專利名稱：天然人促紅細(xì)胞生成素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種具有至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體。本發(fā)明還涉及編碼所述促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體的DNA序列，以及表達(dá)該類似物或其變體的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子。早在1906年，Carnot等發(fā)現(xiàn)兔失血后會(huì)在外周血中產(chǎn)生一種可作用于造血系統(tǒng)以加速紅細(xì)胞生成的物質(zhì)，由此提出存在一種體液因子以反饋方式調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成。時(shí)隔30多年以后此觀點(diǎn)才得以證實(shí)，這種因子被命名為促紅細(xì)胞生成素。促紅細(xì)胞生成素又稱血細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞 刺激因子，屬酸性糖蛋白，是調(diào)節(jié)前體紅細(xì)胞增殖、分化以及保持外周血中紅細(xì)胞濃度處于正常生理范圍內(nèi)的最主要激素。它可與紅細(xì)胞前體細(xì)胞表面的EPO受體結(jié)合，促進(jìn)其血紅蛋白的合成使之增殖分化成紅細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)紅細(xì)胞和血紅蛋白的生理平衡。EPO是一個(gè)強(qiáng)有力的造血生長(zhǎng)因子，體外分析顯示在0.05 lU/ml的濃度時(shí)即具有劑量依賴效應(yīng)。EPO可刺激紅系祖細(xì)胞(BFU-E)和早幼稚紅細(xì)胞(CFU-E)形成成熟的紅細(xì)胞集落。EPO除了作用于骨髓巨核前體細(xì)胞外，對(duì)其他造血細(xì)胞均無(wú)作用，是迄今認(rèn)為作用最單一的造血生長(zhǎng)因子。當(dāng)然，對(duì)紅細(xì)胞造血過(guò)程的完整調(diào)節(jié)，除了 EPO外，還需要其他因子的協(xié)同作用，包括Mult1-CSF、GM-CSF和IL-1，這些因子促使干細(xì)胞變成BFU-E，并聯(lián)合刺激使紅細(xì)胞早期增殖，隨后才是EPO的增殖作用。1977年，Miyake等從重癥再障貧血病人的尿中提取得到了 EPO的純品，由于起始來(lái)源的匱乏，很難得到大量純品以充分研究其生物學(xué)和分子學(xué)性質(zhì)。1984年，科學(xué)家們首次以人腎癌細(xì)胞的EPO mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并在大腸桿菌中得以克隆并表達(dá)，在此基礎(chǔ)上獲得了 EPO的完整基因并在真核細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，為深入研究EPO的生物學(xué)效應(yīng)并將之應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已能用基因工程方法生產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，并用于臨床治療多種紅細(xì)胞減少癥，具有很好的療效。真核細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一個(gè)或更多寡糖基團(tuán)修飾。這種稱為糖基化的修飾能強(qiáng)烈影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、分泌和亞細(xì)胞定位也會(huì)起重要作用。正確的糖基化有時(shí)是生物活性所必需的。某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的細(xì)胞過(guò)程的細(xì)菌(如大腸桿菌)中表達(dá)，所回收到的蛋白由于缺乏糖基化而沒(méi)有或幾乎沒(méi)有活性。糖基化作用出現(xiàn)在多肽骨架的特異位置，通常有兩類:0連接糖基化和N連接糖基化。O連接的寡糖連在絲氨酸或蘇氨酸殘基上，而N連接的寡糖則連接在作為序列Asn-X-Ser/Thr 一部分的天冬酰胺殘基上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。N連接和O連接的寡糖結(jié)構(gòu)及每種類型中存在的糖殘基都是不同的。共同存在于兩種類型中的一類糖是N-乙酰基神經(jīng)氨酸(以下簡(jiǎn)稱唾液酸)。唾液酸通常是N連接和O連接寡糖的末端殘基，由于它帶負(fù)電荷，可能會(huì)使糖蛋白具有酸性。成熟的EPO由166個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列參見(jiàn)SEQ ID NO: 1，肽鏈結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。EPO分子內(nèi)有兩個(gè)二硫鍵，3個(gè)N-鍵糖基化位點(diǎn)和I個(gè)O-鍵糖基化位點(diǎn)，其中兩個(gè)二硫鍵在變性EPO復(fù)性并折疊成有生物活性構(gòu)型時(shí)是必不可少的。天然人促紅細(xì)胞生成素和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的人促紅細(xì)胞生成素都含有三個(gè)N連接寡糖鏈和一個(gè)O連接寡糖鏈，它們共占蛋白總分子量的40%。N連接糖基化出現(xiàn)在24、38、83位的天冬酰胺殘基，而O連接糖基化則出現(xiàn)在 126 位的絲氨酸殘基(Lai 等,J.Biol.Chem.261:3116,1986 ；Broundy 等，Arch.Biochem.Biophys.265:329,1988))。已證明寡糖鏈被末端唾液酸殘基修飾。對(duì)糖基化促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行酶處理而脫除唾液酸殘基后，導(dǎo)致體內(nèi)活性喪失，但不影響體外活性(Lowy等，Naturel85:102,1960 ；Goldwasser 等，J.Biol.Chem.249:4202,1974)。