專(zhuān)利名稱(chēng)：豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種專(zhuān)用于豬支原體肺炎疫苗的稀釋劑，特別是一種能適用于豬支原體肺炎活疫苗和滅活疫苗、能特異性增強(qiáng)疫苗保護(hù)能力的豬支原體肺炎疫苗的稀釋劑。
背景技術(shù)：
豬支原體肺炎，俗稱(chēng)豬氣喘病，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一種豬的慢性呼吸道傳染性疾病，主要癥狀為咳嗽和氣喘。該病主要引起豬的飼料轉(zhuǎn)化率下降和生長(zhǎng)受阻，發(fā)病率高、死亡率低。豬支原體肺炎在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。豬支原體肺炎是一種頑固性慢性傳染病，藥物治療效果不夠理想，停藥后容易復(fù)發(fā)，該病一旦在豬場(chǎng)流行，就很難根除。因此，預(yù)防、控制和凈化豬支原體肺炎須采取早期診斷、及時(shí)隔離、抗生素治療或淘汰病豬、疫苗預(yù)防、全進(jìn)全出、嚴(yán)格消毒等綜合性措施，其中疫苗預(yù)防在控制豬支原體肺炎中起著關(guān)鍵性的作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于該病的防治主要依靠國(guó)外進(jìn)口滅活疫苗，主要公司及產(chǎn)品包括美國(guó)輝瑞動(dòng)物保健品公司開(kāi)發(fā)的瑞倍適(RespiSuree)、瑞倍適-旺(RespiSure 0ne)、海博萊公司的喜可舒(MYPRAVAC SUIS )、先靈葆雅公司的安百克(M+PAC )、勃林格殷格翰公司的茵格發(fā)豬支原體肺炎滅活疫苗(IngelvacIhy0)等等，其中以瑞倍適滅活疫苗應(yīng)用最為廣泛。目前占領(lǐng)主導(dǎo)市場(chǎng)的滅活疫苗在臨床使用上雖然顯示出明顯功效，但仍不能達(dá)到令人滿(mǎn)意的完全保護(hù)效果。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，由于體內(nèi)自然感染和體外培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境不同，豬肺炎支原體在體外無(wú)細(xì) 胞培養(yǎng)條件下，有一些基因不能有效表達(dá)，而這些差異表達(dá)的蛋白往往與病原菌的感染過(guò)程密切相關(guān)。因此體外培養(yǎng)病原菌制備疫苗可能會(huì)缺失一部分重要的免疫原，使得保護(hù)譜 完全，不能達(dá)到類(lèi)似動(dòng)物感染康復(fù)后所獲得的保護(hù)效果。P97蛋白是豬肺炎支原體的主要黏附因子，介導(dǎo)豬肺炎支原體侵入機(jī)體，繼而誘發(fā)纖毛脫落炎癥應(yīng)答等病理變化。尤其是其中包含的重復(fù)片段區(qū)P97R1更被證明為豬肺炎支原體黏附細(xì)胞的關(guān)鍵區(qū)域。研究者將P97R1作為靶片段開(kāi)發(fā)基因工程疫苗，可以使動(dòng)物獲得明顯的攻毒保護(hù)能力，證明P97R1片段是豬肺炎支原體的重要免疫原，單獨(dú)可誘導(dǎo)有效免疫保護(hù)效力。而同時(shí)，多項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)免疫現(xiàn)有的幾種商品化豬支原體肺炎滅活疫苗后豬體無(wú)法產(chǎn)生P97R1抗體，說(shuō)明P97 (含P97R1片段)，無(wú)法在體外培養(yǎng)條件下大量表達(dá)，對(duì)P97R1抗原免疫的缺失成為現(xiàn)有豬支原體肺炎疫苗的一大缺陷。因此通過(guò)另外補(bǔ)充P97R1抗原將能進(jìn)一步完善豬支原體肺炎疫苗的抗原譜，增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)力。基于此，本研究擬開(kāi)發(fā)一種含有P97R1抗原的新型豬支原體肺炎疫苗稀釋劑，通過(guò)添加P97R1抗原補(bǔ)充疫苗保護(hù)譜，同時(shí)采用制備免疫刺激復(fù)合物的方法增強(qiáng)P97R1及疫苗本身的細(xì)胞及體液免疫刺激能力。另一方面，該稀釋劑還可能同時(shí)含有適用于豬支原體肺炎疫苗的其他水性佐劑成分，進(jìn)一步提高疫苗免疫效力。免疫刺激復(fù)合物(immunostimulatingcomplex, ISC0M)是由 Quil A (阜苷活性成分)、膽固醇、磷脂酰膽堿和抗原成分相互作用形成的納米級(jí)籠狀顆粒物。由于其含有免疫增強(qiáng)劑活性成分Quil A，同時(shí)為納米級(jí)顆粒，因而能夠有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，顯著增加嵌入抗原的免疫刺激能力。研究證明ISCOM能有效地活化輔助型T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)也能夠有效增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答水平。另一方面由于與膽固醇和磷脂酰膽堿相互作用后Quil A的毒副反應(yīng)大大降低，因此ISCOM也具有良好的安全性。另外，研究發(fā)現(xiàn)將不含有抗原的免疫刺激復(fù)合物即免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM-matrix)和疫苗混合后也同樣能夠起到免疫佐劑的效果，因此我們將所制備的含ISC0M-P97R1的專(zhuān)用稀釋劑溶解或稀釋豬支原體肺炎疫苗，既能夠獲得對(duì)P97R1抗原的有效保護(hù)，同時(shí)也能夠增強(qiáng)活疫苗和滅活疫苗本身的免疫刺激能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于公開(kāi)一種專(zhuān)用于豬支原體肺炎疫苗的稀釋劑，特別是一種能適用于豬支原體肺炎活疫苗、滅活疫苗，能特異性增強(qiáng)疫苗保護(hù)效力的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為上述疫苗專(zhuān)用稀釋劑提供一種操作簡(jiǎn)單方便的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開(kāi)該疫苗稀釋劑在豬支原體肺炎疫苗免疫中的應(yīng)用。