆杉不同部位降血糖的活性篩選實驗
糖尿病模型小鼠模型的建立取雄性昆明小鼠100只，隨機取10只為空白組?？瞻捉M給予標準顆粒飼料直至試驗結束，其余小鼠喂食高脂飼料(配方顆粒標準飼料74. 5%，蔗糖10%，豬油10%，蛋黃粉5%，膽固醇0. 5%)。喂養(yǎng)4周后，除空白組外，小鼠禁食不禁水18 h,腹腔注射170 mg/kg鏈脲霉素。72h后，尾靜脈取血測定小鼠空腹血糖值，血糖值在10-25mmol/L之間并出現(xiàn)多飲多尿癥狀的小鼠被選為糖尿病模型小鼠。給藥與測定將糖尿病小鼠按體重、血糖隨即分成6組，即為模型組、陽性藥組、南方紅豆杉乙醇提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位。各組的給藥劑量按生藥量(1. 5 gkg—1 Cf1)折算，按以下計量灌胃，南方紅豆杉石油醚部位(52. 5 mgkgH、乙酸乙酯部位(52. 5 Ingkg-1CT1)、正丁醇部位(52. 5 Ingkg-1CT1 )、水部位(52. 5 mgkg^d^)o陽性藥為二甲雙胍，模型、空白組給予等體積的0. 5%羧甲基纖維素鈉。每天灌胃I次，連續(xù)給藥3周。用羅氏Advantange血糖儀；羅康泉Advantange血糖試紙定期測量小鼠血糖。實驗結果顯示南方紅豆沙乙酸乙酯部位與正丁醇部位能明顯降低糖尿病小鼠的空腹血糖，為降血糖的有效部位。具體實驗結果如表I所示。表I南方紅豆杉不同提取部位對糖尿病模型小鼠FBG的影響(置土s，n=10)
權利要求
1.一種具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其特征在于它通過以下方法制備得到 (1)取紅豆杉枝葉，用水或乙醇提取，濃縮得濃縮物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物； (2)取步驟(I)乙酸乙酯萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物； 或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類和酚酸類化合物的混合物； (3)取步驟(I)正丁醇萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類的混合物； 或正丁醇萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類的混合物。
2.根據權利要求1所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其特征在于步驟(2)得到的精制雙黃酮類化合物包括金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果雙黃酮和穗花雙黃酮。
3.3、根據權利要求1所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其特征在于步驟(3)得到的精制雙黃酮類及其雙黃酮苷類化合物包括金松雙黃酮及其苷、銀杏黃素及其苷、異銀杏黃素及其苷、白果雙黃酮及其苷、穗花雙黃酮及其苷類化合物。
4.根據權利要求1所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物，其特征在于所述提取物和藥學上可接受的載體制成膠囊劑、片劑、滴丸、顆粒劑、脂肪乳劑、栓劑、注射劑或微囊劑型的藥物。
5.權利要求1所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)取紅豆杉枝葉，用水或乙醇提取，濃縮得濃縮物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物； (2)取步驟(I)乙酸乙酯萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類的混合物； 或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類的混合物； (3)取步驟(I)正丁醇萃取物上大孔樹脂柱，用濃度為50-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其苷類混合物； 或正丁醇萃取物上聚酰胺柱進行柱層析分離，用濃度為10-80%的乙醇進行梯度洗脫，得到精制雙黃酮類及其苷類的混合物。
6.根據權利要求5所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的提取方法為浸潰提取法、超聲提取法或加熱回流提取法。
7.根據權利要求5所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物的制備方法，其特征在于，步驟⑵所述的大孔樹脂為AB-8或DlOl大孔吸附樹脂；聚酰胺的粒徑為15-60目。
8.權利要求1至3任一項所述的具有降血糖作用的紅豆杉提取物在制備降血糖藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了從紅豆杉科植物枝葉中，采用現(xiàn)代分離手段提取得到具有很好降血糖作用的紅豆杉提取物，該有效部位中精制雙黃酮類的含量可達50%~80%，其中主要有效成分為金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果雙黃酮、穗花雙黃酮。經實驗研究表明，該紅豆杉提取物不僅可顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，而且具有明顯降低糖尿病大鼠血糖的作用，能夠減輕或抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，有望開發(fā)成新的降血糖藥物。
文檔編號A61K31/192GK103054912SQ20131003101
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權日2013年1月28日
發(fā)明者李祥, 陳建偉, 薛平, 湯彬, 姚曉 申請人:南京中醫(yī)藥大學