這一現(xiàn)象曾被解釋為無(wú)唾液酸促紅細(xì)胞生成素由于與肝無(wú)唾液酸糖蛋白結(jié)合蛋白相互作用而從循環(huán)中迅速清除(Morrell 等，J.Bi0.Chem.243:155,1968 出riggs等Am.J.Physiol.227:1385，1974 ；AshwelI,Methods Enzymo1.50:287,1978)。因此促紅細(xì)胞生成素只有在被唾液酸酸化從而避免被肝結(jié)合時(shí)才具有體內(nèi)生物活性。在促紅細(xì)胞生成素的寡糖中，其作用還不十分確定。已證明，部分脫糖基化的促紅細(xì)胞生成素與糖基化形式相比，體內(nèi)活性大大降低，但保留了體外活性(Dordal等，Endocrinologyl 16:2293,1985)。但另一項(xiàng)研究則表明，如果使作為糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺或絲氨酸殘基發(fā)生突變，從而單獨(dú)或共同脫除N連接或O連接的寡糖鏈，則會(huì)使在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的突變蛋白的體外活性急劇下降(Dube等，J.Biol.Chem.263:17516，1988)。糖蛋白如促紅細(xì)胞生成素，可以用諸如等電聚焦(IEF)等技術(shù)分離成不同帶 電形式。粗制及部分純化的促紅細(xì)胞生成素制備物的IEF研究已有多方報(bào)道(Lukosky等，J.Biochem.50:909,1972 ；Shelton 等，Biochem.Med.12:45,1975 ；Fuhr 等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98:930,1981)。在Miyake等人所討論的從人尿純化人促紅細(xì)胞生成素中，通過(guò)羥基磷灰石色譜法得到的兩個(gè)促紅細(xì)胞生成素組分。這兩個(gè)組分被定名為I1、IIIA。隨后對(duì)II和III A進(jìn)行的碳水化合物分析表明，組分II的唾液酸含量比組分III A高。進(jìn)一步研究還表明，一個(gè)位點(diǎn)的糖基化程度很大程度上取決于其周?chē)被岬慕M成(Kasturi 等，Biochem.J.323:415，1997 ；Elliott 等，JBC.279:16854，2004)，因此，改變N-糖基化位點(diǎn)附近氨基酸組成會(huì)在很大程度上影響糖基化的程度。增加促紅細(xì)胞生成素碳水化合物的數(shù)目，并因此而增加每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)目，可以產(chǎn)生一些優(yōu)越的性質(zhì)，例如溶解度提高、更耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半衰期延長(zhǎng)、生物活性提高。本發(fā)明通過(guò)突變天然EPO序列中的若干個(gè)氨基酸殘基增加N-糖基化位點(diǎn)數(shù)而提高了 EPO類似物的性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體，該類似物包括至少一個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)，其位點(diǎn)范圍位于人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的1-9，28-32，40-55，86-92，112-133，162-166位，以及該變體在該類似物的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、替換或添加，且具有該類似物等同的活性。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，額外N-糖基化位點(diǎn)位于人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的1-6，28-32，87-90位。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，額外N-糖基化位點(diǎn)的數(shù)為1-3個(gè)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類似物在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的2、3、4、28、30、88位中的任何一位置置換上了天冬酰胺。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類似物在天然紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的4、5、6、30位中的任何一位位置置換上了蘇氨酸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類似物在天然紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的4、5、6、30、32、90位中的任何一個(gè)位置置換上了絲氨酸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類似物在天然紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的1、2、3、27、87位置換上了丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸或絲氨酸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類似物在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的3、4、5、31、89位中的任何一個(gè)位置置換上了異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或組氨酸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類似物選自 Z1Asn2Y3X4EPCK Z2Asn3Y4X5EPO, Z3Asn4Y5X6EPO, Z27Asn28X30EPO, Asn30Y31X32EPO,Z87Asn88Y89SerwEPO或它們?nèi)我鈨煞N或任意三種的組合，其中X選自絲氨酸和蘇氨酸；以及Y和Z選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸。本發(fā)明還涉及一種DNA序列，該DNA序列編碼本發(fā)明的人促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體。本發(fā)明還涉及一種真核宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有包含本發(fā)明DNA序列的載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該真核宿主細(xì)胞選自CHO，C0S-7或BHK。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體的生產(chǎn)方法，包括步驟:(i)培養(yǎng)本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞，和(ii)從培養(yǎng)物中收集具有紅細(xì)胞生成素活性的糖蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種增加紅細(xì)胞生成的藥物組合物,該組合物包含治療有效量的本發(fā)明的人促紅細(xì)胞生成 素類似物或其變體以及可藥用的稀釋劑、助劑或載體。該藥物組合物優(yōu)選用于促進(jìn)紅細(xì)胞生成，預(yù)防或治療貧血。具體而言，包含本發(fā)明DNA序列的載體轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞(如CHO細(xì)胞、C0S-7細(xì)胞、BHK)中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)先選用CHO細(xì)胞。向CHO細(xì)胞中加入無(wú)血清培養(yǎng)基、包含本發(fā)明DNA序列的載體、Iipofectamine組成的轉(zhuǎn)染混合液,培養(yǎng)一段時(shí)間后在培養(yǎng)基中加入氨甲喋呤(MTX)篩選抗性克隆。隨后逐漸提高M(jìn)TX濃度來(lái)篩選高表達(dá)的抗性克隆。利用酶聯(lián)免疫分析法確認(rèn)所得到的細(xì)胞能夠表達(dá)人紅細(xì)胞生成素類似物。將能夠表達(dá)人紅細(xì)胞生成素類似物的細(xì)胞擴(kuò)增，培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液。接著，含重組紅細(xì)胞生成素類似物的細(xì)胞培養(yǎng)液濃縮后上樣于Q Sepharose Fast flow或DEAESepharose Fast flow (GE)等同類離子交換層析介質(zhì)裝填的柱上,經(jīng)緩沖液沖洗后用低pH值緩沖液淋洗柱子。最后，通過(guò)含有鹽的緩沖液將確定的紅細(xì)胞生成素類似物由柱上洗脫下來(lái)。上述收集到的紅細(xì)胞生成素類似物進(jìn)一步經(jīng)過(guò)反相層析純化，上樣C4、C8、Source等反相層析柱，利用0-100%梯度的乙醇、異丙醇或乙腈將紅細(xì)胞生成素類似物洗脫下來(lái)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，在本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素類似物的氨基酸序列中缺失，替換或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，生成的變體仍具有該類似物等同的活性。例如，在本發(fā)明類似物的非關(guān)鍵點(diǎn)位缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；同類型氨基酸(非保守性氨基酸)之間的相互替換，例如，酸性氨基酸之間的替換，例如Glu和Asp，堿性氨基酸之間的替換，例如Arg和Lys，芳香族氨基酸之間的替換，例如Phe和Tyr ;帶羥基的極性氨基酸之間的替換，例如Thr和Ser ;在類似物全長(zhǎng)氨基酸序列的前后添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，例如，在N端添加His標(biāo)簽或分泌信號(hào)序列，或在C端添加polyA尾等等。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素類似物包含至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列。額外的糖基化位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致比天然人紅細(xì)胞生成素?cái)?shù)目更多的碳水化合物鏈和更高的唾液酸含量。唾液酸含量高于天然人促紅細(xì)胞生成素的類似物是通過(guò)添加糖基化位點(diǎn)而產(chǎn)生的，而這些糖基化位點(diǎn)不干擾生物活性所需的二級(jí)或三級(jí)構(gòu)象。人促紅細(xì)胞生成素類似物最好有1、2或3個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)，從而添加1、2或3個(gè)額外N連接碳水化合物鏈。例如，用天冬酰胺置換2位的脯氨酸，用絲氨酸置換4位的精氨酸，得到序列Asn-Pro-Ser，該序列就成為第4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。這樣一種變化通常可以每分子提供4個(gè)額外唾液酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包括具有額外糖基化位點(diǎn)的許多其它人促紅細(xì)胞生成素類似物。本發(fā)明分析了分別增加1-3個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物中碳水化合物增加的情況。具體方法是，取紅細(xì)胞生成素類似物的表達(dá)上清，用15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上(參見(jiàn)文獻(xiàn)=Burnette等，Anal.Biochem.112:195-203，1981 ；Elliott 等，Gen79:167-180，1989)，用小鼠抗紅細(xì)胞生成素單克隆抗體進(jìn)行Western Blot分析。分析了分別增加1-3個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物的等電點(diǎn)變化。