本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑，主要含有以重組P97R1蛋白制備的免疫刺激復(fù)合物。所述稀釋劑的每ml溶液中ISC0M-P97R1各成分含量為:Quil A 0.1-1毫克、膽固醇0.02-0.2毫克、磷脂酰膽堿0.02-0.2毫克、P97R1抗原0.4-4毫克。其具體制備方法為:取磷酸鹽緩沖液溶解得到的10 mg/ml的P97R1溶液3 ml，向其中加入Mega-1O粉末，使Mega-1O濃度為2%，于37°C下放置12 h。然后向其中加入脂類(lèi)混合物儲(chǔ)備液150 μ I(含
10mg/ml磷脂酰膽堿和10 mg/ml膽固醇的20% Mega-1O溶液)和QuilA溶液1350 μ I (含5.56mg/mlQuilA的磷酸鹽緩沖液`)，混勻后于室溫下放置2 h。冰浴超聲處理30min，再于室溫放置2h，然后轉(zhuǎn)移至透析袋中以磷酸鹽緩沖液為外液于4 °C透析72 h，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌即得到Quil A濃度為1.67mg/ml的ISC0M-P97R1母液。配制豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋液時(shí)，取ISC0M-P97R1母液適量，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行一定稀釋?zhuān)吹玫矫縨l溶液中含有Quil A為0.1-1毫克的ISC0M-P97R1的疫苗稀釋液。本發(fā)明中涉及到的重組P97R1蛋白是豬肺炎支原體黏附因子P97的關(guān)鍵抗原片段Rl片段的重組蛋白。用pET-32a(+)載體表達(dá)的重組P97R1蛋白的基因序列(SEQ ID N0.1)為:
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATC
CTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATA
TCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTA
TCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAA
GAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGT
GCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTA
CCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAGCTAAACCTGAAGCA
GCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGC
TAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCGGCTAAACCTGAAGCAGCTAAACCAGTAGCAGCTAAACCAGTTGCTACTAATACTAATACTAATACTGGCTTTTCACTTACAAATAAACCAAAAGAAGACTATTTCCCAATGGCTTAA
蛋白序列(SEQ ID N0.2)為:
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYG
IRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSP
DLGTDDDDKAMADIGSEFLPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKP
VATNTNTNTGFSLTNKPKEDYFPMA
重組P97R1蛋白具體的制備方法可以為:設(shè)計(jì)引物從豬肺炎支原體基因組中擴(kuò)增P97R1 基因片段。上游引物為 5 ‘-CCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG-3’ (SEQ ID N0.3);下游引物為 5 ‘-GCGAAGCTTAAGCCATTGGGAAATAGTCT-3’(SEQ ID N0.4)。上下游引物中分別包含EcoR I位點(diǎn)和歷fli/III位點(diǎn)。擴(kuò)增片段經(jīng)I和歷fli/III雙酶切后插入pET-32a(+)載體中，得到表達(dá)重組P97R1蛋白的原核質(zhì)粒載體pET-32a (+) -P97R1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)，篩選陽(yáng)性克隆，DNA測(cè)序驗(yàn)證，得到表達(dá)重組P97R1蛋白重組基因工程菌。工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，裂解取上清液，經(jīng)鎳柱親和層析純化得到重組P97R1蛋白。詳細(xì)制備步驟可參見(jiàn):劉茂軍，邵國(guó)青，張映，聶向庭.豬肺炎支原體P97基因抗原決定簇Rl區(qū)的克隆與表達(dá).江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2005, 21 (3):207-211.本發(fā)明中所涉及的重組P97R1蛋白，包括將P97R1基因裝入各種表達(dá)載體表達(dá)得到的含P97R1及P97R1部分片段的重組融合蛋白。本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑，除ISC0M-P97R1外，還可能含有其他水性佐劑，包含左旋咪唑、或/和黃芪多糖、或/和卡波姆。所述稀釋劑的每ml溶液中含有左旋咪唑2-20毫克、或/和黃芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克，其余為磷酸鹽緩沖液。制備方法為先配制高濃度母液，再將各種母液混合均勻，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度即得，具體步驟如下:
(1)ISC0M-P97R1母液的制備:同上所述方法制備得到Quil A濃度為1.67mg/ml的ISC0M-P97R1 母液；
(2)左旋咪唑母液的制備:取適量的左旋咪唑溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到200mg/ml的左旋咪唑母液；
(3)黃芪多糖母液的制備:取適量的黃芪多糖溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到250mg/ml的黃芪多糖母液；
(4)卡波姆母液的制備:取適量卡波姆(卡波姆974P或971P)溶解于蒸餾水，室溫放置過(guò)夜使其充分溶脹得到20mg/ml的卡波姆溶液，加入3M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至
7.2,加適量蒸懼水調(diào)節(jié)卡波姆濃度為15mg/ml,得到15mg/ml的卡波姆母液；
(5)豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備
以IOOml稀釋劑為例進(jìn)行配制時(shí)，取Quil A濃度為1.67mg/ml的ISC0M-P97R1母液適量，同時(shí)取200mg/ml的左旋咪唑母液、或/和250mg/ml的黃芪多糖母液、或/和15mg/ml的卡波姆母液中的一種或多種各適量，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行一定稀釋?zhuān)吹玫矫縨l溶液中含有Quil A 0.1-1毫克的ISCOM基質(zhì)、左旋咪唑2_20毫克、或/和黃芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。

本發(fā)明中涉及到的水性佐劑包括左旋咪唑、黃芪多糖、卡波姆。經(jīng)典的油包水乳劑型佐劑具有較強(qiáng)的毒副作用，而水性佐劑具有較好的安全性，同時(shí)對(duì)于活疫苗而言，采用合適配方的水性佐劑能夠避免油相對(duì)活疫苗活力的損傷作用。左旋咪唑是一種廣譜驅(qū)蟲(chóng)藥，作為常用的疫苗佐劑，具有較強(qiáng)的直接免疫刺激能力；中草藥多糖是常用的免疫增強(qiáng)劑，其中黃芪多糖能夠較好地激活細(xì)胞免疫應(yīng)答；卡波姆為高分子物質(zhì)，974P和971P是常用于疫苗佐劑的卡波姆型號(hào)，具有良好的儲(chǔ)庫(kù)作用，能夠幫助疫苗抗原實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間免疫。所述稀釋劑在豬支原體肺炎疫苗中應(yīng)用時(shí)，每頭份豬支原體肺炎疫苗使用所述豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑0.5-3毫升，優(yōu)選使用劑量為每頭份豬支原體肺炎疫苗使用所述豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑1-2毫升。本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑專(zhuān)門(mén)用于豬支原體肺炎疫苗，包括活疫苗和滅活疫苗。目前市場(chǎng)上的豬支原體肺炎疫苗分為滅活疫苗和活疫苗兩種，其中進(jìn)口滅活疫苗占領(lǐng)了絕大部分市場(chǎng)。滅活疫苗所采用的佐劑包括經(jīng)典的白油佐劑即油包水體系、水包油體系、水包油包水體系和全水相體系四種。油包水佐劑體系效果最好,但安全性相對(duì)較差，豬用疫苗已逐漸向水包油包水、水包油及全水相體積轉(zhuǎn)變。這些體系通針性好，容易注射，且安全性好。由于滅活疫苗在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)無(wú)法大量表達(dá)P97R1抗原，免疫后無(wú)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，因此當(dāng)本稀釋劑用于豬支原體肺炎滅活疫苗時(shí)，由于其中含有ISC0M-P97R1及其他水溶性佐劑成分，既能夠補(bǔ)充抗原譜同時(shí)又能增強(qiáng)滅活疫苗的免疫刺激能力。目前市場(chǎng)上唯一的豬支原體肺炎活疫苗為豬支原體肺炎(168株)活疫苗，采用肺內(nèi)注射途徑免疫。該疫苗的免疫效果優(yōu)于國(guó)外進(jìn)口滅活疫苗，但由于采用肺內(nèi)注射方式免疫，操作難度大，不易于為廣大養(yǎng)殖戶(hù)所接受，限制了其的廣泛應(yīng)用。試驗(yàn)證明該疫苗直接通過(guò)肌肉注射途徑免疫無(wú)法獲得有效保護(hù)，因此該疫苗改進(jìn)的關(guān)鍵在于選擇合適的免疫增強(qiáng)劑加強(qiáng)疫苗的免疫刺激能力，使得其通過(guò)肌肉注射途徑免疫能夠起效。同時(shí)前期試驗(yàn)結(jié)果顯示活疫苗通過(guò)肌肉注射途徑免疫時(shí)同樣不能誘導(dǎo)針對(duì)P97R1的免疫應(yīng)答，這可能與肌肉免疫和自然感染的狀態(tài)差異較大有`關(guān)。因此當(dāng)本稀釋劑用于豬支原體肺炎活疫苗肌肉注射免疫時(shí)，由于其中含有ISC0M-P97R1及其他水溶性佐劑成分，既能夠補(bǔ)充抗原譜同時(shí)又能增強(qiáng)活疫苗的免疫刺激能力。本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑，應(yīng)用時(shí)只需用稀釋劑直接溶解或稀釋豬支原體肺炎活疫苗或滅活疫苗抗原即可，具有操作簡(jiǎn)便，通針性好等優(yōu)點(diǎn)。不僅可補(bǔ)充疫苗抗原保護(hù)譜，同時(shí)可顯著增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞及體液免疫刺激能力，提高活疫苗和滅活疫苗的攻毒保護(hù)效力。同時(shí)也能克服現(xiàn)有商品化的肺內(nèi)注射疫苗無(wú)法直接用于肌肉注射免疫動(dòng)物的嚴(yán)重缺陷。