分別用0.1M磷酸和0.1M氫氧化 鈉作為陽(yáng)極電解液和陰極電解液，采用含有pH2.5-5和PH3-10兩性電解質(zhì)及7M尿素的10%聚丙烯酰胺凝膠，將按照上述培養(yǎng)和純化方法得到的含各種促紅細(xì)胞生成素類似物透析后，800V，50mA，30W電泳2小時(shí)。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，再與小鼠抗紅細(xì)胞生成素單克隆抗體結(jié)合并用羊抗鼠酶標(biāo)抗體標(biāo)記，加入底物液顯色。本發(fā)明還提供測(cè)定上述促紅細(xì)胞生成素類似物純化物唾液酸含量的方法。方法簡(jiǎn)述，利用 Bradford 蛋白分析法(Bradford, Anal, biochem.72, 248.(1976))確定各促紅細(xì)胞生成素類似物純化物的蛋白濃度并將其調(diào)整到0.2-0.4mg/ml。分別向樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中加入間苯二酚、硫酸銅、鹽酸溶液，煮沸30分鐘，加乙酸丁酯一丁醇溶液(4:1)，充分混勻，靜置分層后取有機(jī)相檢測(cè)。在580nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。用唾液酸對(duì)照品溶液的濃度對(duì)其相應(yīng)的吸光度作直線回歸，由直線回歸方程求出5 μ g唾液酸的吸光度。按照公式計(jì)算促紅細(xì)胞生成素類似物純化物唾液酸含量(mol/mol蛋白)=(A2X 5X 3.24XWXD) / (A1XPX 100)，A1為5 μ g唾液酸的吸光度，A2為促紅細(xì)胞生成素類似物純化物的吸光度，D為促紅細(xì)胞生成素類似物純化物的稀釋倍數(shù)，P為促紅細(xì)胞生成素類似物純化物的蛋白含量(μ g/μ I)，W為Inmol促紅細(xì)胞生成素類似物的量(不包括碳水化合物的量)，相當(dāng)于18.2 μ g。本發(fā)明還提供一種分離具有不同等電點(diǎn)范圍的促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體混合物(實(shí)施例10)的方法，簡(jiǎn)單描述，將含促紅細(xì)胞生成素類似物的細(xì)胞培養(yǎng)液濃縮后上樣于QSepharose Fast flow (GE)裝填的柱上,加樣后,用緩沖液沖洗柱子。之后用低pH值緩沖液淋洗柱子。最后通過(guò)用含有0-400mM NaCl的緩沖液分別將不同組分的紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體由柱上洗脫下來(lái)。
本發(fā)明還分析了上述促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體混合物在體內(nèi)刺激紅細(xì)胞生成的作用變化。依據(jù)人紅細(xì)胞生成素可刺激紅細(xì)胞生成的作用，按照低、中、高三個(gè)劑量組，給小鼠(Balb/c)皮下注射ΕΡ0。由于人紅細(xì)胞生成素(EPO)可促進(jìn)骨髓中的網(wǎng)織紅細(xì)胞的釋放，使得小鼠血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)與紅細(xì)胞數(shù)的比值升高，且升高值與注射劑量呈線性關(guān)系。通過(guò)劑量一反應(yīng)平行線法檢測(cè)EPO體內(nèi)生物學(xué)活性。將EPO生物標(biāo)準(zhǔn)品(該標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所，用于測(cè)定體內(nèi)生物活性)稀釋至濃度80IU/ml、40IU/ml和20IU/ml，促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體混合物也分別稀釋至接近上述三種濃度。將小鼠隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)組和待檢組。每一組設(shè)低、中、高三個(gè)劑量。按照低、中、高三個(gè)劑量組分別腹側(cè)皮下注射小鼠。注射后的第四天于小鼠眼眶采血，用EDTA-K2 (含P/oEDTA的生理鹽水)抗凝管抗凝。取抗凝血在R-500分析儀(日本Sysmex公司)中自動(dòng)計(jì)數(shù)紅細(xì)胞總數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞總數(shù)及網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)對(duì)紅細(xì)胞總數(shù)的比值(Ret)。將Ret值輸入計(jì)算機(jī)中，程序自動(dòng)計(jì)算檢測(cè)樣品的生物學(xué)活性。這里所述的體內(nèi)特異活性是相對(duì)體內(nèi)特異活性的測(cè)量值，并不是絕對(duì)的體內(nèi)特異活性測(cè)量值。特異活性僅用于比較異構(gòu)體的相對(duì)活性，異構(gòu)體的測(cè)定采用相同測(cè)量方法，采用相同條件，相同種類的動(dòng)物，具有用于計(jì)算特異活性的相同數(shù)據(jù)分析，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的相同分析方法。本發(fā)明還研究了上述促紅細(xì)胞生成素類似物及其異構(gòu)體給小鼠單劑量注射后網(wǎng)織紅細(xì)胞含量隨時(shí)間的變化。注射促紅細(xì)胞生成素類似物或其異構(gòu)體后網(wǎng)織紅細(xì)胞含量的變化測(cè)定方法:促紅細(xì)胞生成素類似物或其異構(gòu)體以5 μ g/kg的劑量皮下注射給Balb/c小鼠，并以相同劑量的重組人紅細(xì)胞生成素為對(duì)照品，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。注射后每24小時(shí)采血，用網(wǎng)織紅細(xì)胞記數(shù)儀檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞含量，檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞含量隨時(shí)間變化情況。本發(fā)明還研究了上述促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)以及小鼠血細(xì)胞比容增加情況。藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法挑選雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，靜脈注射125I標(biāo)記的促紅細(xì)胞生成素和實(shí)施例10中得到的促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體混合物0.05 μ g/kg,按照設(shè)定的時(shí)間間隔(5分鐘至10小時(shí))眼眶靜脈采血，收集血清，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體對(duì)小鼠血細(xì)胞比容的影響糖基化程度的增加，導(dǎo)致促紅細(xì)胞生成素類似物在體內(nèi)的消除半衰期延長(zhǎng)，這為提高給藥間隔成為可能。采用不同劑量的促紅細(xì)胞生成素和實(shí)施例10中得到的異構(gòu)體混合物，分別以每周一次和每周三次皮下注射給BALB/c，連續(xù)4周，監(jiān)測(cè)血細(xì)胞比容的變化情況。


圖1顯示了人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列中共有3個(gè)天然糖基化位點(diǎn)，分別位于24,38和83位，并且標(biāo)注了促使紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生額外糖基化位點(diǎn)的位置，分別位于2、3、
4、28、30 和 88 位。圖2顯示了質(zhì)粒構(gòu)建方法。天然EPO cDNA片段通過(guò)定點(diǎn)突變幾輪PCR后，將引物突變引入天然序列?；厥盏玫酵蛔兊娜L(zhǎng)EPO，用BamHI酶消化，同時(shí)用BamHI酶消化真核表達(dá)載體PEC4，回收片段，用T4DNA連接酶連接BamHI酶切后的PCR產(chǎn)物和載體，室溫5分鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑選陽(yáng)性克隆，用酶消化方法鑒定克隆，并將正確的克隆測(cè)序，得到含突變克隆的載體PEC4EP0。圖3顯示了 EPO及其類似物表達(dá)產(chǎn)物的分子量情況。泳道I為重組人ΕΡ0，泳道2-4為含有一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的EPO類似物，泳道5為含有二個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的EPO類似物，泳道 6 為含三個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3°Ser87Asn88Gly89Ser9°]EP0，泳道 7 為突變體[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3°Ser87Asn88Gly89Ser9°Ala164]EP0。結(jié)果顯示，增加糖基化位點(diǎn)后，產(chǎn)物分子量都有所增加，并且分子量隨糖基化位點(diǎn)的增多而增大。從具有一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)[Asn2Gly3Thr4] EPO、[Asn3Phe4Ser5] EPO 和[Val2Asn3Phe4Ser5] EPO 來(lái)看，由于糖基化位點(diǎn)前一位氨基酸的不同，分子量增加有所不同，[Val2Asn3Phe4Ser5] EPO表達(dá)產(chǎn)物較[Asn2Gly3Thr4] EPO和[Asn3Phe4Ser5] EPO表達(dá)產(chǎn)物分子量大。突變體[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90Alal64] EPO 表達(dá)產(chǎn)物分子量與具有三個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3°Ser87Asn88Gly89Ser9°]EPO 類似物分子量一致，說(shuō)明非糖基化位點(diǎn)的突變表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有額外糖鏈合成，對(duì)其分子量沒(méi)有影響。圖4顯示了促紅細(xì)胞生成素類似物培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)物IEF免疫印跡分析結(jié)果。泳道8為重組人ΕΡ0，泳道1-3為含有一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的EPO類似物，泳道4-5為含有二個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的EPO類似物，泳道6為含三個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90] ΕΡ0,泳道 7 為突變體[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3c1Ser87Asn88Gly89Ser9c1Ala164]ΕΡ0。結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物酸性分子都有所增加，并且酸性分子隨糖基化位點(diǎn)的增多而增多。從具有一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)[Asn2Gly3Thr4] EPO、[Asn3Phe4Ser5] EPO 和[Val2Asn3Phe4Ser5] EPO 來(lái)看，由于糖基化位點(diǎn)的位置以及其位點(diǎn) 前一位的氨基酸的不同，酸性分子增加比重有所不同，[Val2Asn3Phe4Ser5] EPO 表達(dá)產(chǎn)物較[Asn2Gly3Thr4] EPO、[Asn3Phe4Ser5] EPO 表達(dá)產(chǎn)物酸性分子多。突變體[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90Ala164] EPO 表達(dá)產(chǎn)物與[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90]EPO 表達(dá)產(chǎn)物的酸性分子一致，說(shuō)明非糖基化位點(diǎn)突變表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有額外糖鏈合成，對(duì)其等電點(diǎn)沒(méi)有影響。