圖1電鏡觀察ISC0M-P97R1母液的籠狀顆粒結(jié)構(gòu)形態(tài)圖2活疫苗免疫后豬肺炎支原體全菌蛋白抗體檢測(cè)圖3活疫苗免疫后豬肺炎支原體P97R1蛋白抗體檢測(cè)圖4滅活疫苗免疫后豬肺炎支原體全菌蛋白抗體檢測(cè)圖5滅活疫苗免疫后豬肺炎支原體P97R1蛋白抗體檢測(cè)圖；圖6使用專(zhuān)用稀釋劑的豬支原體肺炎滅活疫苗及活疫苗的攻毒保護(hù)效果評(píng)價(jià)圖。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述和論證，但是本發(fā)明所包括的內(nèi)容并不局限于此。為了驗(yàn)證本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備和鑒定，應(yīng)用于豬支原體肺炎活疫苗和滅活疫苗時(shí)對(duì)抗原譜的補(bǔ)充能力和免疫增強(qiáng)能力，以及攻毒保護(hù)效力，特做以下實(shí)驗(yàn)和制備。實(shí)施例1重組豬肺炎支原體P97R1蛋白的制備
按照GenBank公開(kāi)的豬肺炎支原體基因組序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增P97R1片段。上游引物:
5‘-CCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG-3’ (SEQ ID N0.3);下游引物:5 ‘-GCGAAGCTTAAGCCATTGGGAAATAGTCT-3’ (SEQ ID N0.4)。上下游引物中分別包含及^7 I位點(diǎn)和歷fli/III位點(diǎn)。以168株F344代豬肺炎支原體基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得P97R1基因片段，經(jīng)及^7 I和雙酶切后插入pET-32a(+)載體中，得到表達(dá)重組P97R1蛋白的原核質(zhì)粒載體pET-32a(+)-P97Rl。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21 (DE3)，篩選陽(yáng)性克隆，DNA測(cè)序驗(yàn)證，得到表達(dá)重組P97R1蛋白重組基因工程菌。用pET_32a(+)載體表達(dá)的重組P97R1蛋白的基因序列(SEQ ID N0.1)為:ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATC
CTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCGGCTAAACCTGAAGCAGCTAAACCAGTAGCAGCTAAACCAGTTGCTACTAATACTAATACTAATACTGGCTTTTCACTTACAAATAAACCAAAAGAAGACTATTTCCCAATGGCTTAA表達(dá)蛋白序列(SEQ ID N0.2)為:
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYG
IRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSP
DLGTDDDDKAMADIGSEFLPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKP
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工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，所表達(dá)蛋白分子量大小與預(yù)期相符。裂解后取上清液，經(jīng)鎳柱親和層析純化得到重組P97R1蛋白，透析除鹽，凍干保存。電泳純度達(dá)90%。經(jīng)WesternBlot鑒定可與豬肺炎支原體陽(yáng)性血清反應(yīng)。
實(shí)施例2含重組P97R1蛋白的免疫刺激復(fù)合物ISC0M-P97R1的制備(I) 20% Mega-1O貯備液制備
0.4 g Mega-1O (又名“N-奎?；?N-甲基葡糖胺”)干粉溶于1.6 ml蒸餾水中，37°C溶解后定容至2 ml ο(2)脂類(lèi)混合物儲(chǔ)備液制備
將100 mg磷脂酰膽堿與100 mg膽固醇加至10 ml 20% Mega-10中，稍加熱(30_60°C )并緩慢攪拌使之完全溶解，過(guò)濾后分裝，存放于-20°C備用。(3) Quil A 溶液制備
將25 mg Quil A溶于4.5 ml pH為7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中。(4)豬肺炎支原體P97R1蛋白溶液
同實(shí)施例1所述方法制備并純化重組P97R1蛋白，磷酸鹽緩沖液溶解，測(cè)定其蛋白濃度并稀釋至10 mg/ml, _20°C保存?zhèn)溆谩?5) ISCOM-P97R l 母液的制備
取10 mg/ml的P97R1溶液3 ml,向其中加入Mega-10粉末，使Mega-1O濃度為2%，于37°C下放置12 h。然后向其中加入脂類(lèi)混合物儲(chǔ)備液150 μ I和QuilA溶液1350 μ 1，混勻后于室溫下放置2 h。冰浴超聲處理30min，再于室溫放置2h，然后轉(zhuǎn)移至透析袋中以磷酸鹽緩沖液為外液于4 °C透析72 h，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌即得，4°C保存。負(fù)染透射電鏡檢查，見(jiàn)附圖1，可見(jiàn)籠狀顆粒結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備
當(dāng)制備僅含ISC0M-P97R1成分的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋液時(shí)，其制備方法為:取Quil A濃度為1.67mg/ml的ISC0M-P97R1母液適量，用適量磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)吹玫矫縨l溶液含有:Quil A 0.1-1毫克，膽固醇0.02-0.2毫克，磷脂酰膽堿0.02-0.2毫克，P97R1抗原0.4-4毫克的ISC0M-P97R1的疫苗專(zhuān)用稀釋液。當(dāng)制備含有ISC0M-P97R1成分，以及其他水佐劑成分的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋液時(shí)，其制備方法為:先分別配制ISC0M-P97R1母液、左旋咪唑母液、黃芪多糖母液、卡波姆母液，再用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度即得疫苗專(zhuān)用稀釋劑。具體步驟如下:
(I) ISC0M-P97R1母液的制備:同上所述方法制備得到Quil A濃度為1.67mg/ml的ISC0M-P97R1 母液。(2)左旋咪唑母液的制備:取適量的左旋咪唑溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到200mg/ml的左旋咪唑母液。(3)黃芪多糖母液的制備:取適量的黃芪多糖溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到250mg/ml的黃芪多糖母液。(4)卡波姆母液的制備:取適量卡波姆(卡波姆974P或971P)溶解于蒸餾水，室溫放置過(guò)夜使其充分溶脹得到20mg/ml的卡波姆溶液，加入3M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2,加適量蒸懼水調(diào)節(jié)卡波姆濃度為15mg/ml,得到15mg/ml的卡波姆母液。(5)豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備:以IOOml稀釋劑為例進(jìn)行配制時(shí)，取Quil A濃度為1.67mg/ml的ISC0M-P97R1母液適量，同時(shí)取200mg/ml的左旋咪唑母液、或/和250mg/ml的黃芪多糖母液、或/和15mg/ml的卡波姆母液中的一種或多種各適量，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行一定稀釋?zhuān)吹玫矫縨l溶液中含有Quil A 0.1-1毫克的ISC0M-P97R1、左旋咪唑2-20毫克、或/和黃芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。實(shí)施例4使用豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的活疫苗的免疫原性評(píng)價(jià)一、實(shí)驗(yàn)材料:
1.動(dòng)物:4-5周齡BALB/c小鼠，雄性，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；
2.疫苗:豬支原體肺炎(168株)活疫苗凍干粉，由南京天邦生物科技有限公司提供，每頭份含豬肺炎支原體168株活菌107CCU。二、實(shí)驗(yàn)方法1.疫苗配制:
按實(shí)施例3所述方法制備豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。用豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑直接溶解豬支原體肺炎(168株)活疫苗凍干粉，按豬用頭份計(jì)算，用Iml稀釋劑溶解I頭份活疫苗。同樣用磷酸鹽緩沖液代替專(zhuān)用稀釋劑溶解活疫苗凍干粉，作為普通活疫苗對(duì)照。2.小鼠免疫:
將小鼠隨機(jī)分組，共分3組，每組10只，分別為Gl對(duì)照組、G2普通活疫苗組、G3專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組。其中G2普通活疫苗組動(dòng)物免疫用磷酸鹽緩沖液溶解的活疫苗，G3專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組動(dòng)物免疫用專(zhuān)用稀釋劑溶解的活疫苗，Gl對(duì)照組動(dòng)物免疫等體積磷酸鹽緩沖液。每只小鼠后腿肌肉注射免疫100 μ 1，其中活疫苗含量為106CCU。共免疫兩次，間隔2周。3.血清抗體檢測(cè):
從第二次免疫后7天起開(kāi)始每 周采血，檢測(cè)血清中豬肺炎支原體全菌抗原特異性IgG抗體水平及豬肺炎支原體P97R1抗原特異性IgG抗體水平。免疫后以豬肺炎支原體168株全菌蛋白或表達(dá)純化的P97R1蛋白為包被抗原檢測(cè)血清抗體的產(chǎn)生情況。將抗原蛋白溶解于0.05 mM pH 9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液中，調(diào)整濃度為10 μ g/mL，得到包被抗原溶液。向96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μ L包被抗原，4°C包被過(guò)夜。棄去包被液，加入磷酸鹽緩沖液配制的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液200 UL, 37 °C封閉I h。棄去封閉液，加入用磷酸鹽緩沖液配制的1% BSA稀釋劑稀釋的血清樣本100 UL (稀釋比1:100)，37 °〇孵育I h。棄去血清，用洗滌液即含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次5分鐘。洗滌后，每孔加入用磷酸鹽緩沖液配制的1% BSA稀釋劑稀釋的羊抗小鼠酶標(biāo)二抗100 UL(稀釋比1:10000),37 °C孵育I h。棄去二抗，同上洗滌。洗滌后，每孔加入100 μ L底物液(底物A:3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 200 mg，無(wú)水乙醇100 mL，加雙蒸水至1000 mL。底物B:在6.4 mL 0.75%過(guò)氧化氫尿素溶液中加入0.1 M檸檬酸-0.2 M磷酸二氫鈉緩沖液直至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至5.0。將底物A和B等體積混合即得)，37 °C反應(yīng)30 min后，力口Λ 50 μ L 2Μ H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的光密度值OD45tlnm。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