圖5顯示了通過(guò)對(duì)含有不同額外N-糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物的高異構(gòu)體混合物的SDS電泳分析。說(shuō)明了增加糖基化位點(diǎn)后，產(chǎn)物的分子量增大。額外增加三個(gè)糖基化位點(diǎn)的類似物分子量大于額外增加二個(gè)糖基化位點(diǎn)，額外增加二個(gè)糖基化位點(diǎn)的類似物分子量高于額外增加一個(gè)糖基化位點(diǎn)，并且一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)[Val2Asn3Phe4Ser5]EPO產(chǎn)物分子量比同樣具有一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)[Asn2Gly3Thr4]EPO和[Asn3Phe4Ser5]EPO大。說(shuō)明糖基化位點(diǎn)的前一位氨基酸對(duì)其具有一定的影響。[Asn2Gly3Thr4Asn28ThrxiSer87Asn88Gly89Ser90]EPO 和[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90Ala164] EPO 分子量一致。說(shuō)明[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3°Ser87Asn88Gly89Ser9°Ala164]EP0 在非糖基化位點(diǎn)的突變沒(méi)有額外糖鏈合成，對(duì)其分子量沒(méi)有影響。圖6顯示了通過(guò)對(duì)含有不同額外N-糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物的高異構(gòu)體混合物的IEF電泳分析。說(shuō)明了增加糖基化位點(diǎn)后,產(chǎn)物的酸性帶增多。額外增加三個(gè)糖基化位點(diǎn)的類似物酸性碳水化合物多于額外增加二個(gè)糖基化位點(diǎn)，額外增加二個(gè)糖基化位點(diǎn)的類似物酸性碳水化合物多于額外增加一個(gè)糖基化位點(diǎn)，并且一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)[Val2Asn3Phe4Ser5]EPO產(chǎn)物酸性帶比同樣具有一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)[Asn2Gly3Thr4]EPO和[Asn3Phe4Ser5]EPO增多。說(shuō)明糖基化位點(diǎn)的前一位氨基酸對(duì)其具有一定的影響。[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90] EPO 和[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr30Ser87Asn88Gly89Ser90Ala164] EPO 酸性帶一致。說(shuō)明[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3c1Ser87Asn88Gly89Ser9c1Ala164]EPO 非糖基化位點(diǎn)突變表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有額外糖鏈合成，對(duì)其等電點(diǎn)沒(méi)有影響。圖7顯示不同突變點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物單劑量注射小鼠后，體內(nèi)網(wǎng)織紅細(xì)胞隨時(shí)間的變化。在此項(xiàng)研究中，將紅細(xì)胞生成素類似物的純化物，以5μ g/kg皮下注射給體重為20±2的雌性BALB/c小鼠，并以相同劑量的重組人紅細(xì)胞生成素為對(duì)照品，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。注射后每24小時(shí)采血，用網(wǎng)織紅細(xì)胞記數(shù)儀檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞含量，考察網(wǎng)織紅細(xì)胞含量隨時(shí)間變化情況。結(jié)果顯示，隨額外糖基化位點(diǎn)增加，促紅細(xì)胞生成素類似物在小鼠體內(nèi)的作用時(shí)間延長(zhǎng)，并且時(shí)間的延長(zhǎng)與糖基化位點(diǎn)的增多正相關(guān)，類似物在小鼠體內(nèi)的作用強(qiáng)度(以曲線下面積計(jì))增強(qiáng)。并且作用時(shí)間和強(qiáng)度受到糖基化位點(diǎn)前一位氨基酸的影響。圖8 分別顯不了用實(shí)施例 10 所述方法制備[Asn2Gly3Thr4Asn28ThrxiSer87Asn88Gly89Ser9°]EPO類似物異構(gòu)體并集液的IEF圖譜。泳道I為天然ΕΡ0，泳道2_5分別為異構(gòu)體1_5、2-6、3-6、4-8。結(jié)果顯示隨著異構(gòu)體并集液IEF中酸性條帶的增多，體內(nèi)活性增高。說(shuō)明額外的糖基化增加了分子中的酸性碳水化合物，這種分子結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致體內(nèi)活性升高。圖9顯示了紅細(xì)胞生成素和用實(shí)施例10所述方法制備