檢測(cè)結(jié)果結(jié)果如圖2和圖3所示，圖中的白柱為Gl對(duì)照組、黑柱為G2普通活疫苗組，灰柱為G3專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組，圖2為豬肺炎支原體全菌蛋白抗體水平檢測(cè)，圖3為豬肺炎支原體P97R1蛋白抗體水平檢測(cè)。結(jié)果表明，第二次免疫后一周可在兩個(gè)免疫組動(dòng)物血清中檢測(cè)到明顯的豬肺炎支原體全菌蛋白抗體，專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組的血清抗體水平顯著高于普通活疫苗組動(dòng)物的血清抗體，并在所監(jiān)測(cè)的四周時(shí)間范圍內(nèi)維持該優(yōu)勢(shì)不變，說(shuō)明使用本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑可顯著提高活疫苗的免疫刺激能力。同時(shí)，第二次免疫后一周開(kāi)始在專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組動(dòng)物血清中可檢測(cè)到明顯的P97R1蛋白抗體，而在普通活疫苗組及對(duì)照組動(dòng)物血清中無(wú)此抗體，說(shuō)明使用本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑可刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)豬肺炎支原體P97R1抗原的免疫應(yīng)答，補(bǔ)充疫苗抗原譜，提高免疫力。實(shí)施例5使用豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的滅活疫苗的免疫原性評(píng)價(jià)一、實(shí)驗(yàn)材料:
1.動(dòng)物:4-5周齡BALB/c小鼠，雄性，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；
2.疫苗:豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所自制，每頭份含豬肺炎支原體NJ株滅活菌體109CCU。二、實(shí)驗(yàn)方法1.疫苗配制:
按實(shí)施例3所述方法制備豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。用豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑直接稀釋豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)。
·
用常規(guī)油苗制備方法制備豬支原體肺炎滅活疫苗，作為普通滅活疫苗對(duì)照，具體制備方法為:取白油94份,加入6份Span-80,混合均勻,滅菌備用,此為油相；向96份豬支原體肺炎滅活抗原溶液中加入4份Tween-80，充分振搖致完全溶解，此為水相。取適量油相，開(kāi)動(dòng)乳化劑緩慢乳化，然后將油相1/3體積的水相緩慢加入油相中，乳化4-6分鐘，即得。2.小鼠免疫:
將小鼠隨機(jī)分組，共分3組，每組10只，分別為Gl對(duì)照組、G2普通滅活疫苗組、G3專(zhuān)用稀釋劑滅活疫苗組。其中G2普通滅活疫苗組動(dòng)物免疫用白油佐劑制備的常規(guī)滅活疫苗，G3專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組動(dòng)物免疫用專(zhuān)用稀釋劑稀釋的滅活疫苗，Gl對(duì)照組動(dòng)物免疫等體積磷酸鹽緩沖液。每只小鼠后腿肌肉注射免疫100 μ 1，其中滅活疫苗含量為108CCU。共免疫兩次，間隔2周。3.血清抗體檢測(cè):
從第二次免疫后7天起開(kāi)始每周采血，檢測(cè)血清中豬肺炎支原體全菌抗原特異性IgG抗體水平及豬肺炎支原體P97R1抗原特異性IgG抗體水平。免疫后以豬肺炎支原體168株全菌蛋白或表達(dá)純化的P97R1蛋白為包被抗原檢測(cè)血清抗體的產(chǎn)生情況。將抗原蛋白溶解于0.05 mM pH 9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液中，調(diào)整濃度為10 μ g/mL，得到包被抗原溶液。向96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μ L包被抗原，4°C包被過(guò)夜。棄去包被液，加入磷酸鹽緩沖液配制的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液200 UL, 37 °C封閉I h。棄去封閉液，加入用磷酸鹽緩沖液配制的1% BSA稀釋劑稀釋的血清樣本100 UL (稀釋比1:100)，37 °〇孵育I h。棄去血清，用洗滌液即含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次5分鐘。洗滌后，每孔加入用磷酸鹽緩沖液配制的1% BSA稀釋劑稀釋的羊抗小鼠酶標(biāo)二抗100 UL(稀釋比1:10000),37 °C孵育I h。棄去二抗，同上洗滌。洗滌后，每孔加入100 μ L底物液(底物A:3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 200 mg，無(wú)水乙醇100 mL，加雙蒸水至1000 mL。底物B:在6.4 mL 0.75%過(guò)氧化氫尿素溶液中加入0.1 M檸檬酸-0.2 M磷酸二氫鈉緩沖液直至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至5.0。將底物A和B等體積混合即得)，37 °C反應(yīng)30 min后，力口Λ 50 μ L 2Μ H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的光密度值OD45tlnm。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果如圖4和圖5所示，圖中的圖中的白柱為Gl對(duì)照組、黑柱為G2普通活疫苗組，灰柱為G3專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組，圖4為豬肺炎支原體全菌蛋白抗體水平檢測(cè)，圖5為豬肺炎支原體P97R1蛋白抗體水平檢測(cè)。結(jié)果表明，第二次免疫后一周開(kāi)始可在兩個(gè)免疫組動(dòng)物血清中檢測(cè)到明顯的豬肺炎支原體全菌蛋白抗體，說(shuō)明使用本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑可顯著提高滅活疫苗的免疫刺激能力，效果與普通白油佐劑基本相當(dāng)。同時(shí)第二次免疫后一周開(kāi)始在專(zhuān)用稀釋劑活疫苗組動(dòng)物血清中可檢測(cè)到明顯的P97R1蛋白抗體，而在普通白油佐劑的滅疫苗組及對(duì)照組動(dòng)物血清中無(wú)此抗體，說(shuō)明使用本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑可刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)豬肺炎支原體P97R1抗原的免疫應(yīng)答，補(bǔ)充疫苗抗原譜，提高免疫力。實(shí)施例6使用豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的活疫苗及滅活疫苗攻毒保護(hù)效力評(píng)價(jià)
一、實(shí)驗(yàn)材料
1.動(dòng)物:5-10日齡蘇鐘豬，購(gòu)自六合竹鎮(zhèn)畜禽養(yǎng)殖科技示范園；
2.疫苗:豬支原體肺炎(168株)活疫苗凍干粉，由南京天邦生物科技有限公司提供，每頭份含豬肺炎支原體168株活菌IO7CCU ;豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所自制，每頭份含豬肺炎支原體NJ株滅活菌體IO9CCU ；
3.攻毒用強(qiáng)毒:豬肺炎支原體JS株及其組織毒，由南京天邦生物科技有限公司提供。二、實(shí)驗(yàn)方法1.疫苗配制
按實(shí)施例3所述方法制備得到豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。用專(zhuān)用稀釋劑直接溶解豬支原體肺炎(168株 )活疫苗凍干粉配制活疫苗；用專(zhuān)用稀釋劑稀釋豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)抗原配制滅活疫苗。2.免疫
采用5-10日齡豬肺炎支原體血清抗體陰性豬，隨機(jī)分組，每組5頭，首先設(shè)置一組為Gl健康對(duì)照組，即不免疫不攻毒，另設(shè)一組為G6攻毒對(duì)照組，即不免疫只攻毒，其余組分別免疫普通活疫苗(168株)(G2組)、專(zhuān)用稀釋劑活疫苗(168株)(G3組)、普通油包水滅活疫苗(NJ株)(G4組)、專(zhuān)用稀釋劑滅活疫苗(NJ株)(G5組)，均攻毒。采用頸部肌肉注射方式免疫。共免疫2次，間隔2周。3.攻毒
于動(dòng)物兩月齡時(shí)氣管內(nèi)注射豬肺炎支原體強(qiáng)毒攻毒。強(qiáng)毒配制方法:用3 ml生理鹽水溶解凍干組織毒，加入I ml新鮮培養(yǎng)毒，共注射4 ml/頭。4.剖檢評(píng)分
攻毒后25天處死動(dòng)物，參照MADEC和K0BISCH (1982)報(bào)道的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)豬肺部的損傷進(jìn)行評(píng)分。整個(gè)肺臟分左心葉(LCL)、左尖葉(LAL)、左膈葉(LDL)、右心葉(RCL)、右尖葉(RAL)、右膈葉(RDL)和副葉(IL)，共7個(gè)肺葉。每個(gè)肺臟的損傷分?jǐn)?shù)為上述7個(gè)肺葉的背側(cè)面和腹側(cè)面損傷得分之和，總分為28分。每個(gè)肺葉按照損傷的面積分別打0-4分，其中無(wú)損傷為O分，1-25%面積損傷為I分，26-50%面積損傷為2分，51-75%面積損傷為3分，76-100%面積損傷為4分。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.安全檢驗(yàn)
免疫前及免疫后3天，連續(xù)3天測(cè)定肛溫，普通油包水滅活疫苗組動(dòng)物體溫在第1、2天時(shí)稍有升高(1°C以?xún)?nèi))，其他組動(dòng)物無(wú)明顯體溫變化；
攻毒后25天剖殺動(dòng)物，取肌肉注射部位組織病理切片檢查，發(fā)現(xiàn)普通油包水滅活疫苗組動(dòng)物有3頭動(dòng)物發(fā)現(xiàn)灶性肉芽腫，其余組動(dòng)物無(wú)明顯病理變化。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明使用本稀釋劑的疫苗通過(guò)肌肉注射免疫無(wú)明顯的全身及局部不良反應(yīng),對(duì)實(shí)驗(yàn)豬安全。2.攻毒保護(hù)
攻毒后25天剖殺動(dòng)物，對(duì)肺部支原體肺炎病變程度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，用普通活疫苗直接進(jìn)行肌肉注射免疫，無(wú)法提供明顯的攻毒保護(hù)效力，說(shuō)明此商品化的肺內(nèi)注射疫苗無(wú)法直接用于肌肉注射免疫動(dòng)物(G2組);當(dāng)活疫苗使用專(zhuān)用的疫苗稀釋劑后肌肉注射免疫呈現(xiàn)出顯著的抗攻毒保護(hù)能力，說(shuō)明該專(zhuān)用稀釋劑能顯著增加活疫苗的免疫刺激能力，從而在肌肉注射條件能夠下為動(dòng)物提供有效攻毒保護(hù)(G3組)。在應(yīng)用于滅活疫 苗時(shí)，該專(zhuān)用稀釋劑依然能夠提供較好的免疫增強(qiáng)能力(G5組)，其免疫效果與使用油包水佐劑的滅活疫苗(G4組)相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.一種豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑，其特征在于疫苗專(zhuān)用稀釋劑中含有以重組豬肺炎支原體P97R1抗原制備的免疫刺激復(fù)合物ISC0M-P97R1，具體為每ml豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑中含有:Quil A 0.1-1毫克、膽固醇0.02-0.2毫克、磷脂酰膽堿0.02-0.2毫克、P97R1抗原0.4-4毫克。