[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3ciSer87Asn88Gly89Ser9ci] EPO 異構(gòu)體 3-6 的混合物給小鼠注射后網(wǎng)織紅細(xì)胞隨時(shí)間的變化曲線。將促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體3-6混合物，以5 μ g/kg皮下注射給體重為20±2的雌性Balb/c小鼠，并以相同劑量的重組人紅細(xì)胞生成素為對(duì)照品，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。注射后每24小時(shí)采血，用網(wǎng)織紅細(xì)胞記數(shù)儀檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞含量，考察網(wǎng)織紅細(xì)胞含量隨時(shí)間變化情況。結(jié)果顯示，紅細(xì)胞生成素組于用藥后第二天RET%開(kāi)始升高，第4天達(dá)高峰，持續(xù)約4天；紅細(xì)胞生成素類似物組RET%也于第二天開(kāi)始升高，第6天達(dá)高峰，持續(xù)約7天。由此可見(jiàn)，與重組人紅細(xì)胞生成素相比異構(gòu)體3-6混合物在小鼠體內(nèi)的作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)，作用強(qiáng)度(以曲線下面積計(jì))增強(qiáng)。圖10 顯不了紅細(xì)胞生成素和[Asn2Gly3Thr4Asn28Thr3ciSer87Asn88Gly89Ser9ci] EPO異構(gòu)體3-6的混合物靜脈注射大鼠血藥濃度隨時(shí)間變化曲線，選雄性SD大鼠(SpragueDawley) 10 11周，體重300±20g，6只/組。靜脈注射1251標(biāo)記的促紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體3-6混合物，每只鼠I μ Ci125I標(biāo)記的促紅素或類似物異構(gòu)體，按照設(shè)定的時(shí)間間隔(5分鐘至10小時(shí))眼眶靜脈采血，收集血清。取0.1ml血清加入0.9ml冷無(wú)水乙醇(_20°C )，置4°C培養(yǎng)過(guò)夜，12000rpm離心15分鐘，用咖嗎檢測(cè)儀檢測(cè)，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與促紅細(xì)胞生成素相比，異構(gòu)體3-6混合物體內(nèi)清除速度明顯降低，導(dǎo)致體內(nèi)消除半衰期延長(zhǎng)，二者的靜脈注射大鼠后半衰期分別為8.5h和2.6h，促紅細(xì)胞生成素類似物的消除半衰期是促紅細(xì)胞生成素的3.3倍。圖11 和圖 12 是小鼠注射紅細(xì)胞生成素和[Asn2Gly3Thr4Asn28ThrxiSer87Asn88Gly89Ser90JEPO異構(gòu)體3_6的混合物后血細(xì)胞比容隨時(shí)間變化情況。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雌性BALB/c小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，8周齡，體重18 22g，按照隨機(jī)分組的原則分組，每組10只，采用不同劑量的促紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體3-6混合物，分別以每周一次和每周三次皮下注射給BALB/c，對(duì)照組注射相同體積的溶劑，連續(xù)4周。監(jiān)測(cè)血細(xì)胞比容的變化情況，2次/周，給藥當(dāng)天為第I天(Id)，分別于I周內(nèi)的第4天(4d)和7天(7d)用肝素化處理的毛細(xì)管取血，封口，采用離心法檢測(cè)血細(xì)胞比容。結(jié)果顯示，在每周一次和每周三次給藥后，異構(gòu)體3-6混合物對(duì)小鼠血細(xì)胞比容的升高作用明顯增強(qiáng)，提示臨床應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素類似物可以糾正貧血，每周一次注射，可達(dá)到預(yù)期的治療效果。
具體實(shí)施例方式通過(guò)下列實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不應(yīng)誤認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所用的促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)物是重組人紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)物，該標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所，用于測(cè)定體內(nèi)生物活性。實(shí)施例1:人促紅細(xì)胞生成素類似物DNA片段的構(gòu)建人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列中共有3個(gè)天然N-糖基化位點(diǎn)，分別位于24、38和83位，促使紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生額外糖基化位點(diǎn)的位置可以是2、3、4、28、30、88(見(jiàn)圖1)。對(duì)以上位點(diǎn)進(jìn)行突變組之間的組合，如構(gòu)建[Asn2Gly3Thr4]、[Asn28Thr30]、[Asn88Gly89Ser90]的組合，加入2、28、88三個(gè)位置的N-糖基化位點(diǎn)，并通過(guò)改變中間一位或糖基化位點(diǎn)前一位的氨基酸序列增強(qiáng)該位置的糖基化。額外添加N-糖基化位點(diǎn)突變部分的引物參見(jiàn)SEQ ID N0S:2_85。利用這些引物，以促紅細(xì)胞生成素DNA為模板進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)即可獲得突變后的促紅細(xì)胞生成素類似物DNA片段。模板DNA來(lái)源于天然EPO cDNA文庫(kù)。文庫(kù)的構(gòu)建簡(jiǎn)述如下，利用Trizol從胎肝組織中提取總 RNA，應(yīng)用 Oligo (dT) Cellulose (Cat.N0.15940-026，Lifetechnologies, USA)，按廠家提供的方法，提取PolyA+RNA,之后應(yīng)用cDNA合成試劑盒(ZAP-cDNA Synthesis Kit, Cat.N0.200400-200402, Stratagene, USA)合成人胎肝雙鏈 cDNA，根據(jù) USPat.4703008設(shè)計(jì)引物從上述cDNA文庫(kù)中釣取天然促紅細(xì)胞生成素DNA片段。以上述EPO DNA片段為模板，設(shè)計(jì)SEQ ID NOS:86-93的引物:3 ’ 端:2-4 位由 PPR 改為 NST引物1:SEQ ID N0:865’端2-4位引物引物2:SEQ ID N0:873 ’ 端 30-32 位由 AHl 改為 NRS引物3:SEQ ID N0:885’ 端 30-32 位引物引物4:SEQ ID N0:893’ 端 87-90 位由 PWEP 改為 VNIS引物5:SEQ ID N0:905’ 端 87-90 位引物 引物6:SEQ ID N0:91