2.權(quán)利I的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備方法，其特征在于先按以下比例配制高濃度母液，再用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度即得疫苗專(zhuān)用稀釋劑，具體步驟包括:A)取磷酸鹽緩沖液溶解得到的10 mg/ml的P97R1溶液3 ml,向其中加入Mega-1O粉末，使Mega-1O濃度為2%，于37°C下放置12 h ;然后向其中加入含10 mg/ml磷脂酰膽堿和10 mg/ml膽固醇的20% Mega-1O溶液的脂類(lèi)混合物儲(chǔ)備液150 μ 1，再加入含5.56mg/ml QuilA的磷酸鹽緩沖液的QuilA溶液1350 μ 1，混勻后于室溫下放置2 h ;B)冰浴超聲處理30min，再于室溫放置2h，C)然后轉(zhuǎn)移至透析袋中以磷酸鹽緩沖液為外液于4 °C透析72 h，0.22ym濾膜過(guò)濾除菌即得到Quil A濃度為1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液；D)取ISCOM-P97R1母液適量，用適量磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)吹玫矫縨l溶液中Quil A含量為0.1-1毫克的ISCOM-P97R1的疫苗專(zhuān)用稀釋液。
3.如權(quán)利要求1所述的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑，其特征在于還含有左旋咪唑、或/和黃芪多糖、或/和卡波姆水性疫苗佐劑，其中，每ml疫苗專(zhuān)用稀釋液的溶液中還含有水性疫苗佐劑成分的含量為:左旋咪唑2-20毫克、或/和黃芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克。
4.權(quán)利3的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備方法，其特征在于先分別配制ISCOM-P97R1母液、左旋咪唑母液、黃芪多糖母液、卡波姆母液，再用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度即得疫苗專(zhuān)用稀釋劑，具體步驟如下:(1)ISCOM-P97R1母液的制備:同上所述方法制備得到Quil A濃度為1.67mg/ml的ISCOM-P97R1 母液；(2)左旋咪唑母液的 制 備:取適量的左旋咪唑溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到200mg/ml的左旋咪唑母液；(3)黃芪多糖母液的制備:取適量的黃芪多糖溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到250mg/ml的黃芪多糖母液；(4)卡波姆母液的制備:取適量卡波姆(卡波姆974P或971P)溶解于蒸餾水，室溫放置過(guò)夜使其充分溶脹得到20mg/ml的卡波姆溶液，加入3M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2,加適量蒸懼水調(diào)節(jié)卡波姆濃度為15mg/ml,得到15mg/ml的卡波姆母液；(5)豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑的制備:以IOOml稀釋劑為例進(jìn)行配制時(shí)，取Quil A濃度為1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液適量，同時(shí)取200mg/ml的左旋咪唑母液、或/和250mg/ml的黃芪多糖母液、或/和15mg/ml的卡波姆母液中的一種或多種各適量，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行一定稀釋?zhuān)吹玫矫縨l溶液中含有Quil A 0.1-1毫克的ISCOM-P97R1、左旋咪唑2-20毫克、或/和黃芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗專(zhuān)用稀釋劑，主要含重組P97R1蛋白免疫刺激復(fù)合物(ISCOM-P97R1)，此外還可能含有其他水性佐劑成分，包括左旋咪唑、或/和黃芪多糖、或/和卡波姆。所述稀釋劑的每ml溶液中含有QuilA0.1-1毫克，膽固醇0.02-0.2毫克，磷脂酰膽堿0.02-0.2毫克，P97R1抗原0.4-4毫克，此外還可能進(jìn)一步含有左旋咪唑2-20毫克、或/和黃芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克，其余為磷酸鹽緩沖液。該稀釋劑專(zhuān)用于溶解或稀釋豬支原體肺炎疫苗，包括活疫苗和滅活疫苗。兼具補(bǔ)充疫苗抗原保護(hù)譜和增強(qiáng)疫苗細(xì)胞及體液免疫刺激能力的雙重效果，可顯著提高疫苗的攻毒保護(hù)效力。同時(shí)由于采用水溶劑體系，還具有操作簡(jiǎn)便，通針性好，無(wú)明顯毒副反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK103071151SQ20131001723
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者熊祺琰, 邵國(guó)青, 韋艷娜, 劉茂軍, 馮志新, 白方方 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院