設(shè)計(jì)EPO兩端引物用于PCR5 ’ 端加 BamHI 位點(diǎn)，及 GCCACC引物7:SEQ ID N0:923 ’端引物，加BamHI位點(diǎn)引物8:SEQ ID N0:93用SEQ ID N0:86+92、87+88、89+90、91+93進(jìn)行第一輪PCR(PCR儀為 ABI2700，試劑為 Invitrogen 公司的 Supermix )，條件為 95°C 5min, (95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s) X 30循環(huán)，72°C 7min。所得的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用制造廠家(Omiga公司)提供的eZNA 凝膠回收試劑盒及方法回收片段。再分別以SEQ ID NO: 86+92與87+88、89+90、91+93為模板，SEQ ID NO: 88+92、89+93為引物，進(jìn)行第二輪PCR，條件同前，回收片段。接著以 SEQ ID N0:92+88 和 SEQ ID NO:89+93 為模板，SEQ ID N0:92+93 為引物，用相同的 PCR條件得到突變的全長(zhǎng)ΕΡ0?；厥掌?，用BamHI (Invitrogen)酶消化，同時(shí)用BamHI酶消化真核表達(dá)載體PEC4，回收片段，用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接BamHI酶切后的PCR產(chǎn)物和載體，室溫5分鐘， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑選陽(yáng)性克隆，用酶消化方法鑒定克隆，并將正確的克隆測(cè)序，得到含突變克隆的載體PEC4EP0。表達(dá)載體pEC4是將小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因片段導(dǎo)入pcDNA3.1(Invitrogen)形成的，小鼠DHFR基因片段是依據(jù)Genebank Nucleotide AH001899公布的序列合成的。上述方法概述于圖2。用上述方法構(gòu)建促紅細(xì)胞生成素類似物。表I中給出了部分類似物的DNA序列變化，否則就是用于突變的寡核苷酸引物的序列與人促紅細(xì)胞生成素的序列互補(bǔ)。表1:部分具有N-糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物
權(quán)利要求
1.一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物包括I個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)，其中在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的第3位置換上了天冬酰胺，第4位置換上了苯丙氨酸，第5位置換上了絲氨酸；即[Asn3Phe4Ser5JEPO ;所述的額外N-糖基化位點(diǎn)是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。
2.一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物包括I個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)，其中在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的第2位置換上了纈氨酸，第3位置換上了天冬酰胺，第4位置換上了苯丙氨酸，第5位置換上了絲氨酸；SP[Val2Asn3Phe4Ser5IEPO ;所述的額外N-糖基化位點(diǎn)是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。
3.—種DNA序列，該DNA序列編碼權(quán)利要求1_2任一項(xiàng)的人促紅細(xì)胞生成素類似物。
4.一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求3的DNA序列。
5.一種真核宿主細(xì)胞,該宿主細(xì)胞用權(quán)利要求4的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
6.權(quán)利要求5的真核宿主細(xì)胞，其選自CHO，C0S-7或BHK。
7.一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物的生產(chǎn)方法，包括步驟: (i)培養(yǎng)權(quán)利要求5或6的真核宿主細(xì)胞，和 ( )從培養(yǎng)物中收集具有紅細(xì)胞生成素活性的糖蛋白。
8.一種增加紅細(xì)胞生成的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的人促紅細(xì)胞生成素類似物以及可藥用的稀釋劑、助劑或載體。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其用于促進(jìn)紅細(xì)胞生成，預(yù)防或治療貧血。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體。本發(fā)明還涉及編碼該促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體的DNA序列，以及供該類似物或其變體表達(dá)的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P7/06GK103113464SQ20131001661
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2007年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日
發(fā)明者婁競(jìng), 耿建玲, 張 杰, 侯緒鳳, 趙會(huì)林, 陸軍, 蘇冬梅, 胡金東 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司